二甲雙胍介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

摘 要：為探究二甲雙胍介導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，體外培養(yǎng)人腎小球足細(xì)胞（HGPC），利用10、20、30和40 mmol/L D-葡萄糖進(jìn)行干預(yù)，篩選構(gòu)建HGPC高糖炎癥損傷模型的D-葡萄糖最適濃度；再利用20、40、80、160 mmol/L二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)，篩選最適二甲雙胍濃度；隨后將細(xì)胞分為對(duì)照組（Con組）、高糖組（HG組）、二甲雙胍組（Met組，30 mmol/L D-葡萄糖+80 mmol/L二甲雙胍）、抑制劑組（Y組，30 mmol/L D-葡萄糖+1 μmol/L NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082）、二甲雙胍+抑制劑組（Met+Y組，30 mmol/L D-葡萄糖+80 mmol/L二甲雙胍+1 μmol/L BAY 11-7082）和二甲雙胍+激動(dòng)劑組（Met+A組，30 mmol/L D-葡萄糖+80 mmol/L二甲雙胍+1 μmol/L NF-κB通路激動(dòng)劑Prostratin），干預(yù)24 h。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活力；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)炎癥因子水平；Transwell小室法測(cè)定細(xì)胞侵襲和遷移能力；蛋白免疫印跡（WB）法檢測(cè)E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、纖連蛋白（FN）、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：選擇30 mmol/L D-葡萄糖干預(yù)HGPC細(xì)胞24 h以構(gòu)建HGPC高糖炎癥模型，80 mmol/L為二甲雙胍最適濃度；HG組細(xì)胞炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）水平、細(xì)胞侵襲、遷移能力以及N-cadherin、vimentin、FN和p-NF-κB p65蛋白水平高于Con組，E-cadherin蛋白表達(dá)水平低于Con組（Plt;0.05）；與HG組相比，Met組和Y組細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β水平、細(xì)胞侵襲能力、遷移能力、N-cadherin、vimentin、FN和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.05）；與Met組相比，加入BAY 11-7082后，上述指標(biāo)趨勢(shì)更顯著（Plt;0.05），Met+A組趨勢(shì)與Met+Y組相反（Plt;0.05）。二甲雙胍通過阻斷NF-κB通路激活抑制D-葡萄糖誘導(dǎo)的HGPC炎癥反應(yīng)、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，保護(hù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞：糖尿病腎病；二甲雙胍；核因子-κB信號(hào)通路；D-葡萄糖誘導(dǎo)；人腎小球足細(xì)胞炎癥

中圖分類號(hào)： R587.1" " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.03.011

Protective Effects of Metformin Mediated NF-κB Signaling Pathway on Cell Damage in Diabetic Nephropathy

LIU Danyang*， WU Zhenyong， SUN Yaru， CUI Yuxiu

（Department of Laboratory Medicine， the Second Central Hospital of Baoding， Baoding 072750， China）

