基于網絡藥理學與分子對接探討當歸丹參藥對治療急性肝損傷的作用機制

摘 要：基于網絡藥理學與分子對接技術及試驗驗證探討當歸丹參藥對（ASM）治療急性肝損傷（ALI）的作用機制。本研究采用網絡藥理學方法篩選ASM治療ALI的核心作用靶點，構建核心靶點進行蛋白互作網絡和分子對接分析，通過構建大鼠ALI模型檢測相關血清生化指標和肝臟蛋白的表達模式并驗證分子對接結果。結果顯示，從ASM中獲得了67個活性成分，其中75個靶點與ALI相互作用。蛋白質–蛋白質相互作用（PPI）網絡分析顯示，TP53、CASP3、JUN、STAT3、AKT1、VEGFA、TNF、IL-6、MMP9和PTGS2可能是ASM治療ALI的關鍵作用靶點。基因本體（GO）分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路分析表明，靶點主要富集于乙肝信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、糖基化終產物受體（RAGE）和細胞凋亡等信號通路。分子對接結果顯示，核心靶點（TP53和CASP3）與 β-谷甾醇、黃芩苷和隱丹參酮有良好的結合位點。體內試驗結果表明，ASM能夠有效改善四氯化碳（CCl4）誘導的大鼠肝損傷，降低大鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）及丙二醛（MDA） 的表達水平，提高肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性及谷胱甘肽（GSH）水平，上調肝臟組織中BCL2蛋白的表達水平，下調BAX、CASP3和TP53蛋白的表達水平。本研究表明，ASM改善ALI的機制可能是通過β-谷甾醇、黃芩苷和隱丹參酮等主要化學成分作用于TP53和CASP3等關鍵靶點，通過抑制氧化應激及調控細胞凋亡等信號通路來實現。本研究為臨床上ASM治療ALI提供理論與試驗依據，為進一步研究和發展傳統中醫藥提供新的思路和方法。

關鍵詞：當歸；丹參；急性肝損傷；網絡藥理學；分子對接

中圖分類號：R287" " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.03.007

A Study on Mechanism of ASM in the Treatment of ALI Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

FENG Lingb， HUANG Zhaoxiaa， LI Junlana， DONG Zhengpinga， ZHANG Yongqina*

（Guizhou University of Traditional Chinese Medicine a. Department of Basic Medicine; b. Department of Pharmacy， Guiyang 550025， China）

Abstract： Based on network pharmacology and molecular docking technology， the mechanism of radix angelicae sinensis-radix salviae miltiorrhizae drug pair （ASM） in the treatment of acute liver injury （ALI） was studied and verified by experiment. In this study， network pharmacology and molecular docking methods were used to screen the core targets of ASM in the treatment of ALI， and the core targets were enriched by analysis， and protein interaction network was constructed. The core target was molecular docked with the active components of ASM， and the molecular docking was verified by constructing ALI rat model and detecting the expression of relevant serum biochemical indexes and liver proteins. The results showed that 67 active ingredients were obtained from ASM， of which 75 targets interacted with acute liver injury. Protein-protein interactions （PPI） network analysis showed that TP53， CASP3， JUN， STAT3， AKT1， VEGFA， TNF， IL-6， MMP9 and PTGS2 may be the key targets of ASM in the treatment of ALI. The core targets of GO and KEGG signaling pathway enrichment analysis were mainly concentrated in hepatitis B signaling pathway， lipid and atherosclerosis， AGE-RAGE， and apoptosis signaling pathways. Molecular docking results showed that the core targets （TP53 and CASP3） had good binding sites with β-sitosterol， baicalin and cryptotanshinone. The results of in vivo experiments showed that ASM could reduce the expression levels of ALT， AST and MDA in serum of CCl4-induced model rats， and increase the activity of SOD， CAT and GSH in liver， thereby alleviating the CCl4-induced oxidative stress. The ASM could up-regulate BCL2 and down-regulate the expression levels of BAX， CASP3 and TP53. The results of this study indicate that ASM can effectively ameliorate ALI， which may be achieved through β-sitosterol， baicalin and cryptotanshinone and other chemical components， acting on key targets such as TP53 and CASP3， and through multiple signaling pathways such as p53 signaling pathway and apoptosis pathway. This study provides theoretical and experimental basis for clinical ASM treatment of ALI， and provides new ideas and methods for further research and development of traditional Chinese medicine.

