罌粟生物堿合成關鍵酶STORR的基因克隆及其表達載體構建

摘" 要：為研究罌粟生物堿合成關鍵酶（STORR）在罌粟中的作用，該研究以罌粟葉片cDNA為模板，利用RT-PCR技術，克隆得到STORR基因，并對其序列進行測序分析，利用雙酶切方法構建pCambia2301-KY表達載體。研究結果表明，成功克隆到STORR基因，通過生物信息學分析，該基因包含一個長度為2 703 bp的完整開放閱讀框，編碼900個氨基酸，分子式為C4476H7097N1207O1328S46，理論分子質量為10.05 kD，理論等電點為6.45，不穩定指數為41.70，為不穩定蛋白。用KpnI酶切載體pCambia2301-KY線性化，與回收純化產物進行重組反應，成功構建STORR基因表達載體，將表達載體成功轉化農桿菌GV3101。該研究為后續進行STORR基因功能研究提供理論依據。

關鍵詞：罌粟；STORR基因；基因克隆；過表達載體；生物堿

中圖分類號：S567.21+2" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2096-9902（2023）15-0073-04

Abstract： In order to study the role of key enzyme of alkaloid biosynthesis （STORR） in opium poppy （also known as Papaver somniferum L.）， STORR gene was cloned from cDNA of opium poppy leaves by RT-PCR technique， and its sequence was sequenced. pCambia2301-KY expression vector was constructed by double enzyme digestion. The results showed that the STORR gene was successfully cloned. Bioinformatics analysis showed that the gene contained a complete open reading frame of 2 703 bp， encoding 900amino acids， the molecular formula was C4476H7097N1207O1328S46， the theoretical molecular weight was 10.05 kD， the theoretical isoelectric point was 6.45and the instability index was 41.70. It was an unstable protein. The expression vector of STORR gene was successfully constructed by linearizing the vector pCambia2301-KY with KpnI enzyme and reacting with the purified product. The expression vector was successfully transformed into Agrobacterium tumefaciens GV3101. This study provides a theoretical basis for the follow-up study of STORR gene function.

Keywords： opium poppy; STORR gene; gene cloning; overexpression vector; alkaloid

嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿等生物堿是罌粟特有的次生代謝產物，臨床上常用于麻醉、鎮痛、止咳等，極具醫用價值。2018年，葉凱團隊完成了罌粟全基因組測序，利用高質量基因組破譯罌粟中合成次生代謝產物的途徑[1]，對研究罌粟生物堿合成具有重要意義，在對罌粟基因組分析過程中發現STORR基因對罌粟中生物堿合成至關重要。罌粟中生物堿合成分支路徑（圖1）表明[2]，細胞色素P450單加氧酶和醛-酮還原酶的融合蛋白（STORR）是嗎啡、可待因等生物堿合成代謝途徑的關鍵蛋白，調控相應的STORR基因表達，可引起嗎啡、可待因和蒂巴因含量發生變化。目前，對STORR基因的研究基于研究芐基異喹啉類生物堿（BIAs）模型系統[3]，Li等[4]在研究罌粟BIAs代謝途徑過程中發現，STORR蛋白P450與僅相距865 bp的氧化還原酶模塊最為相似，以此假設了STORR基因的融合事件發生時間，進而提出了嗎啡合成途徑的出現時間節點。Yang等[5]通過研究罌粟全基因組重復，BIAs代謝途徑及嗎啡合成通路中的6-O-去甲基化酶（T6ODM）、可待因3-O-去甲基化酶（CODM）和可待因酮還原酶（COR）3個關鍵酶的重復、基因組位置和序列一致性，以及BIA基因簇的全基因組重復事件，進一步證實了STORR基因融合在罌粟生物堿合成中的關鍵作用。Catania等[6]研究表明，STORR基因參與罌粟生物堿的合成，與其余參與生物堿合成的基因共同構成了罌粟中的BIAs，通過分子手段對罌粟中STORR基因融合的進化史進行研究，證實了STORR基因是罌粟中BIAs代謝的關鍵基因。目前，對于罌粟的BIAs代謝進行了大量研究，嗎啡合成分支的多數基因均已得到鑒定，郝丹丹通過SNP檢測分析，得到了STORR基因染色體位置及其SNP位點。本研究擬通過對STORR基因克隆及表達載體構建，為后續研究罌粟中STORR基因的相關功能及罌粟生物堿高效合成提供技術支撐。

1" 材料和方法

1.1" 試驗材料

本試驗供試材料為罌粟葉片。

1.2" 試驗方法

1.2.1" STORR基因克隆

提取葉片組織中的RNA，利用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存。根據NCBI數據庫中提供的STORR基因信息（登陸號：LOC113322712），設計擴增引物STORR-F：5’-ATGGAGCTCCAATATATTTCTTATTTTC-3’，STOR R-R：5’-TCAAGCTTCATCATCCCAC-3’，引物由上海進潮科技發展有限公司合成。以cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為2×Phanta Max Buffer 25 μl，dNTP Mix（10 mM each） 1μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease（1 U/μl） 1μl，cDNA 2 μl，引物（10 μM）各2 μl，ddH2O 17 μl，共50 μl；反應程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，退火溫度45～55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 1 min" 39個循環；72 ℃，5 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，獲得大小合適的目標條帶。

