基于DE-3D U-Net的斑馬魚后腦血管共聚焦顯微圖像分割和量化測量

摘 要：斑馬魚后腦部位的脈絡叢控制著大腦和血管之間的物質交換，脈絡叢周圍的血管異常可引發相關的腦血管疾病。本文首先對斑馬魚后腦部位的主要血管進行了連續成像，使用共聚焦顯微鏡拍攝正常情況和柱孢藻毒素處理后的斑馬魚胚胎，獲得了斑馬魚在受精后43～63 h的系列三維圖像。然后，進一步開發了圖像分割的神經網絡DE-3D U-Net 用于主要后腦血管的分割。網絡分割結果顯示，3根主要血管的類別像素準確率分別為86.67%、93.18%和83.74%。最后，繪制了斑馬魚后腦血管發育曲線圖。結果表明，3根主要的血管半徑在高濃度的柱孢藻毒素處理后出現了18%左右的縮減，中腦靜脈夾角出現了30°～50°的縮減。此研究提出了一個可用于斑馬魚后腦血管分割的神經網絡模型，得出的數據可為斑馬魚脈絡叢發育研究提供基礎。

關鍵詞：斑馬魚；后腦血管；共聚焦顯微成像；3D U-Net神經網絡；柱孢藻毒素

中圖分類號：TP391" " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.03.003

Segmentation and Quantification of Zebrafish Hindbrain Vessel Confocal Images Based on DE-3D U-Net

ZHENG Wenhu1， LI Hui2*， CHEN Chong2， WANG Linbo2

（1. School of Biomedical Engineering， Division of Life Sciences and Medicine， University of Science and Technology of China， Hefei 230026， China; 2. Jiangsu Key Laboratory of Medical Optics， Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology， Chinese Academy of Sciences， Suzhou 215163， China）

Abstract： The choroid plexues in the zebrafish hindbrain controls the exchange of substances between brain and its vessels， and the vascular abnormalities around the choroid plexues can lead to associated cerebrovascular diseases. We first performed serial imaging of the major blood vessels in the hindbrain region of zebrafish， and obtained a series of images of zebrafish between 43 hours and 63 hours after fertilization using confocal microscopy to photograph embryos under normal conditions and after cylindrospermopsin treatment. Afterwards， the DE-3D U-Net was developed for the segmentation of the hindbrain images. The segmentation results showed that the class pixel accuracy of DE-3D U-Net could reach to 86.67%， 93.18% and 83.74% for the three main vessels and the segmentation results were used to plot vascularization curves. The quantitative results showed that the radii of the three vessels showed a reduction of 18% after treatment with high concentrations of cylindrospermopsin， and the angle of the mesencephalic vein showed a reduction of 30° to 50°. This study proposed a neural network for segmentation of hindbrain vessels of zebrafish， and it provided a basis for research on the development of zebrafish choroid plexsus.

Key words： zebrafish; hindbrain vessels; confocal microscopy; 3D U-Net deep-learning network; cylindrospermopsin

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（3）： 209-216）

血腦屏障（blood brain barrier，BBB）和脈絡叢（choroid plexus，CP）控制大腦中的離子和營養物質交換，保護腦組織免受血液中有害物質的侵擾［1-4］。CP在運輸生理活性物質方面起著關鍵作用。研究后腦部位CP周圍血管的形成過程有助于理解這些血管異常引發的腦部疾病［5］。背側縱靜脈（dorsal longitudinal vein，DLV）是和CP進行物質交換的主要血管，負責將血液輸送到髓質CP［6-10］。DLV血管與后腦靜脈血管（posterior caudal cerebral vein，PCeV）和中腦靜脈血管（mesencephalic vein，MsV）相連。這些血管的結構量化可作為后腦血管發育狀態定量表征的主要參數。

斑馬魚（Barchydanio rerio var）是研究腦發育及腦疾病的一種重要的微小模式動物，已被廣泛用于遺傳發育和藥物篩選研究。在斑馬魚發育的早期階段，CP由覆蓋后腦室的厚細胞層組成。在發育成型3 h后，它將轉變為位于胚胎頭部中央的小型細胞團。共聚焦顯微鏡擁有著強大的三維層切能力［11］，可實現保持斑馬魚生理狀態下的后腦血管三維成像。

