冬凌草甲素對人軟骨肉瘤SW-1353細胞遷移和侵襲能力的影響

摘 要：為探究冬凌草甲素對人軟骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力的影響，體外培養人軟骨肉瘤SW-1353細胞，將試驗分別設為對照組（不做干預），1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素組（1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素）和陽性藥物組（6 μmol/L阿霉素），檢測人軟骨肉瘤SW-1353細胞的活力、遷移率、侵襲能力、上皮-間質轉化（EMT）蛋白表達量。結果顯示：與對照組比較，5.00 μmol/L冬凌草甲素組和陽性藥物組人軟骨肉瘤SW-1353細胞活力降低（Plt;0.05）；1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素組和陽性藥物組遷移率及侵襲能力降低，且濃度越高變化越顯著（Plt;0.05）。冬凌草甲素能夠通過升高E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達、降低波形蛋白（vimentin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達量進而抑制EMT進程，且濃度越高變化越顯著（Plt;0.05）。冬凌草甲素可顯著抑制人軟骨肉瘤SW-1353細胞的遷移和侵襲，或是通過介導EMT實現的，這為人軟骨肉瘤細胞的生物學研究提供了理論基礎。

關鍵詞：冬凌草甲素；軟骨肉瘤；SW-1353；遷移；侵襲

中圖分類號：R739.96" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.03.012

Effects of Oridonin on Migration and Invasion of Human Chondrosarcoma SW-1353 Cells

XU Chao*， LI Zhen， MENG Di， LI Jun

（Department of Orthopaedics， Beidaihe Hospital of Qinhuangdao， Qinhuangdao 066100， China）

Abstract： To investigate the effects of oridonin on migration and invasion of human chondrosarcoma cells. In vitro experiments， human chondrosarcoma SW-1353 cells were divided into control group being without intervention， 1.25， 2.50， 5.00 μmol/L oridonin groups （1.25， 2.50， 5.00 μmol/L oridonin） and positive drug group （6 μmol/L adriamycin）. Human chondrosarcoma SW-1353 cells were tested for viability， mobility， invasion ability and epithelial-mesenchymal transition （EMT） expression. The results show that： compared with the control group， SW-1353 cell viability in the 5.00 μmol/L oridonin group and positive drug group significantly decreased （Plt;0.05）. 1.25， 2.50， 5.00 μmol/L oridonin groups and positive drug obviously inhibted cell migration and invasion in a concentration-dependent manner （Plt;0.05）. The expression of E-cadherin decreased the expression of vimentin and N-cadherin and inhibited EMT process by increasing the expression of E-cadherin protein， and the higher the concentration， the more significant the change was （Plt;0.05）. Lamonidin can significantly inhibit the migration and invasion of human chondrosarcoma SW-1353 cells， or through mediating EMT， which provides a theoretical basis for the biological study of human chondrosarcoma cells.

Key words： oridonin; chondrosarcoma; SW-1353; migration; invasion

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（3）： 284-288）

軟骨肉瘤為原發惡性骨腫瘤，常發生于股骨與骨盆等部位［1］。臨床上常采用手術對軟骨肉瘤進行切除，并輔助以放療、化療［2］。然而，由于腫瘤的發生部位大多為四肢長骨、脊柱等位置，在發現時大部分已發生轉移，手術切除會對患者的肢體功能造成嚴重的影響［3-4］。因此，挖掘新的手段抑制軟骨肉瘤具有重要的臨床意義。冬凌草甲素（oridonin）是一種二萜化合物，屬于中藥冬凌草的有效成分，有抗微生物、抗炎、抗氧化以及抗癌作用。據報道，在多種腫瘤細胞中，冬凌草甲素均有抑增殖、誘導細胞凋亡的作用［5-9］。然而，目前關于冬凌草甲素作用人軟骨肉瘤SW-1353細胞生物學特性及影響機制的報道較少。基于此，本研究通過冬凌草甲素對SW-1353細胞遷移、侵襲以及上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響的研究，探討冬凌草甲素與軟骨肉瘤細胞遷移、侵襲相關機制的關系，為其治療提供合理科學的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞株