Key words： radix angelicae sinensis; radix salviae miltiorrhizae; acute liver injury; network pharmacology; molecular docking

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（3）： 243-252）

急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是指在短時間內由于各種原因引起的肝細胞突然損傷和肝功能異常，其中藥物中毒、病毒感染、免疫反應和缺血再灌注損傷是誘發ALI的主要因素［1］。大多數ALI患者經藥物治療后恢復，但部分患者發展為急性肝衰竭，導致死亡率升高［2］。在肝病的防治中，中藥及其中草藥提取物已被證明具有保護肝臟的作用，具有療效好、安全實用等優點，在臨床中得到了廣泛的應用［3］。因此，它們在疾病治療、預防和保健領域具有重要意義。

當歸（radix angelicae sinensis，AS）是一味中草藥，它含有多種多糖、揮發油、類黃酮、氨基酸、維生素和微量元素，具有改善貧血、保護肝臟、調節免疫、抗腫瘤和抗炎等作用［4］。丹參（radix salviae miltiorrhizae，SM）也是一味中草藥，具有活血、調經、涼血、去癰、化瘀和止痛安神等功效［5］。SM廣泛應用于肝臟疾病的治療，其中丹參酮IIA （tanshinone IIA）、隱丹參酮 （cryptotanshinone）、丹參素 （tanshinone）、丹酚酸 （salvianolic acid）等具有多種生物活性，在肝損傷的治療中發揮重要作用［6］。在臨床應用中，AS與SM合用對多種肝臟疾病具有協同作用，治療效果明顯優于單獨使用。因此，當歸丹參藥對（radix angelicae sinensis-radix salviae miltiorrhizae drug pair，ASM）常作為復方用于治療相關肝臟疾病，大量治療肝病的方劑中均含有AS和SM，常常作為君藥或臣藥來治療肝病。因此，探究ASM治療肝損傷的機制具有重要的臨床價值與意義。網絡藥理學是從中醫整體角度研究單藥或復方的作用機理，通過構建中藥成分-靶點-疾病相互作用關系網絡，探討藥物與疾病之間的相互作用關系［7］。網絡藥理學與分子對接技術能夠揭示中藥復方的組成、多靶點和途徑協同作用對疾病的治療機制，為中藥復方的物質基礎和治療疾病的機理研究提供了新的思路和方法［8］。本研究采用網絡藥理學方法結合分子對接方法，通過建立ASM化合物與ALI靶點相互作用網絡，以及體外試驗驗證ASM治療ALI的作用機制，為探究ASM治療ALI的機制提供試驗依據，也為臨床推廣ASM治療ALI提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學數據分析

1.1.1 ASM有效成分與ALI相關靶點的篩選和收集

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集ASM的化學成分，并設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%和類藥性（drug like，DL）≥ 0.18來篩選有效成分［9］。通過搜索Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/）進一步篩選得到的靶點，并進行歸一化分析。以“acute liver injury”為檢索關鍵詞，在GeneCards （https：//www. genecards.org/）、OMIM（https：//www. omim. org/）和TTD（http：//db.idrblab. net/ttd/）數據庫中檢索與ALI相關的靶點。使用Venny 2.1.0（http：//bioinfogp. cnb.csic.es/tools/ venny/）篩選ASM和ALI相關的交集基因作為核心靶點。

1.1.2 構建藥物有效成分-靶點-疾病相互作用網絡

將ASM活性成分靶點與ALI相關靶點之間的重疊靶點導入STRING數據庫（https：// www.string-db.org/），以“Homo sapiens”作為篩選標準。然后將結果導入Cytoscape 3.8.1軟件，構建ASM和ALI相交靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）［10］網絡。將目標關系信息導入Cytoscape 3.8.1軟件，構建藥物有效成分-靶點-疾病相互作用網絡圖，并應用CytoHubb插件對核心網絡進行分析。

1.1.3 核心靶點基因的基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析

利用DAVID 平臺（https：//david.ncifcrf.gov/）對ASM和ALI之間的交集靶點進行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，并繪制GO與KEGG分析中富集最顯著的前30個信號通路。

