阿奇霉素對脂多糖誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用及機(jī)制研究

摘 要：為了探究阿奇霉素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞增殖、凋亡及Janus激酶2（JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄啟動因子3（STAT3）通路的調(diào)控作用，體外培養(yǎng)人肺泡上皮細(xì)胞A549，分為空白組（不做干預(yù)）、LPS組（10 μg/mL LPS處理24 h）、低/中/高濃度試驗(yàn)組（10 μg/mL LPS+1、2、4 μg/mL阿奇霉素）、阿奇霉素組（10 μg/mL LPS+4 μg/mL阿奇霉素）、抑制劑組（10 μg/mL LPS+50 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制劑AG490）、阿奇霉素+抑制劑組（10 μg/mL LPS+4 μg/mL阿奇霉素+50 μmol/L AG490）、阿奇霉素+激活劑組（10 μg/mL LPS+4 μg/mL阿奇霉素+0.5 μmol/L JAK2/STAT3通路激活劑Colivelin）。干預(yù)24 h后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）、Hoechst 33258染色法、蛋白免疫印跡法檢測炎癥因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)水平、細(xì)胞活力、增殖率、凋亡率、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）及JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：LPS組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)水平高于空白組，細(xì)胞活力低于空白組；與LPS組相比，高濃度試驗(yàn)組炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高。選擇在LPS組基礎(chǔ)上有差異的4 μg/mL阿奇霉素作為阿奇霉素組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。LPS組細(xì)胞增殖率、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平低于空白組，細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平高于空白組。阿奇霉素組和抑制劑組顯著扭轉(zhuǎn)了LPS組上述指標(biāo)的變化。與阿奇霉素組相比，阿奇霉素+抑制劑組細(xì)胞增殖率、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步顯著升高，細(xì)胞凋亡率、IL-6、IL-8、TNF-α、Caspase-3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步顯著降低，阿奇霉素+激活劑組則顯著逆轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)的變化。本研究表明，阿奇霉素可通過抑制JAK2/STAT3信號通路減輕LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡。

關(guān)鍵詞：阿奇霉素；Janus激酶2；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄啟動因子3；肺泡上皮細(xì)胞；炎癥性肺損傷

中圖分類號：R725.6；R969" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.03.010

Effect and Mechanism of Azithromycin on Inflammatory Injury of Alveolar Epithelial Cells Induced by Lipopolysaccharide

WEN Linga， LI Baoqia， ZHAO Yanminb， ZHENG Shuyanga， SU Yinga

（The First Hospital of Qinhuangdao a. Pediatric ICU; b. College of Pharmacy， Qinhuangdao 066000， China）

Abstract： To explore the regulatory effects of azithromycin on lipopolysaccharide （LPS） -induced proliferation， apoptosis and Janus kinase 2 （JAK2）/signal transduction and transcription promoter 3 （STAT3） signaling pathways in human alveolar epithelial cells， in vitro culture of human alveolar epithelial cells A549， were divided into blank group （no intervention）， LPS group （10 μg/mL LPS treated for 24 h）， low/medium/high concentration experimental group （10 μg/mL LPS+1， 2， 4 μg/mL azithromycin） and azithromycin group （10 μg/mL LPS+4 μg/mL azithromycin）， inhibitor group （10 μg/mL LPS+50 μmol/L JAK2/STAT3 pathway inhibitor AG490）， azithromycin+inhibitor group （10 μg/mL LPS+4 μg/mL azithromycin+50 μmol/L AG490） and azithromycin+activator group （10 μg/mL LPS+4 μg/mL azithromycin+0.5 μmol/L JAK2/STAT3 pathway activator Colivelin）. After 24 hours of intervention， enzyme-linked immunosorption assay （ELISA）， cell counting kit-8 （CCK-8）， 5-acetyney-2' deoxyuracil nucleoside （EdU）， Hoechst 33258 staining and Western blotting （WB） were used for the expression levels of inflammatory factors interleukin-6 （IL-6）， interleukin-8 （IL-8）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， cell viability， proliferation rate， apoptosis rate， Caspase-3 and Cyclin D1 and the expression levels of JAK2/STAT3 signaling pathway related proteins. The results show that： compared with blank group， the expression levels of inflammatory cytokines IL-6， IL-8 and TNF-α in LPS group significantly increased， and cell viability significantly decreased. Compared with LPS group， the expression levels of inflammatory cytokines IL-6， IL-8 and TNF-α in high-concentration experimental group significantly decreased， and cell viability significantly increased. In this study， 4 μg/mL azithromycin with significant difference from LPS group was selected as azithromycin group for follow-up experiments. Compared with blank group， the cell proliferation rate and Cyclin D1 protein expression levels in LPS group significantly decreased， while the apoptosis rate， Caspase-3， p-JAK2 and p-STAT3 protein expression levels significantly increased. Compared with LPS group， azithromycin group and inhibitor group significantly reversed the changes of the above indexes. Compared with azithromycin group， cell proliferation rate and Cyclin D1 protein expression levels in azithromycin+inhibitor group further significantly increased， while apoptosis rate， IL-6， IL-8， TNF-α， Caspase-3， p-JAK2 and p-STAT3 protein expression levels further significantly decreased. Azithromycin+activator group significantly reversed the changes of the above indexes. Azithromycin can reduce LPS-induced inflammatory damage of A549 cells by inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathway， promote cell proliferation and inhibit apoptosis， and provide evidence for exploring azithromycin treatment of LPS induced acute lung injury.