Abstract： In order to explore the protective effect of metformin mediated nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway on the damage of diabetic nephropathy cells， HGPC cells were cultured in vitro and treated with 10， 20， 30 and 40 mmol/L D-glucose to select the optimal concentration of D-glucose for the construction of HGPC hyperglycemic inflammatory injury model. Then 20， 40， 80 and 160 mmol/L metformin were used for intervention， and the optimal concentration of metformin was screened. The cells were then divided into control group （Con group）， high glucose group （HG group） and metformin group （Met group， 30 mmol/L D-glucose+80 mmol/L metformin）， inhibitor group （Y group， 30 mmol/L D-glucose+1 μmol/L NF-κB pathway inhibitor BAY 11-7082）， metformin+inhibitor group （Met+Y group， 30 mmol/L D-glucose+80 mmol/L metformin+1 μmol/L BAY 11-7082） and metformin+agonist groups （Met+A group， 30 mmol/L D-glucose+80 mmol/L metformin+1 μmol/L NF-κB pathway agonist Prostratin）， intervention was conducted for 24 h. Cell count kit 8 （CCK-8） was used to detect cell viability; the expression levels of inflammatory cytokines were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）; cell invasion and migration were determined by Transwell assay. Western blotting （WB） was used to detect the expression levels of E-cadherin， N-cadherin， vimentin， Fibronectin （FN）， NF-κB p65 and p-NF-κB p65. The results show that： HGPC cells were treated with 30 mmol/L D-glucose for 24 h to construct HGPC hyperglycemic inflammation model， and 80 mmol/L was the optimal concentration of metformin. Compared with Con group， the levels of inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， invasion ability， migration ability， the expression levels of N-cadherin， vimentin， FN and p-NF-κB p65 protein in HG group significantly increased， while the expression level of E-cadherin protein decreased （Plt;0.05）. Compared with HG group， the levels of inflammatory cytokines TNF-α， IL-1β， cell invasion ability， migration ability， the expression levels of N-cadherin， vimentin， FN and p-NF-κB p65 protein in Met group and Y group significantly decreased， and the expression level of E-cadherin protein increased （Plt;0.05）. Compared with the Met group， the above indexes changed more significantly after the addition of BAY 11-7082 （Plt;0.05）， and the trend of Met+A group was opposite to that of Met+Y group （Plt;0.05）. Metformin inhibits D-glucose-induced HGPC inflammatory response， invasion， migration and epithelial-mesenchymal transition process by blocking the activation of NF-κB pathway， and protects podocyte injury induced by high glucose.

Key words： diabetic nephropathy; metformin; nuclear factor-κB signaling pathway; D-glucose induction; inflammation of human glomerular podocytes

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（3）： 275-283）

糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重且普遍的并發(fā)癥之一，最終會(huì)發(fā)展成為慢性腎臟疾病和終末期腎病，嚴(yán)重影響人們的健康，也是全球公認(rèn)的公共健康問題［1］。目前，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活方式的改變，糖尿病腎病的發(fā)病率急劇增加，而中國(guó)傳統(tǒng)的治療方法就是生活干預(yù)、控糖、控血脂等，治療效果都不理想。因此，尋找新的治療方法或藥物意義重大。二甲雙胍（metformin）是公認(rèn)的治療糖尿病的臨床用藥，可通過減少肝糖原異生、提高葡萄糖利用率來發(fā)揮降糖作用［2］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還具有保護(hù)糖尿病腎病病變的作用。Gu等［3］研究發(fā)現(xiàn)，黃葵膠囊聯(lián)合二甲雙胍可降低糖尿病腎病大鼠的血糖含量和尿蛋白水平，改善腎小管損傷和腎小球病變。但二甲雙胍對(duì)人腎小球足細(xì)胞（human glomerular podocytes，HGPC）侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）的影響尚未見報(bào)道。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）最初被發(fā)現(xiàn)存在于B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核中，是重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，NF-κB的失調(diào)與糖尿病在內(nèi)的慢性疾病有關(guān)［4］。糖尿病小鼠體內(nèi)骨骼干細(xì)胞中NF-κB的激活能夠顯著增強(qiáng)體內(nèi)炎癥反應(yīng)［5］。在人腎小管上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)NF-κB p65的去磷酸化能夠減少高糖引起的炎癥反應(yīng)和EMT進(jìn)展，從而減輕糖尿病腎病病變［6］。段艷芳等［7］研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可阻斷NF-κB通路激活，從而抑制妊娠糖尿病大鼠子代胎鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的EMT進(jìn)程。然而，目前對(duì)于二甲雙胍與NF-κB通路的關(guān)系在高糖誘導(dǎo)的HGPC中尚未可知。基于此，本研究探究二甲雙胍對(duì)高糖誘導(dǎo)的HGPC炎癥反應(yīng)、侵襲、遷移和EMT的影響及其作用機(jī)制，為了解糖尿病腎病的體外研究提供新的基礎(chǔ)和方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HGPC購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。二甲雙胍、D-葡萄糖、NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082［生工生物工程（上海）股份有限公司，純度≥98%）］；NF-κB信號(hào)通路激動(dòng)劑Prostratin（阿拉丁，純度≥98%），DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司），青霉素-鏈霉素混合液（雙抗）（以色列Bioind公司）；人源白細(xì)胞介素-6（interleukin，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒（北京貝博生物科技有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］，0.1%結(jié)晶紫水溶液（北京索萊寶科技有限公司），RIPA裂解液、二喹林甲酸（bicinchonic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；鼠抗人［NF-κB p65、p-NF-κB p65、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）及β-actin一抗］、堿性磷酸酶偶聯(lián)親和山羊抗鼠IgG（H+L）（二抗）（美國(guó)CST中國(guó)公司）。MF52-N型倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：IMARK，美國(guó)BIO-RAD公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：BC-J160，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；YY-TII-20型超純水儀（成都優(yōu)越科技有限公司）；Mini-PROTEAN?Tetra小型垂直電泳儀（美國(guó)BIO-RAD）；Gel Doc3000型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將裝有HGPC的凍存管從液氮罐中取出，在37℃預(yù)熱的無菌水浴鍋中快速搖動(dòng)使其融化，凍存管外壁經(jīng)75%酒精滅菌后，在超凈工作臺(tái)中將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至含1 mL DMEM-F12培養(yǎng)基（10% FBS和1%青霉素-鏈霉素混合液）的離心管中，離心后吸除上清液，用適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按照合適的比例接種細(xì)胞后置于37℃、5% CO2、70%～80%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 分組及給藥