斑馬魚的腦部血管系統非常復雜，在其生長發育的不同時刻血管之間會相互轉化。為了識別特定的血管結構需要較多的先驗知識。Garcia-Lecea等［12］ 結合了體內成像、組織學和突變分析的知識，觀測并記錄了標記過的增強子陷阱轉基因系SqET33-E20（Gateways）斑馬魚的第四腦室中CP的形成過程。為了說明斑馬魚后腦中CP的保守性，Van Leeuwen等［13］標記了斑馬魚claudin 5a基因，并證明斑馬魚直系同源物在BBB和CP屏障中表達了高度的相似性。Daewyler等［14］提出了一種使用機器學習分割斑馬魚腦血管系統的方法（dual-ResUNet）。這些研究表明，斑馬魚后腦血管和CP組織的發育息息相關，并且深度學習圖像處理技術在斑馬魚后腦血管分割中有強大的應用潛力。

研究表明，柱孢藻毒素（cylindrosperopsin，CYN）通過加速血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）的凋亡而導致PCeV、MsV和DLV產生畸變［15-16］。同時CYN也在人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中存在毒性作用。CYN會導致斑馬魚的血管畸形并降低血管的豐富度［17］。記錄CYN處理條件下斑馬魚后腦血管的畸變情況對CP研究具有重要參考意義。

本文采用共聚焦顯微鏡拍攝了正常培養條件下和暴露于不同濃度CYN溶液下的斑馬魚胚胎的后腦血管三維圖像。為了高效處理斑馬魚后腦血管三維圖像數據，試驗開發了針對DLV、PCeV和MsV這3根主要血管的自動化圖像分割模型， 在醫學圖像處理的3D U-Net模型基礎上，加入了稠密連接模塊和輕量化通道注意力機制，提出了DE-3D U-Net模型來自動分割斑馬魚后腦血管。試驗中斑馬魚經過CYN處理后腦部血管會發生畸變，使用論文中提出的網絡處理發生畸變的血管圖像可以驗證網絡的魯棒性；通過對比CYN處理組和對照組斑馬魚的血管圖像可以研究CYN對斑馬魚腦部血管發育的影響［20-23］，同時測量了不同后腦血管的生長曲線和MsV的夾角變化。結果表明，試驗中提出的神經網絡模型可以準確分割斑馬魚的3根后腦血管，同時CYN處理會使得斑馬魚后腦血管發生明顯的畸變現象。

1 材料與方法

1.1 試劑

CYN購自Pribolab（中國青島）。在試驗中首先用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）將CYN稀釋到4 mmol/L，制作體積分數為0.01%的DMSO儲備溶液。PTU（1-phenyl-2-thiourea）從Sigma Aldrich（美國密蘇里州圣路易斯）獲得。

1.2 斑馬魚胚胎的培育和生長環境

轉基因斑馬魚Tg（flk-1：EGFP）胚胎培養溫度約為28.5℃，采取14 h光照/10 h黑暗光周期。收集受精后2 h（2 hours post fertilization，2 hpf）的胚胎進行試驗。每次試驗時，采用6孔板盛放預先收集的150個健康斑馬魚胚胎，每個孔中隨機存放25個胚胎。在藥物處理試驗中，在24 hpf時每個孔中注入5 mL CYN溶液（濃度分別為0.4、0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL）。斑馬魚的制備過程經中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所動物倫理委員會批準。

1.3 斑馬魚后腦血管成像過程

將待成像的斑馬魚胚胎在室溫下浸入含有0.03% tricaine的純水中1 min，直到斑馬魚完全麻醉。準備質量分數為0.8%的低熔點瓊脂糖5 mL，放入水浴鍋中加熱直到溶解，在室溫下冷卻，接著把麻醉的斑馬魚放入未凝結的瓊脂糖中，使用透明的玻璃管把斑馬魚吸入直至瓊脂糖凝固。最后，把凝固后的斑馬魚從玻璃棒中推出放置在共聚焦小皿上（共聚焦激光穿透力有限，固定在凝膠中方便調整斑馬魚的位置以便激光可以照亮斑馬魚后腦區域）。使用共聚焦激光掃描顯微鏡（TCS SP5，Leica，Germany）拍攝斑馬魚腦部血管圖像［24-27］：掃描方式使用xyz三維掃描，激發波長為488 nm，掃描速度為400 Hz，圖像分辨率為512×512，其中每個像素點的實際大小為1.52 μm×1.52 μm，視場大小為778.24 μm×778.24 μm，z軸的層切厚度為1.98 μm，對準位置后掃描128層，成像總厚度為253.44 μm。