1.1.4 核心靶點與有效成分的分子對接

在藥物有效成分-靶點-疾病相互作用網絡中，鑒定出結合程度最高的10個有效成分，并從PubChem數據庫 （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心成分的2D結構。從RCSB數據庫 （https：//www.rcsb.org/search）下載相關性最高的關鍵靶蛋白的三維結構。使用Chem3D軟件對有效成分進行預處理，使用AutoDock Vina 1.5.7軟件對10個核心藥物成分與關鍵靶點進行分子對接分析。通過有效成分與靶蛋白之間的結合能來評價其結合程度，使用PyMOL 2.8.0軟件和Ligplus軟件對部分結構進行可視化顯示。

1.2 體外試驗驗證

1.2.1 材料與試劑

4%多聚甲醛、四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）溶液和蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；二喹林甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；谷丙轉氨酶 （glutamic pyruvic transaminase，ALT）試劑盒、谷草轉氨酶 （aspartate transaminase，AST）試劑盒、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽 （glutathione，GSH）試劑盒和丙二醛 （malonic dialdehyde，MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；一抗購自上海生工生物技術有限公司。

1.2.2 試驗動物

健康SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠（SD rats）24只，體重200～250 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司。試驗動物使用許可證為SCXK湘：2022-0014。大鼠保持在一個12 h光/暗循環中，溫度（25±2）℃，濕度40%～60%，允許自由獲得食物和水。所有動物處理均獲得貴州中醫院大學倫理委員會的批準（批準號：20220005）。

1.2.3 試驗分組、建模及干預

將AS與SM按照質量比AS：SM=1：1混合，用純水煎煮2次提取，合并濾液，干燥后，得到1 g/mL的溶液保存在-20℃ 冰箱中。將24只雄性SD大鼠在適應喂養1周后，隨機分為正常對照組、模型組和ASM組，每組8只。除正常對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水外，ASM組灌胃相應劑量ASM提取物 ［15 g/（kg·d-1）］，每日1次，連續給藥1周。末次給藥結束2 h后，除正常對照組大鼠腹腔注射等體積橄欖油外，其余組大鼠均一次性腹腔注射含50% CCl4的橄欖油溶液（10 mL/kg）建立大鼠ALI模型。

1.2.4 標本采集

采集試驗動物注射CCl4后24 h左右的血清，采血前隔夜禁食不禁水，秤重，予水合氯醛（10%）腹腔注射麻醉，由腹正中線切皮，進入腹腔分離腹主動脈，經腹主動脈采血，將獲得的各組大鼠血液室溫靜置2 h 后，4℃、3 000 r/min 離心15 min，得到各組大鼠血清，收集血清，分裝后-20℃保存備用。在充分暴露游離肝臟后，在肝臟右葉中部，在距邊緣 5 mm 處用剪刀取肝組織小塊，一部分用液氮速凍-80℃ 保存備用，另外一部分固定在10%多聚甲醛中，用于相關指標的檢測。

1.2.5 血清生化指標與肝臟組織病理檢測

根據試劑盒說明書，檢測血清中ALT和AST的活性水平。麻醉處死大鼠，取肝臟組織，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片（5 μm）后用HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測

分別取各組的肝臟組織約100 mg，加入1 mL蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，裂解離心吸取上清液。采用蛋白定量BCA試劑檢測方法測定總蛋白含量。取各組蛋白樣品進行上樣，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進行電泳，聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉膜，用5% 脫脂奶粉在室溫下孵育1 h，加入相應腫瘤抗原P53（tumor protein P53，TP53）（#D120082）、BCL2（#D160117）、BAX（#D220073）、半胱氨酸蛋白酶3 （caspase-3，CASP3，#D320074）和 β-actin（#20536-1-AP）的一抗，4℃ 孵育過夜。洗滌后加入山羊抗兔IgG二抗（1：1 000）室溫孵育1 h，Tris緩沖鹽溶液（tris-buffered saline，TBS）洗膜后用增強型化學發光試劑（electrochemiluminescence，ECL）顯影。應用凝膠圖像分析系統進行吸光度掃描，得出灰度值。檢測目的蛋白表達水平，以β-actin為內參照進行半定量分析。

1.3 統計分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理，試驗均重復3次，計量資料采用均值±標準差（x±s）的形式表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。Plt;0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 獲取ASM有效成分和疾病主要作用靶點