人軟骨肉瘤SW-1353細胞購自北納生物科技有限公司。

1.1.2 主要藥品與試劑

冬凌草甲素（上海源葉生物科技有限公司），L-15培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco/美國），基質膠（美國ABW公司），細胞計數試劑盒-8（cell count kit-8，CCK-8）（南京諾唯贊科技有限公司），0.1%結晶紫水溶液（北京索萊寶科技有限公司），鼠抗人一抗［N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、β-actin］，二抗為堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標記的羊抗鼠IgG（H+G）和AP標記的羊抗兔IgG（H+G）（美國CST公司）。

1.1.3 儀器

Multiskan Ascent型酶標儀（美國Thermo公司），HF151型二氧化碳培養箱（武漢益普生物科技有限公司），ZF-288型凝膠成像系統（上海金鵬分析儀器有限公司），DM2000光學顯微鏡（德國徠卡顯微系統有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 人軟骨肉瘤SW-1353細胞培養

培養條件：37℃、100%空氣；所用培養基：加有1%青霉素-鏈霉素、10% FBS的L-15培養基。細胞密度大于80%時將其按照1∶3傳代，細胞達對數生長期時進行后續試驗。

1.2.2" 分組及給藥

將細胞分為對照組（不做干預），1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素組（分別以1.25、2.50、5.00 μmol/L濃度的冬凌草甲素干預24 h）和陽性藥物組（6 μmol/L 阿霉素干預24 h），置于37℃、100%空氣下進行培養。

1.2.3 CCK-8法測定SW-1353細胞的活力

將細胞96孔板鋪板（每孔5×103個細胞）后藥物處理24 h，試驗重復3次。測定時間點設為藥物處理后24 h，按照CCK-8試劑說明書進行后續操作，測定各組在波長450 nm處的光密度（optical density，OD）值。細胞活力=各處理組OD值/對照組OD值。

1.2.4 劃痕試驗測定SW-1353細胞的遷移能力

將SW-1353細胞接種在6孔板中，調整細胞密度為每毫升2×105個細胞，待6孔板中細胞密度為90%時，使用移液器槍頭（10 μL）劃痕，在37℃、100%空氣中進行24 h的培養。0 h和24 h劃痕情況用顯微鏡拍照記錄。0 h和24 h細胞的融合面積分別記為S0與S24。細胞遷移率/%=（S0-S24）/S0×100%。

1.2.5 Transwell小室法測定SW-1353細胞的侵襲能力

提前用基質膠對Transwell小室進行包被，小室的上室中加無血清細胞懸液200 μL，細胞密度為每毫升含1×106個細胞，下室加600 μL培養基（10% FBS），培養24 h，棄掉上清，擦掉小室外層細胞，用4%甲醇固定，持續30 min。晾干，0.1%結晶紫染色，持續10 min，PBS清洗。利用ImageJ1.8.0分析顯微鏡侵襲細胞數。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot，WB）法檢測SW-1353細胞中EMT相關蛋白的表達水平

將細胞接種于6孔板，接種量為每孔1×105個細胞。各組細胞在藥物作用24 h后，被RIPA裂解液重懸并裂解；在4℃、12 000 r/min離心10 min后收集上清液，即總蛋白樣品。蛋白樣品通過凝膠電泳進行蛋白分離，轉膜。載有蛋白的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h后，在4℃進行一抗孵育過夜或室溫一抗孵育2 h；接下來，進行室溫二抗孵育2 h。封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影之間分別用Tris洗膜緩沖液進行3～5次膜洗滌。使用凝膠成像系統拍照記錄，并用ImageJ軟件進行蛋白灰度分析，計算目的蛋白（G）。

1.3 統計學分析

作圖軟件：GraphPad Prism 8；蛋白灰度值計算：ImageJ軟件。所有數據均用平均值±標準差（x±s）表示，并符合正態分布。多組間數據采用單因素方差分析，兩組間數據采用Dunnett’s t檢驗，Plt;0.05表示有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 SW-1353細胞活力比較

與對照組相比，5.00 μmol/L冬凌草甲素組和陽性藥物組SW-1353細胞活力顯著降低（Plt;0.05），而1.25、2.50 μmol/L冬凌草甲素組差異不顯著（Pgt;0.05）（圖1）。