Key words： azithromycin; Janus kinase 2; signal transduction and transcription promoter 3; alveolar epithelial cells; inflammatory lung injury

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（3）： 267-274）

肺部炎癥屬于兒童中較為常見的疾病，好發(fā)于春、冬季節(jié)，多起因于細(xì)菌、非典型微生物、呼吸道病毒等［1］。肺部炎癥加重會引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，如呼吸衰竭、缺氧性腦病、急性肺損傷、肺部纖維化等。近幾年由肺炎引起的炎癥性肺損傷逐漸增多，常規(guī)藥物在一定程度上雖能夠控制其癥狀，但療效不佳，因此，探尋有效方法進(jìn)行治療對患兒具有重要意義［2］。炎癥性肺損傷發(fā)病機(jī)制主要涉及滲出、增殖與纖維化等階段。在滲出階段會產(chǎn)生大量的白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎性因子，而在增殖階段成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞增殖加快，從而進(jìn)入具有彌漫性肺間質(zhì)纖維化和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂等典型特征的纖維化階段［3］。開發(fā)治療炎癥性肺損傷的有效藥物意義重大。阿奇霉素（azithromycin）是一種較常見的大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)［4］。據(jù)報(bào)道，阿奇霉素處理巨噬細(xì)胞后能夠使白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、TNF-α濃度降低，抑制細(xì)胞釋放炎癥因子，還可以減輕大鼠急性肺損傷［5-6］。另有研究顯示，阿奇霉素能夠通過抑制Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄啟動因子3（transcription priming factor 3，STAT3）信號通路對哮喘氣道炎癥反應(yīng)進(jìn)行抑制［7］。JAK2/STAT3信號通路可參與組成多種細(xì)胞因子受體系統(tǒng)，還與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等息息相關(guān)。研究顯示，下調(diào)p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)能夠緩解膿毒癥急性損傷小鼠肺功能［8］。然而，阿奇霉素通過JAK2/STAT3信號通路對肺泡上皮細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用尚不明確。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌外膜上的主要成分，是一種強(qiáng)烈的炎癥啟動因子，可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。因此，本研究通過使用LPS對與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有相似形態(tài)以及生化特性［9］的肺泡上皮細(xì)胞A549進(jìn)行體外干預(yù)，模擬炎性肺損傷，研究阿奇霉素對JAK2/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用及對LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為阿奇霉素的應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人肺泡上皮細(xì)胞A549購自北京北納創(chuàng)聯(lián)公司，阿奇霉素和LPS均購自上海源葉生物科技有限公司。將阿奇霉素用適量二甲基亞砜在超聲下加熱溶解，稀釋100倍后備用。LPS在室溫下用無菌水進(jìn)行配制。Colivelin（純度≥98%）、AG490（純度≥99%）（上海源葉生物科技有限公司），F(xiàn)-12K培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司），5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-acetylidene-2' deoxyuracil nucleoside，EdU）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），RIPA裂解液、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（北京貝博生物科技有限公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell count kit-8，CCK-8）（艾美捷科技有限公司），Hoechst 33258染色試劑盒（上海愛必信生物科技有限公司），鼠抗人［細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartate protease-3，Caspase-3）、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2及β-actin一抗］，二抗包括堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+G）和AP標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+G）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。MF52-N型倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）、IMARK型酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）、TG-21WC型離心機(jī)（山東科博生物科技有限公司）、RYX-150型細(xì)胞培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、DYCZ-24KF型四板垂直蛋白電泳儀（上海天能生命科學(xué)有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在F-12K培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中接種肺泡上皮細(xì)胞A549，在37℃、5% CO2、70%～80%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液，傳代（密度達(dá)到80%）后用于試驗(yàn)研究。