使用GeneCards、OMIM和TTD數據庫篩選ALI疾病靶點，通過篩選共獲得1 241個疾病靶基因。利用TCMSP數據庫共從ASM中篩選出67種有效成分，并獲得有效成分的相對分子質量（relative molecule weight，MW）、OB和DL的數據信息，其中的部分主要有效成分信息見表1。將化合物進行去重后的靶點分析得到了152個潛在蛋白靶點，將152個藥物靶點和1 241個疾病靶點進行共有靶點分析，并將信息導入Venny 2.1.0網站繪制Venn圖，即ASM治療ALI的75個潛在靶點（圖1a）。對這75個交集靶點導入String網站進行靶點互作分析，發現大部分靶點彼此之間具有很好的結合度。圖中節點的大小與有效成分正相關，節點越大，該值越大，說明該化合物在網絡中起著重要的作用（圖1b）。

2.2 ASM治療ALI的有效成分-靶點-疾病與核心靶點PPI網絡圖分析

通過構建ASM治療ALI的有效成分-靶點-疾病網絡圖，使用Cytoscape 3.8.1軟件繪制網絡圖。如圖2a所示，在圖中紅色橢圓形代表藥物，黃色倒三角形代表有效成分，綠色三角形代表蛋白靶點，從有效成分-靶點-疾病網絡分析ASM治療ALI的作用。通過Cytohubba插件篩選出前10個核心靶點，如圖2b所示，排名前10位的核心靶點分別是TP53、CASP3、轉錄因子AP-1 （jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit， JUN）、信號轉導轉錄激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 （AKT serine/threonine protein kinase 1，AKT1）和血管內皮生長因子A （vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）、基質金屬蛋白酶9 （matrix metallopeptidase 9，MMP9）、前列腺內過氧化物酶合成酶 2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）等，這些核心靶點可能是ASM治療ALI的主要作用靶點。

2.3 基因的GO和KEGG信號途徑富集分析

使用DAVID數據庫對ASM與ALI的共有靶點進行GO和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞成分（cellular component，CC）。GO分析共富集了189個生物過程，涉及124個BP、21個CC和44個MF。KEGG通路富集分析共涉及126條信號通路，利用OmicShare在線工具根據富集基因數量篩選Top 30的富集結果，繪制動態富集氣泡圖，以Plt;0.05為閾值。GO分析結果顯示，Top 30生物過程主要包括對刺激的反應、發育過程、運動、信號傳導和生長等（圖3a）。KEGG通路富集結果顯示，前30條信號通路主要包括乙型肝炎、脂質與動脈粥樣硬化、晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）信號通路、p53信號通路和細胞凋亡等信號通路。由此可見，p53信號通路和細胞凋亡通路可能在ASM治療ALI中起著重要的作用（圖3b）。

2.4 分子對接結果

從PubChem數據庫中獲取PPI互作網絡中10個核心有效成分（豆甾醇、黃芩苷、β-谷甾醇、丹酚酸J、丹酚酸G、丹參酚A、丹參酚B、隱丹參酮、丹參酮IIA、木犀草素）的2D結構。從RCSB數據庫中獲得PPI網絡中2個關鍵靶點TP53 （1GZH）和CASP3 （INME）的三維結構。其中10個有效成分和2個靶點基因對接。結合能反應有效成分與蛋白靶點的結合程度，當結合能小于-5.00" kcal/mol時，表示有效成分與靶蛋白可以穩定結合。如表2所示：10個有效成分中隱丹參酮與TP53結合較強，結合能為-7.05 kcal/mol；隱丹參酮與CASP3結合較強，結合能為-5.72 kcal/mol；豆甾醇與CASP3結合較強，結合能為-6.11 kcal/mol；黃芩苷與TP53結合較強，結合能為-6.91 kcal/mol。分子對接結果顯示，隱丹參酮與TP53，β-谷甾醇與CASP3具有較好的結合位點（圖4）。這些研究結果顯示，有效成分與關鍵靶點整體對接良好，說明這些ASM中的β-谷甾醇、隱丹參酮和黃芩苷等有效成分與TP53和CASP3具有良好的結合能力，這可能暗示這些有效成分通過TP53和CASP3調控細胞凋亡來發揮治療ALI的作用。

2.5 ASM對CCl4肝損傷大鼠血液生化指標的影響

大鼠血清中ALT、AST水平是評價肝損傷嚴重程度的指標之一。結果顯示（圖5a、5b）：CCl4誘導模型組大鼠血清中ALT、AST酶活性較空白對照組顯著升高 （Plt;0.05）；與模型組比較，ASM組大鼠血清中ALT、AST酶活性顯著降低 （Plt;0.05）。由此可見，ASM能夠降低CCl4誘導的大鼠血清ALT和AST的活性進而改善ALI。