將HGPC制備成每毫升含2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板。

HGPC炎癥損傷模型構(gòu)建：將HGPC分為對(duì)照組（Con組）和D-葡萄糖干預(yù)組。Con組用含5 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，D-葡萄糖干預(yù)組分別用含10、20、30、40 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h和48 h后檢測(cè)細(xì)胞活力和炎癥因子IL-6釋放量以篩選最適構(gòu)建HGPC損傷模型的D-葡萄糖濃度。

二甲雙胍試驗(yàn)濃度篩選：將HGPC分為Con組、高糖組（HG組）和二甲雙胍試驗(yàn)組（Met試驗(yàn)組）。Con組細(xì)胞處理如上，HG組細(xì)胞用含上述最適濃度D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，Met試驗(yàn)組是在HG組的基礎(chǔ)上分別加入20、40、80、160 mmol/L二甲雙胍進(jìn)行培養(yǎng)，干預(yù)24 h后檢測(cè)細(xì)胞活力，以篩選二甲雙胍最適作用濃度。

試驗(yàn)分組與干預(yù)：將HGPC分為Con組、HG組、Met組、抑制劑組（Y組）、二甲雙胍+抑制劑組（Met+Y組）和二甲雙胍+激動(dòng)劑組（Met+A組）。Con組和HG組處理如上，Met組是在HG組基礎(chǔ)上加入最適濃度的二甲雙胍，Y組是在HG組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L BAY 11-7082，Met+Y組是在Met組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L BAY 11-7082，Met+A組是在Met組基礎(chǔ)上加入1 μmol/L Prostratin。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，干預(yù)24 h。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

接種細(xì)胞懸液100 μL（每毫升含有2×105個(gè)細(xì)胞）于96孔板，每組做3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好時(shí)給藥，培養(yǎng)一定時(shí)間后向待檢測(cè)細(xì)胞孔中加入體積分?jǐn)?shù)為10%的CCK-8溶液，細(xì)胞與CCK-8試劑在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔細(xì)胞在450 nm處的光密度（optical density，OD）值。細(xì)胞活力/%=（ODD-葡萄糖干預(yù)組或Met試驗(yàn)組/ODCon組）×100%。