1.2.2" STORR基因過表達載體構建

用KpnI酶切載體pCambia2301-KY線性化，將回收后的PCR產物與酶切產物進行重組反應，重組產物轉化大腸桿菌DH5α細胞，進行陽性檢測，挑取陽性轉化子搖菌培養提取質粒，同時將擴增產物進行測序。擴增和測序引物為插入目的基因兩側的載體序列，分別為35S-F：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’，2301-F：5’-GCTTCCGGCTCGTATGTTG-3’。

2" 結果與分析

2.1" STORR基因克隆及序列分析

以罌粟葉片cDNA為模板進行PCR擴增，純化回收目的基因條帶后連接T載體轉化大腸桿菌進行菌液PCR，得到一條2 700 bp左右的片段（圖2），篩選陽性克隆，進行測序，結果顯示目的基因片段長2 703 bp。

利用NCBI ORF finder對罌粟葉片測序的STORR基因堿基序列的開放閱讀框，結果表明，該基因堿基序列含有一個長度為2 703 bp的完整開放閱讀框，編碼900個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。

2.2" STORR基因編碼蛋白質生物信息學分析

利用ProtParam在線軟件預測STORR基因編碼蛋白的理化性質，結果顯示，STORR蛋白由20種氨基酸組成，含有酸性氨基酸（D、E）102個、堿性氨基酸（K、R）98個，分子式為C₄₄₇₆H₇₀₉₇N₁₂₀₇O₁₃₂₈S₄₆，預測分子質量為10.05 kDa，理論等電點（pI）為6.45，不穩定指數為41.70，是不穩定蛋白（穩定系數大于40，為不穩定蛋白質），脂肪指數為90.86，平均親水性值（Grand average of hydropathicity）為-0.150，說明STORR蛋白是親水性蛋白。

利用Protscal在線軟件對STORR蛋白疏水性進行分析，結果表明，STORR蛋白疏水性最大值為3.489，親水性最大值為-3.544（圖3（a））。分析STORR蛋白氨基酸N-端信號序列，結果顯示該蛋白無信號肽（圖3（b））。分析STORR蛋白氨基酸跨膜結構，結果顯示含1個跨膜區段（圖3（c））。預測STORR蛋白質二級結構、三級結構（圖3（d）、3（e）），結果表明，該蛋白含46.78%α-螺旋（Alpha helix）、15.33%延伸鏈（Extended strand）、4.89% β-轉角及33%無規則卷曲（Random coil）。利用CD-search預測STORR蛋白保守結構域（圖3（f）），結果顯示，該基因編碼的蛋白含有CYP結構域和AKR結構域。

2.3" STORR基因pCambia2301-KY過表達載體構建

將已構建的目的基因表達載體經菌落PCR后（圖4），挑取7號陽性克隆由上海進潮科技發展有限公司進行測序，測序結果表明，STORR基因片段與NCBI中基因序列基本一致，其中1 846 bp處堿基由T變為C。表明目的基因已插入載體，STORR基因過表達載體構建準確（圖5）。

3" 討論

STORR基因是罌粟生物堿合成的關鍵基因，也是罌粟BIAs代謝的關鍵途徑，研究STORR基因的相關功能，是研究罌粟生物堿高效生物合成的基礎。本研究基于前期研究基礎，利用NCBI數據庫提供的基因序列，通過RT-PCR技術克隆到罌粟嗎啡合成關鍵基因STORR基因。STORR基因為罌粟獨有的基因，通過進一步比對，該基因含2 073 bp完整開放閱讀框，編碼900個氨基酸，包含CYP和AKR兩個保守結構域，具有高度保守性。基于前期研究，本研究利用雙酶切方法構建STORR基因過表達載體，并成功轉化農桿菌GV3101，為進一步研究STORR基因功能，解析罌粟中生物堿合成提供技術支撐。

參考文獻：

[1] RAI A， YAMAZAKI M， SAITO K. A new era in plant functional genomics[J]. Current Opinion in Systems Biology， 2019，15：58-67.

[2] GUO L， WINZER T， YANG X， et al. The opium poppy genome and morphinan production[J]. Science （New York， N.Y.），2018，362：343-347.

[3] 郝丹丹.罌粟中嗎啡合成關鍵酶CODM和STORR的基因克隆與功能研究[D].晉中：山西中醫藥大學，2020.

[4] LI Y， WINZER T ， HE Z， et al. Over 100 Million Years of Enzyme Evolution Underpinning the Production of Morphine in the Papaveraceae Family of Flowering Plants[J]. 植物通訊（英文）， 2020，1（2）：16.

[5] YANG X F， GAO S H， GUO L， et al. Three chromosome-scale Papaver genomes reveal punctuated patchwork evolution of the morphinan and noscapine biosynthesis pathway[J]. NATURE COMMUNICATIONS， 2021，12（1）：6030.

[6] CATANIA T， LI Y， WINZER T， et al. A functionally conserved STORR gene fusion in Papaver species that diverged 16.8 million years ago[J]. NATURE COMMUNICATIONS， 2022，13（1）：3150.