1.2.2 分組及給藥

將A549細(xì)胞分為空白組、LPS組、低/中/高濃度試驗(yàn)組、阿奇霉素組、抑制劑組、阿奇霉素+抑制劑組和阿奇霉素+激活劑組。空白組細(xì)胞不做干預(yù)，LPS組以10 μg/mL LPS刺激A549細(xì)胞24 h［10］；低/中/高濃度試驗(yàn)組為10 μg/mL LPS+1、2、4 μg/mL阿奇霉素；抑制劑組為10 μg/mL LPS+50 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制劑AG490；阿奇霉素+抑制劑組為10 μg/mL LPS+4 μg/mL阿奇霉素+50 μmol/L AG490；阿奇霉素+激活劑組為10 μg/mL LPS+4 μg/mL阿奇霉素+0.5 μmol/L Colivelin。各組（重復(fù)3次）分別干預(yù)24 h。

1.2.3 ELISA測定人肺泡上皮細(xì)胞A549中IL-6、IL-8、TNF-α水平

取干預(yù)后細(xì)胞，利用超聲破碎肺泡上皮細(xì)胞A549，按照ELISA試劑盒中說明書的流程嚴(yán)格操作，對IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平進(jìn)行測定。

1.2.4 CCK-8法測定人肺泡上皮A549細(xì)胞活力

用完全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸處理后的各組A549細(xì)胞，以每孔8×103個細(xì)胞的接種量接種于96孔板，空白對照組只含培養(yǎng)基無細(xì)胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再加入CCK-8溶液（10 μL）反應(yīng)2 h后，測各孔在450 nm處的吸光度（optical density，OD）值并進(jìn)行計(jì)算。細(xì)胞活力為ODLPS組或低/中/高濃度試驗(yàn)組-OD空白對照組與OD空白組-OD空白對照組的百分比。

1.2.5 EdU法測定人肺泡上皮A549細(xì)胞增殖率

藥物處理24 h后，細(xì)胞進(jìn)行EdU孵育2 h，用4%多聚甲醛固定30 min，0.3% TritonX-100透化10 min后，每孔加入100 μL Click反應(yīng)液避光孵育30 min；進(jìn)行常規(guī)的Hoechst復(fù)染；裝片后拍照并計(jì)數(shù)。細(xì)胞增殖率為紅細(xì)胞數(shù)占藍(lán)細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.6 Hoechst 33258染色法測定人肺泡上皮A549細(xì)胞凋亡率

將肺泡上皮細(xì)胞A549接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時進(jìn)行藥物處理；24 h后將細(xì)胞與體積分?jǐn)?shù)為10%的Hoechst 33258工作液避光孵育10 min。在熒光顯微鏡下觀察Hoechst 33258熒光信號并拍照。凋亡細(xì)胞出現(xiàn)高強(qiáng)藍(lán)色信號，正常細(xì)胞為低弱藍(lán)色信號。細(xì)胞凋亡率/%=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western blotting，WB）法檢測A549細(xì)胞中Caspase-3、Cyclin D1和JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

干預(yù)后提取蛋白，定量并上樣，進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜用200 mA恒流，封閉采用5%脫脂牛奶，2 h后加入鼠抗人（Caspase-3、Cyclin D1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及β-actin）的抗體稀釋液，4℃孵育過夜，加入二抗稀釋液，2 h后棄液，TBST洗滌，最后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行圖片采集。內(nèi)參使用β-actin，蛋白灰度值的分析方法為ImageJ軟件，目的蛋白表達(dá)值以目的蛋白灰度值比上β-actin灰度值來表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 9軟件作圖，利用ImageJ軟件分析計(jì)算蛋白灰度值。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，多組間利用單因素方差分析，兩組間采用Dunnett’s t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿奇霉素抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的炎癥