2.2 SW-1353細胞的遷移能力比較

干預24 h后，1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素組和陽性藥物組人軟骨肉瘤SW-1353細胞與對照組比較，遷移能力逐漸降低，且呈劑量依賴性，具有統計學意義（Plt;0.05）（圖2）。

2.3 SW-1353細胞的侵襲能力比較

與對照組相比，1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素組、陽性藥物組侵襲細胞數降低（Plt;0.05），且隨冬凌草甲素濃度升高，1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素組侵襲細胞數濃度出現依賴性地降低（Plt;0.05）（圖3）。

2.4 SW-1353細胞中EMT相關蛋白的表達水平變化

由圖4可見，與對照組比較，1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素及陽性藥物處理SW-1353細胞后，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達量上升，而N-cadherin、vimentin表達量降低（Plt;0.05）。

3 討論

軟骨肉瘤在早中期因其臨床癥狀不明顯易誤診、漏診，而晚期治療手段有限，具有預后較差、易侵襲和轉移等特征，因此，控制其侵襲與轉移對于治療軟骨肉瘤具有非常關鍵的作用。目前，醫學研究者將目光投向開發防治腫瘤侵襲及轉移相關藥物方向上。作為唇形科香茶屬植物冬凌草的有效成分，冬凌草甲素在多種腫瘤中發揮抗腫瘤活性［5-9］。研究顯示，冬凌草甲素具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡和自噬等作用［10-13］。

然而，冬凌草甲素在人軟骨肉瘤細胞系SW-1353中的研究報道較少，其具體的作用機制也尚未清晰。許多研究對冬凌草甲素抗腫瘤的可能分子機制進行了相關探索。如Jin等［14］的研究表明，冬凌草甲素可抑制骨肉瘤細胞的增殖，并對其凋亡有一定的誘導作用。近年來，同樣也有研究表明，冬凌草甲素在骨肉瘤細胞中具有增殖抑制作用［15-16］。本研究主要為了揭示冬凌草甲素在人軟骨肉瘤細胞系SW-1353中的抗轉移作用。通過CCK-8試驗發現，5.00 μmol/L冬凌草甲素組和陽性藥物組細胞活力明顯降低。在本試驗中1.25、2.50、5.00 μmol/L冬凌草甲素使SW-1353細胞的遷移和侵襲受到抑制，提示其對人軟骨肉瘤細胞SW-1353的侵襲與轉移具有抑制作用。這與李志明等［12］對冬凌草甲素作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞抑制遷移和侵襲的研究結果相似，且陽性藥物組結果與前人研究一致［17］。

惡性腫瘤生長速度快，浸潤轉移能力強，且侵襲與轉移與EMT關系密切。上皮細胞在EMT生物學過程中失去極性，細胞之間的黏附連接性非常低，導致遷移、侵襲能力強，容易發生腫瘤擴散，且在EMT過程中，E-cadherin蛋白減少而vimentin、N-cadherin蛋白增加［18-19］。越來越多的研究表明，EMT在促進腫瘤細胞侵襲和轉移方面發揮重要作用［20］。有研究顯示，在軟骨肉瘤細胞中，EMT的發生能夠促進腫瘤細胞遷移、侵襲［21］。Liu等［22］的報道指出，冬凌草甲素對抑制胰腺癌細胞的EMT進程有抑制作用。相似地，本試驗發現，冬凌草甲素能夠通過上調E-cadherin蛋白，下調N-cadherin和vimentin蛋白抑制SW-1353細胞中EMT的進程。這些結果提示，冬凌草甲素或可通過調控EMT進程抑制軟骨肉瘤細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，一定濃度的冬凌草甲素可減輕SW-1353細胞的遷移和侵襲，它可能是通過調控EMT進程發揮作用的。李志明等［23］的報道指出，冬凌草甲素能夠調控關鍵靶基因表達來抑制乳腺癌遷移、侵襲以及EMT進程，冬凌草甲素對EMT的調控作用與MAPK通路有關，但冬凌草甲素對軟骨肉瘤EMT調控作用機制還有待進一步探究。

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