1.4 DE-3D U-Net網絡結構

針對拍攝到的大量三維圖像，本研究提出了一個DE-3D U-Net模型以實現斑馬魚后腦血管的自動分割。如圖1所示，網絡的基礎結構為編碼器-解碼器結構。網絡左半部分為編碼器，右半部分為解碼器。原生圖像首先在編碼器中進行特征融合，編碼器中每一個卷積層后都增加了一個殘差模塊，這樣可以最大程度上保留圖像的原始信息。經過處理后的圖像被傳入解碼器模塊，解碼器模塊中每一個卷積層后都增加了輕量化通道注意力模塊。注意力模塊會把每一個卷積層輸入的圖像先拉伸成一個向量，之后將得到的向量和輸入的原始圖像相乘，這種做法的目的是讓輸入的圖像來自行決定特征的權重。對于連接編碼器和解碼器的跳層部分，則使用了稠密連接網絡結構取代原始的簡單跳層連接。

圖1c顯示了每個卷積模塊的主要結構。每個卷積模塊有兩個相同的卷積層。輸入圖像在經歷了雙卷積之后會經過批量歸一化層。為了防止梯度消失并加速網絡收斂，在每一層的最后均設置了線性校正單元層。

斑馬魚后腦血管的三維圖像不僅僅只有連續圖像之間有著空間信息。對于同一張圖像的不同通道包含著的特征信息，如果可以加以利用將有利于后續的圖像分割。在解碼器的上采樣區域，圖像經過雙卷積之后還有一個高效的輕量化通道注意力模塊（efficient channel attention for deep convolutional neural networks，ECA Net）。它由一個平均池化層、一個1×1卷積塊和一個sigmoid函數層組成，用于解決梯度消失和網絡退化問題。在U-Net中，解碼器和編碼器使用跳層進行連接。本研究使用了稠密連接塊來代替傳統的跳層連接。稠密連接塊由兩個相同的模塊組成。每個卷積層有兩個不同的卷積模塊：第1個模塊由批量歸一化層、校正線性單元層和1×1×1的3D卷積塊組成；第2個模塊由批量歸一化層、校正線性單元層和3×3×3的卷積塊組成。跳躍連接用于連接解碼器和編碼器的特征圖，以確保解碼器可以在上采樣期間保留高級特征圖中包含的高分辨率細節，提高圖像的分割精度。

1.5 神經網絡訓練

在DE-3D U-Net的網絡訓練中，隨機選取25組斑馬魚后腦三維圖像用于驗證，而剩余的75組用于訓練。訓練過程中選擇了Adam自適應學習率優化器用于降低網絡訓練過程中的損失函數。為了加快訓練過程，將初始學習率與指數衰減學習率相結合，每1 500次迭代更新一次。

使用1臺64位Windows10系統的計算機進行運算。計算機裝配了4個帶有CUDA11.5的NVIDIA GeForce Tesla V100 GPU來加速整個訓練過程。該軟件基于Python的Pytorch體系結構，使用的開發環境為Pycharm。神經網絡需要32 h來完成訓練（批量大小為4，迭代1 500個循環）。

1.6 定量分析方法

把經過神經網絡之后得到的分割結果輸入圖像分析軟件ImageJ中。使用Image Properties設置像素實際大小（1.52 μm×1.52 μm）和層切厚度（1.98 μm）。使用圖像工具中的Filaments設置血管測量的起始節點和終結節點。設置完之后由ImageJ軟件自帶的功能生成連接路徑，路徑生成完成確認無誤之后，軟件會自動測量相關數據，之后可以導出軟件對于血管的分析測量數據（包括長度、體積、表面積等）。