如圖1所示：LPS組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平高于空白組（Plt;0.05）；低/中/高濃度試驗(yàn)組中的細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平低于LPS組，其中高濃度試驗(yàn)組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），低/中濃度試驗(yàn)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

2.2 阿奇霉素促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活力

如圖2所示：LPS組細(xì)胞活力低于空白組（Plt;0.05）；高濃度試驗(yàn)組細(xì)胞活力高于LPS組（Plt;0.05）。本研究選擇4 μg/mL阿奇霉素作為阿奇霉素最優(yōu)質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 阿奇霉素通過抑制JAK2/STAT3通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖

如圖3所示：LPS組的細(xì)胞增殖率低于空白組（Plt;0.05）；阿奇霉素組和抑制劑組細(xì)胞增殖率高于LPS組（Plt;0.05）；阿奇霉素+抑制劑組細(xì)胞增殖率高于阿奇霉素組，而阿奇霉素+激活劑組的細(xì)胞增殖率低于阿奇霉素組（Plt;0.05）。

2.4 阿奇霉素通過抑制JAK2/STAT3通路降低LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡

如圖4所示：LPS組細(xì)胞凋亡率高于空白組（Plt;0.05）；阿奇霉素組和抑制劑組細(xì)胞凋亡率低于LPS組（Plt;0.05）；阿奇霉素+抑制劑組細(xì)胞凋亡率低于阿奇霉素組（Plt;0.05），而阿奇霉素+激活劑組細(xì)胞凋亡率高于阿奇霉素組（Plt;0.05）。

2.5 阿奇霉素抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)并促進(jìn)Cyclin D1蛋白表達(dá)

LPS組細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)水平低于空白組，Caspase-3蛋白表達(dá)水平高于空白組（Plt;0.05）。阿奇霉素組和抑制劑組Caspase-3蛋白表達(dá)水平低于LPS組（Plt;0.05），Cyclin D1蛋白表達(dá)水平高于LPS組（Plt;0.05）。阿奇霉素+抑制劑組與阿奇霉素組相比，Caspase-3蛋白水平進(jìn)一步降低（Plt;0.05），而Cyclin D1蛋白水平進(jìn)一步升高，阿奇霉素+激活劑組則趨勢相反（Plt;0.05）。具體數(shù)據(jù)見圖5。

2.6 阿奇霉素抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路活化

LPS組細(xì)胞p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)水平高于空白組（Plt;0.05）。阿奇霉素組和抑制劑組p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)水平低于LPS組（Plt;0.05）。阿奇霉素+抑制劑組p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)水平低于阿奇霉素組，阿奇霉素+激活劑組p-JAK2及p-STAT3蛋白水平高于阿奇霉素組（Plt;0.05）。具體數(shù)據(jù)見圖6。

2.7 阿奇霉素通過抑制JAK2/STAT3信號通路減輕LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥損傷

LPS組IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平高于空白組（Plt;0.05）。阿奇霉素組和抑制劑組IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平低于LPS組（Plt;0.05）。阿奇霉素+抑制劑組IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平低于阿奇霉素組（Plt;0.05），而在阿奇霉素+激活劑組中它們的表達(dá)水平則高于阿奇霉素組（Plt;0.05）。具體數(shù)據(jù)見圖7。

3 討論

在我國兒童呼吸系統(tǒng)疾病中，肺炎具有較高的發(fā)病率，被列為重點(diǎn)防治類小兒疾病［11］。炎癥性肺損傷是肺炎常見并發(fā)癥，發(fā)病與惡化速度較快，目前對于該疾病缺乏行之有效的辦法，因此，對該疾病發(fā)病機(jī)制的探索成為當(dāng)前眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)［12］。在炎癥性肺損傷發(fā)病過程中，IL-6、IL-8和TNF-α是重要的炎癥介質(zhì)。前人研究表明，肺損傷程度與炎癥介質(zhì)在肺組織和血清中的水平具有緊密聯(lián)系［13］。IL-6具有多種生物活性，不僅能夠參與機(jī)體的免疫防御機(jī)制，還能引起機(jī)體急性期炎癥反應(yīng)，并且多種炎癥介質(zhì)均能夠刺激細(xì)胞釋放IL-6；而作為主要趨化性細(xì)胞因子之一的IL-8，則能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化和促進(jìn)細(xì)胞的增殖［14-15］。本試驗(yàn)利用LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞后，IL-6、IL-8和TNF-α的水平明顯升高，說明LPS侵襲機(jī)體后的重要特征就是刺激細(xì)胞的炎性分泌，這是機(jī)體的防御機(jī)制。機(jī)體通過大量的釋放趨化性、促炎等細(xì)胞因子進(jìn)而引起炎癥性疾病如肺損傷［16］。因此，采取有效藥物進(jìn)行抗炎治療能夠減輕機(jī)體的炎性損傷，進(jìn)而緩解炎癥引起的肺損傷。