1.2.4 ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子表達(dá)水平

收集各組干預(yù)24 h后的細(xì)胞上清液，4 000 r/min離心20 min，離心后保留細(xì)胞上清液并按照IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒說明書操作。取50 μL標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)細(xì)胞上清液分別加入96孔酶標(biāo)板中，再加入100 μL辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)抗體，37℃避光孵育2 h，充分洗滌各待測(cè)孔以去除未結(jié)合的組分；將0.01%過氧化氫和0.1% 的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）等比例混合均勻，取100 μL混合液分別加入待測(cè)孔中，37℃避光孵育1 h，此時(shí)溶液在HRP的催化下變?yōu)樗{(lán)色；再加入50 μL 2 mol/L 稀硫酸終止液終止反應(yīng)，溶液變?yōu)辄S色，終止反應(yīng)后立即在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的濃度。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

取各組干預(yù)24 h后的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，離心，隨即用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，制備成每毫升含5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。將-20℃冰箱中的基質(zhì)膠提前放入4℃冰箱中融化，按照2：1的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠并加入到24孔板上室中，基質(zhì)膠凝固后，取200 μL細(xì)胞懸液接種到Transwell小室的上室中，下室則填充500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基。將上述細(xì)胞遷移體系置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h后，棄上室中的培養(yǎng)基，用棉簽輕柔擦去上室內(nèi)細(xì)胞，用4%甲醇室溫固定30 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphoric acid buffer salt solution，PBS）清洗后用0.1%結(jié)晶紫室溫染色10 min，PBS清洗除去多余的結(jié)晶紫染料，用顯微鏡觀察并隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照記錄細(xì)胞侵襲情況。

1.2.6 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

各組細(xì)胞在藥物干預(yù)24 h后，重懸在無血清的培養(yǎng)基中，并調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升含4.5×105個(gè)細(xì)胞。取200 μL細(xì)胞懸液接種到Transwell小室的上室中，下室則填充500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后參照1.2.5侵襲能力檢測(cè)中的步驟進(jìn)行操作。每孔隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野進(jìn)行拍照記錄。

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western blotting，WB）法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞分組與給藥方法同1.2.2，細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞。各組細(xì)胞在藥物作用24 h后，被RIPA裂解液重懸并裂解；在4℃、12 000 r/min離心10 min后收集上清液，即總蛋白樣品。蛋白樣品先經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（80～120 V恒壓法）進(jìn)行蛋白分離，再經(jīng)過電泳法（300 mA恒流法）進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。載有蛋白的聚偏二氟乙烯膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h后，在4℃進(jìn)行一抗［NF-κB p65（1：2 000）、p-NF-κB p65（1：1 000）、E-cadherin（1：5 000）、N-cadherin（1：5 000）、vimentin（1：20 000）、FN（1：6 000）及β-actin（1：5 000）］孵育過夜或室溫一抗孵育2 h；接下來，進(jìn)行室溫二抗（1：2 000）孵育2 h。封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影之間分別用Tris洗膜緩沖液進(jìn)行3～5次膜洗滌。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，并用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行作圖。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 25.0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用單因素方差分析（多組間）和Dunnett’s t檢驗(yàn)（兩組間）進(jìn)行顯著差異分析，Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外HGPC高糖炎癥損傷模型構(gòu)建

為了篩選構(gòu)建體外HGPC炎癥損傷模型的D-葡萄糖的適宜濃度和干預(yù)時(shí)間，分別用10、20、30、40 mmol/L D-葡萄糖干預(yù)HGPC，檢測(cè)不同濃度D-葡萄糖對(duì)HGPC細(xì)胞活力和炎癥因子IL-6水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，10、20、30、40 mmol/L D-葡萄糖組24 h和48 h后HGPC細(xì)胞活力顯著降低（Plt;0.05），30 mmol/L和40 mmol/L D-葡萄糖組細(xì)胞中炎癥因子IL-6的釋放量顯著高于Con組（Plt;0.05），但干預(yù)24 h時(shí)，40 mmol/L D-葡萄糖組HGPC細(xì)胞活力低于50%。為避免細(xì)胞活力太低影響后續(xù)試驗(yàn)，故選取30 mmol/L D-葡萄糖干預(yù)24 h作為構(gòu)建高糖HGPC炎癥模型的最適條件。具體數(shù)據(jù)詳見圖1。