2 結果與分析

2.1 三維斑馬魚后腦血管分割

斑馬魚的大部分后腦血管半徑為4.00～10.00 μm，其中MsV的半徑為5.00～6.35 μm，DLV為8.70～10.50 μm，PCeV為8.10～9.50 μm。精準地分割MsV的分叉結構和PCeV的脈絡膜血管回路是一項重大挑戰。

斑馬魚后腦血管的3D圖像及分割結果如圖2所示。3根血管（MsV、DLV和PCeV）都可以從淋巴細胞和其他血管中被完整分割出來。DE-3D U-Net對后腦血管缺損的圖像的分割結果顯示出了其優秀的性能。本試驗使用的斑馬魚樣本只有血管壁被染色，這種情況下圖像中的血管薄厚不均（在同樣強度的激光照射下可能某些部位會出現過曝現象），并且部分血管會發生斷裂。這種現象在MsV中尤為明顯，但是，分割結果中DE-3D U-Net分割出的MsV與手動注釋的真實模型一致。

CYN處理過后的斑馬魚腦血管分割結果如圖2c、2d所示。在圖2c、2d中，0.4～1.6 nmol/mL CYN處理后的斑馬魚腦中的 MsV、DLV和PCeV的主體結構均可以被神經網絡模型完整的分割開來。DE-3D U-Net對CYN處理后的畸變或者缺失的斑馬魚血管依然有效。DE-3D U-Net分割出的MsV（藍色）、DLV（紫色）和PCeV（紅色）與斑馬魚后腦血管的原始3D體積幾乎完全重合。MsV的分叉和PCeV的脈絡膜血管回路，也可以通過圖中的DE-3D U-Net完整分割。PCeV產生的缺陷如圖2d所示，DE-3D U-Net可以從淋巴細胞中挖掘出PCeV的完整結構。

綜上，針對MsV、DLV和PCeV存在缺陷的情況，DE-3D U-Net的分割結果和在正常圖像上的表現并無不同。在圖2c中腦血管的交界處，可以看到DE-3D U-Net完全分離了PCeV和DLV，并且由于跳躍連接中的稠密連接塊，DE-3D U-Net可以準確地處理最初始的高級語義信息。此外，從DE-3D U-Net結果中捕捉了完整的PCeV的分叉和脈絡膜血管的回路信息。上述所有要點都顯示了試驗中的DE-3D U-Net對斑馬魚后腦血管特征的有效性。

進一步采用定量指標來評估DE-3D U-Net分割的準確性。DLV、MsV和PCeV的語義分割效果可以使用類別平均像素準確率（mean pixel accuracy，MPA）、類別像素準確率（class pixel accuray，CPA）和平均交并比（mean intersection over union，MioU）來衡量。從對照組和CYN處理組中收集了成像效果良好的30組斑馬魚胚胎的腦部血管圖像，然后通過DE-3D U-Net進行語義分割。CPA為預測分割出的正確像素數量和總的像素數量之比，是評價神經網絡圖像分割性能的常用指標。得益于神經網絡中添加的通道自注意力模塊，DE-3D U-Net對DLV、MsV和PCeV 這3根血管的CPA可以分別達到86.67%、93.18%和83.74%。試驗中提出的神經網絡實現了對后腦血管的高精度分割，這是進行后續定量測量的重要基礎（圖3）。

2.2 后腦血管發育過程測量

斑馬魚后腦血管的發育數據可用于推斷腦血管疾病機制和CYN處理的影響。后腦血管發育的研究需要同時觀測3根血管的生長過程。使用共聚焦顯微鏡對斑馬魚后腦43～63 hpf進行連續成像。使用訓練好的DE-3D U-Net對斑馬魚后腦的MsV、PCeV和DLV進行圖像分割，基于分割結果來計算這些血管的長度、體積和角度等參數。