2.6 HE組織病理學檢測

通過HE染色法檢測各組大鼠肝臟組織病理變化。結果顯示，正常組肝組織未見異常，組織細胞分布均勻，肝索清晰，無細胞壞死、脂肪變性及炎癥細胞浸潤。與對照組比較，模型組肝細胞出現張力性脂肪變性，脂肪泡大小不等彌漫性分布，胞漿及肝細胞區出現大面積局灶性壞死，伴有空泡和炎性細胞浸潤增多。與模型組比較，ASM組大鼠肝臟壞死細胞和炎癥細胞浸潤明顯減少，肝細胞完整性明顯提高（圖5c）。

2.7 ASM對抗氧化因子水平的影響

通過檢測肝臟組織細胞中SOD、CAT、GSH和MDA等抗氧化相關指標，可以檢測肝細胞的抗氧化能力。如圖6所示，與對照組相比，模型組大鼠肝臟中SOD、CAT和GSH表達水平顯著降低（Plt;0.05），而MDA含量明顯增加 （Plt;0.05）。與模型組比較，ASM組大鼠肝臟組織中SOD、CAT和GSH表達水平明顯增加，MDA含量明顯降低且差異有統計學意義（Plt;0.05）。

2.8 ASM抑制肝組織細胞凋亡

細胞凋亡是細胞程序性死亡的方式，抗凋亡因子BCL2是檢測細胞凋亡的重要指標之一。檢測對照組、模型組和ASM處理組中BCL2、BAX、CASP3、cleaved-CASP3、TP53的蛋白表達水平，結果顯示（圖7）：與對照組比較，模型組中BCL2蛋白表達水平降低，而BAX、CASP3、cleaved-CASP3、TP53等蛋白表達水平增加；與模型組比較，ASM處理組中BCL2表達水平明顯增加，而BAX、CASP3、cleaved-CASP3、TP53等蛋白表達水平明顯降低（Plt;0.05）。這說明，ASM可能通過增加BCL2的表達來拮抗細胞凋亡，進而保護肝臟組織細胞的完整性。

3 討論

ALI以患者的功能性肝細胞迅速損害為特征，藥物中毒、病毒感染、免疫反應和代謝紊亂等多種因素均可引發肝臟的病變，但目前臨床治療手段和干預效果較差，病死率高。近年來中藥在治療ALI方面取得一定成果，其主要作用機制包括抑制體內氧化應激和炎癥反應及肝細胞凋亡等［11］。CCl4誘導的ALI動物模型已廣泛用于肝保護藥物的研究中，其主要通過CCl4代謝產物產生的自由基引起氧化應激反應，致使肝細胞膜破壞，促進炎癥反應，加強肝損傷［12］。本研究通過網絡藥理學和分子對接技術研究ASM治療ALI的保護作用機制，發現ASM中共含有67個主要活性成分，活性成分靶點與ALI疾病靶點共有75個交集靶點。PPI網絡預測結果表明：豆甾醇、黃芩苷、β-谷甾醇、隱丹參酮、木犀草素等化合物是ASM治療ALI的關鍵成分；TP53、CASP3、JUN、STAT3、AKT1、VEGFA、TNF、IL-6、MMP9和PTGS2是ASM治療ALI的關鍵核心靶點。KEGG主要富集于乙型肝炎、脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、p53信號通路和細胞凋亡等信號通路。

研究表明，CCl4誘導肝臟發生脂質過氧化損傷，肝臟中的細胞色素 P450（CYP）可將CCl4轉化為具有較高毒性和生物活性的三氯甲基自由基和過氧化三氯甲基自由基，引起細胞膜上的脂質過氧化作用，破壞細胞膜的完整性，導致肝細胞的變性與壞死［13-14］。肝細胞受損時，細胞膜通透性升高，ALT和AST大量釋放會加劇細胞損傷。在肝臟組織中，SOD和GSH是機體重要的抗氧化酶，能有效清除自由基，抑制自由基誘導的脂質過氧化［15］。作為脂質過氧化的最終代謝物，MDA水平反映了細胞引起的氧化應激程度。研究表明，CCl4可破壞抗氧化系統，降低GSH和SOD水平，增加MDA水平，促進肝損傷的進一步發展［16］。本研究構建了CCl4誘導的ALI大鼠模型，并給與高劑量的ASM處理，結果表明，ASM能降低CCl4誘導肝損傷大鼠血清中AST和ALT的表達水平，提高大鼠肝組織中SOD、CAT的活性以及增加GSH的含量。組織病理結果顯示，ASM處理后大鼠肝細胞壞死程度和炎癥細胞浸潤明顯減少，肝細胞完整性明顯提高。這些結果充分證明，ASM能夠降低肝臟組織細胞的氧化應激反應，抑制炎癥的發生與發展。