2.2 不同濃度的二甲雙胍對(duì)高糖誘導(dǎo)的HGPC細(xì)胞活力的影響

HG組細(xì)胞活力較Con組相比顯著降低（Plt;0.05）；與HG組相比，不同濃度的二甲雙胍組細(xì)胞活力均顯著高于HG組（Plt;0.05），其中80 mmol/L二甲雙胍組的細(xì)胞活力最佳，具體數(shù)據(jù)見圖2。因此，本研究選擇作用效果最好的80 mmol/L二甲雙胍用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 二甲雙胍抑制NF-κB通路傳導(dǎo)抑制高糖誘導(dǎo)的HGPC炎癥反應(yīng)

如圖3所示：HG組細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-1β水平顯著高于Con組（Plt;0.05）；Met組和Y組TNF-α和IL-1β水平顯著低于HG組（Plt;0.05）；Met+Y組細(xì)胞TNF-α和IL-1β水平顯著低于Met組（Plt;0.05），而Met+A組細(xì)胞TNF-α和IL-1β水平顯著高于Met組（Plt;0.05）。

2.4 二甲雙胍阻斷NF-κB信號(hào)通路傳導(dǎo)抑制高糖誘導(dǎo)HGPC的侵襲能力

如圖4所示：與Con組相比，HG組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多（Plt;0.05）；Met組和Y組細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)較HG組相比顯著減少（Plt;0.05）；Met+Y組侵襲細(xì)胞數(shù)少于Met組（Plt;0.05），而Met+A組侵襲細(xì)胞數(shù)多于Met組（Plt;0.05）。

2.5 二甲雙胍阻斷NF-κB信號(hào)通路活化抑制高糖誘導(dǎo)HGPC的遷移能力

如圖5所示：與Con組相比，HG組遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加（Plt;0.05）；與HG組相比，Met組和Y組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（Plt;0.05）；與Met組相比，Met+Y組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（Plt;0.05），而Met+A組遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加（Plt;0.05）。

2.6 二甲雙胍對(duì)高糖誘導(dǎo)的HGPC中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

與Con組相比，HG組細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)量顯著降低（Plt;0.05），N-cadherin、vimentin和FN的表達(dá)量顯著升高（Plt;0.05）；與HG組相比，Met組和Y組E-cadherin的蛋白水平顯著升高（Plt;0.05），而N-cadherin、vimentin和FN的蛋白水平顯著降低（Plt;0.05）；與Met組相比，Met+Y組E-cadherin的蛋白水平顯著升高，N-cadherin、vimentin和FN的蛋白水平顯著降低（Plt;0.05），Met+A組E-cadherin的蛋白水平顯著降低，N-cadherin、vimentin和FN的蛋白水平顯著升高（Plt;0.05）。具體數(shù)據(jù)見圖6。

2.7 二甲雙胍對(duì)高糖誘導(dǎo)的HGPC中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

如圖7所示：各組細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（Pgt;0.05）；HG組細(xì)胞中p-NF-κB p65的表達(dá)水平顯著高于Con組（Plt;0.05）；Met組和Y組細(xì)胞中p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平顯著低于HG組（Plt;0.05）；與Met組相比，Met+Y組細(xì)胞中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.05），而Met+A組細(xì)胞中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.05）。