阿奇霉素是一種合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，國內(nèi)外對其治療肺炎也有較多的研究。據(jù)Yang［17］的報(bào)道，阿奇霉素通過減輕組織損傷治療炎性疾病，并且還能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用，同時還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、預(yù)防及延緩呼吸道系統(tǒng)疾病惡化等功能。Izadi等［18］及Ito等［19］的研究表明，阿奇霉素對于肺炎的治療有明顯作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，LPS組細(xì)胞活力水平降低，細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，4 μg/mL阿奇霉素處理后，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的人肺泡細(xì)胞A549的細(xì)胞活力恢復(fù)，而細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平降低，說明阿奇霉素能夠增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的活力，抑制其炎癥因子水平。本研究后續(xù)試驗(yàn)選擇LPS+4 μg/mL阿奇霉素作為阿奇霉素組，LPS誘導(dǎo)人肺泡細(xì)胞A549后，細(xì)胞增殖率、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低，而細(xì)胞凋亡率、IL-6、IL-8、TNF-α和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高。與LPS組相比，阿奇霉素組和抑制劑組處理后扭轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)的變化趨勢。以上結(jié)果說明，阿奇霉素和AG490能夠在一定程度上減輕LPS誘導(dǎo)的人肺泡細(xì)胞A549的炎癥損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡。

JAK2/STAT3信號通路參與了炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程，是許多細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路之一。當(dāng)機(jī)體受外界炎癥因子刺激時，JAK2被活化，促使受體與STAT3結(jié)合并磷酸化，而JAK2磷酸化后會誘導(dǎo)p-STAT3發(fā)生一系列反應(yīng)，從而介導(dǎo)炎癥因子表達(dá)激活JAK2/STAT3信號通路，加重機(jī)體的組織損傷［20］。王國全等［21］發(fā)現(xiàn)，JAK2和STAT3在膿毒癥急性肺損傷的大鼠肺組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，清瘟敗毒飲給藥后除JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平降低外，炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α等表達(dá)水平也降低。Colivelin和AG490分別為JAK2/STAT3通路的激活劑和抑制劑［22］，能激活或抑制JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。周璐等［23］證實(shí)，LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的炎癥反應(yīng)在JAK2/STAT3信號通路抑制劑作用下發(fā)生改變。還有研究報(bào)道［7］，阿奇霉素可以減少氣道炎癥細(xì)胞的浸潤，這一作用機(jī)制與JAK2/STAT3信號通路的抑制過程息息相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS處理后p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)升高，而阿奇霉素組和抑制劑組逆轉(zhuǎn)了這一變化，提示阿奇霉素有可能對JAK2/STAT3通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)起到抑制作用。加入AG490后，阿奇霉素+抑制劑組的細(xì)胞增殖率、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平得到提高，細(xì)胞凋亡率、炎癥因子、Caspase-3、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)水平得到抑制，阿奇霉素+激活劑組則與阿奇霉素+抑制劑組趨勢相反。這提示，阿奇霉素可以減輕對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡，這一作用機(jī)制依賴于對JAK2/STAT3信號通路的抑制作用。

在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549肺損傷中，阿奇霉素可以減輕對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的炎癥損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡，這一作用機(jī)制依賴于對JAK2/STAT3信號通路的抑制作用。本研究可為阿奇霉素減輕炎癥性肺損傷提供新的理論依據(jù)，但該研究僅使用了A549細(xì)胞且僅在體外細(xì)胞試驗(yàn)中進(jìn)行了研究，后續(xù)可進(jìn)一步進(jìn)行其他細(xì)胞及動物臨床試驗(yàn)探究予以證實(shí)。

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