此外，臨床證據表明，肝細胞凋亡是ALI的重要病理特征，抑制肝細胞凋亡是預防和緩解ALI的關鍵［17］。當DNA受到損傷或細胞受到過量活性氧刺激時，腫瘤抑制因子TP53則參與細胞凋亡的調控，TP53通過上調促凋亡基因BAX，下調BCL2基因的表達來促進細胞凋亡［18］。有研究表明，CCl4誘導的肝損傷會導致肝實質細胞發生異常凋亡，因此降低CASP3的表達可以抑制肝細胞凋亡，從而有效改善ALI［19］。我們利用PPI蛋白互作網絡對75個交集靶點進行分析，鑒定出TP53、CASP3、JUN、STAT3、AKT1、VEGFA、TNF、IL-6、MMP9和PTGS2是ASM治療ALI的關鍵核心靶點。通過KEGG主要富集分析發現，乙型肝炎、脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、p53信號通路和細胞凋亡通路與ASM治療ALI相關。本研究結果顯示，ASM可不同程度地顯著降低CASP3、BAX、TP53蛋白的表達，增加BCL2蛋白的表達，對大鼠CCl4誘導的ALI具有有效的保護作用。近期有研究表明，AS通過抑制氧化應激和肝細胞凋亡，對對乙酰氨基酚誘導的ALI和肝細胞死亡具有保護作用［20］。此外，丹酚酸C通過抑制keap1/Nrf2/HO-1信號通路減輕炎癥、氧化應激和細胞凋亡，從而對抗對乙酰氨基酚誘導的ALI［21］。丹酚酸A通過調節Nrf2/HO-1、NF-κB/κBα、p38 MAPK和JAK1/STAT3信號通路抑制炎癥和氧化應激，有效預防小鼠肝纖維化［22］。丹酚酸A通過恢復大鼠SIRT1，促進β-catenin核積累，減輕慢性乙醇性肝損傷［23］。隱丹參酮通過激活AMPK/SIRT1和Nrf2以及抑制CYP2E1，對乙醇誘導的肝損傷表現出肝臟保護作用，其機制是抑制脂肪生成、氧化應激和炎癥［24］。通過分子對接技術我們發現，隱丹參酮能夠與TP53結合，β-谷甾醇與CASP3結合較強。隱丹參酮具有廣泛的生物學功能，包括抗氧化、抗纖維化和抗炎作用，其能夠調節內質網應激途徑促進肝星狀細胞凋亡，從而緩解肝纖維化［25］。β-谷甾醇能夠有效改善酒精誘導的大鼠肝損傷［26］。此外，黃芩苷能夠降低CASP3和NLRP3的表達改善對乙酰氨基酚和CCl4誘導的急性肝損傷［27-28］。這表明，ASM的有效成分隱丹參酮、β-谷甾醇和黃芩苷等化合物可能通過抑制TP53和CASP3的表達降低細胞凋亡，從而改善CCl4誘導的大鼠肝細胞的凋亡情況。總之，我們通過CCl4誘導的ALI模型，結合網絡藥理學和體內試驗研究了ASM治療ALI的潛在機制。然而，ASM的隱丹參酮、β-谷甾醇和黃芩苷等有效成分如何具體作用于急性肝損傷的機制，有待于進一步研究闡明。接下來課題組將繼續研究以ASM為基礎的方劑，為今后開發治療肝損傷的藥物提供研究基礎。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法與分子對接技術研究ASM治療ALI的潛在分子機制，結果表明，ASM治療ALI是通過多成分、多靶點、多通路相互作用的結果，ASM可能通過抑制氧化應激和細胞凋亡信號通路來減輕大鼠ALI，初步揭示了ASM治療ALI的多方向調控作用，為傳統中藥的研究和發展提供了新的思路和方法。

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