對照組中的正常斑馬魚的血管大部分都是完整的（圖2a），而在CYN處理過后的斑馬魚中，出現了明顯的后腦血管畸變現象，試驗中分割出的大多數后腦血管都存在著一定程度上的結構變化（圖2b～2d）。斑馬魚后腦血管在較高濃度的CYN處理組中發生了缺失現象。在CYN處理組中，PCeV和MsV受到的影響較大，出現的發育畸形的情況較為顯著。通過圖2b～2d可以發現，在CYN處理組中PCeV的脈絡膜血管回路萎縮，MsV的分叉斷裂。由以上的結果可以得出，CYN處理對斑馬魚的后腦血管有比較強烈的血管毒性。

在0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL處理組中總計有40只斑馬魚。對比圖4a～4c和圖4d～4e可以發現，相對于血管長度的縮短幅度，CYN對于MsV的影響主要體現在血管半徑的萎縮上，這種現象在CYN濃度到達0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL時體現的更為明顯。在0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL處理組中， 60 hpf時MsV血管寬度平均值分別為4.14 μm和4.01 μm，相比于對照組的5.20 μm收縮了約20.0%。在 60 hpf時0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL處理組中PCeV的寬度平均值為7.02 μm和6.94 μm，相比于對照組的8.30 μm收縮了約16.3%。60 hpf時0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL處理組中，3種血管中最粗的DLV的寬度平均值為8.23 μm和8.12 μm，相比于對照組的9.80 μm收縮了約18.0%。

圖5a顯示了具有PCeV脈絡膜血管回路萎縮缺陷的魚所占的百分比，而圖5b顯示了存在血管缺陷的魚所占的百分比。值得注意的是，血管缺損僅發生在0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL CYN的試驗組中。0.8 nmol/mL組17.5%的斑馬魚產生了PCeV脈絡膜血管回路的萎縮現象，而1.6 nmol/mL組中30.0%的斑馬魚出現了這種現象。

圖6展示了每組采集的40只斑馬魚的MsV的兩個分支之間的夾角。高濃度CYN處理下MsV兩個分路之間出現了收縮現象。對照組的斑馬魚MsV的夾角的中位數在127.4°，0.4 nmol/mL處理組夾角收縮的情況相對緩和，中位數為123.5°，0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL處理組MsV夾角的收縮較為明顯，中位數分別為93.1°和72.8°。0.8 nmol/mL和1.6 nmol/mL處理組中MsV夾角的最小值下探的程度更大，分別為55.7°和58.9°。在3個CYN處理組別中，僅僅最高濃度處理下的斑馬魚出現了MsV 夾角最大值的明顯下降，下降至120.1°，低于對照組的中位數。結合上述這些結果表明，CYN在斑馬魚胚胎中引起的血管毒性主要表現在MsV和PCeV中，并且PCeV受到的影響比DLV和MsV更大。

3 討論

后腦血管對于斑馬魚血管系統發育至關重要。本文旨在實現斑馬魚MsV、PCeV和DLV 3根主要后腦血管的3D成像和精確分割，開發了一種基于編碼器-解碼器結構的DE-3D U-Net網絡，用于從共聚焦激光掃描顯微鏡圖像中提取斑馬魚后腦血管，訓練后的網絡分割MsV、PCeV和DLV的CPA可達86.67%、93.18%和83.74%。對生長發育過程中的斑馬魚和CYN處理的斑馬魚進行了成像，并對其中的MsV、PCeV和DLV進行了分割和定量分析，測量了后腦中血管的體積、長度和MsV的角度。結果表明：MsV、PCeV和DLV的血管半徑在高濃度的CYN處理后分別出現了20.0%、16.3%、18.0%左右的縮減；另外，在高濃度處理下的MsV 2根分支脈管的夾角同樣收縮明顯，約有30°～50°的縮減。本試驗將推進對后腦血管形成過程的定量研究，并將有助于確定腦血管疾病的誘因和CYN對斑馬魚的影響。

本文提出的采用DE-3D U-Net進行斑馬魚后腦血管結構分割和分析的方法，數據集的標注繁瑣耗時，一組三維圖像的正確標注預計要耗費5～6 h，還可以進一步拓展優化，可考慮使用半監督或者無監督的學習方法減少三維圖像標注的時間。另外，本文提出的DE-3D U-Net神經網絡目前只針對幾種主要的后腦血管，今后將進一步拓展到全腦其他血管，最終實現構筑斑馬魚全腦血管圖譜。

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