3 討論

研究表明，約20%～40%的糖尿病患者會(huì)發(fā)展成為更為嚴(yán)重的糖尿病腎病，在我國(guó)，糖尿病腎病患者在終末期腎衰竭患者中占比高達(dá)15%，嚴(yán)重影響國(guó)民生活質(zhì)量［8-9］。因此，補(bǔ)充完善糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理，尋找新的有效的預(yù)防和治療糖尿病腎病的生物靶點(diǎn)對(duì)減少糖尿病腎病發(fā)病率和治療糖尿病腎病具有重要的意義。糖尿病腎病患者的主要病理特征是尿蛋白尿，而足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常會(huì)引發(fā)蛋白尿［10］。因此，本研究用HGPC來構(gòu)建高糖損傷模型。將不同濃度的D-葡萄糖作用于HGPC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D-葡萄糖處理24 h和48 h后均可以抑制細(xì)胞活力，且40 mmol/L D-葡萄糖處理24 h后細(xì)胞活力過低，而處理48 h后僅有10 mmol/L D-葡萄糖組細(xì)胞活力高于50%。因此，本研究又檢測(cè)了D-葡萄糖處理24 h后的高糖誘導(dǎo)的HGPC炎癥因子的釋放量，結(jié)果表明，30 mmol/L和40 mmol/L D-葡萄糖顯著促進(jìn)HGPC炎癥因子IL-6的釋放。因此，本研究選擇用30 mmol/L D-葡萄糖作用于HGPC 24 h來構(gòu)建高糖炎癥損傷模型。

二甲雙胍是治療糖尿病的雙胍類藥物，有研究證明，二甲雙胍通過抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移來抑制胃癌進(jìn)程的［11-12］。Wang等［13］研究表明，二甲雙胍持續(xù)給藥后，腎缺血-再灌注大鼠組織中IL-6、TNF-α降低。E-cadherin蛋白的下調(diào)以及N-cadherin、vimentin和FN蛋白的上調(diào)都與EMT進(jìn)程有關(guān)［14-15］，而抑制足細(xì)胞EMT進(jìn)程和炎癥反應(yīng)能夠減緩糖尿病腎病損傷［16］。基于此，本研究探討了二甲雙胍對(duì)高糖誘導(dǎo)的HGPC炎癥反應(yīng)、侵襲、遷移和EMT的影響。將不同濃度二甲雙胍作用于高糖誘導(dǎo)的HGPC后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍顯著促進(jìn)了HGPC活力，其中80 mmol/L二甲雙胍作用效果最好，因此，本研究選擇用80 mmol/L二甲雙胍進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。與Con組相比，HG組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β水平、侵襲能力、遷移能力升高，促進(jìn)了EMT進(jìn)程，提示高糖刺激誘發(fā)HGPC的炎癥反應(yīng)和EMT進(jìn)程，加速糖尿病腎病損傷；與HG組相比，Met組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β水平、侵襲能力、遷移能力降低，抑制了EMT進(jìn)程，更進(jìn)一步證實(shí)了二甲雙胍能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HGPC炎癥反應(yīng)、侵襲、遷移和EMT進(jìn)程，緩解高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，這與既往研究相符［17］。

NF-κB通路是經(jīng)典的炎癥調(diào)控通路，同時(shí)也參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移過程。研究表明，下調(diào)NF-κB信號(hào)通路能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放，促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤凋亡，抑制其遷移和侵襲［18-19］。Zhao等［20］研究證實(shí)，二甲雙胍抑制NF-κB通路激活改善高糖對(duì)人腎上皮細(xì)胞線粒體自噬的抑制作用，從而減少高糖誘導(dǎo)的人腎上皮細(xì)胞凋亡。但目前二甲雙胍通過NF-κB信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的HGPC的炎癥反應(yīng)、侵襲、遷移和EMT進(jìn)程的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究分析了二甲雙胍對(duì)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與Con組相比，HG組細(xì)胞中p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)量顯著升高，提示高糖刺激誘導(dǎo)NF-κB通路激活；而Met組細(xì)胞中p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平降低，說明二甲雙胍可能抑制高糖誘導(dǎo)的HGPC中NF-κB的通路激活。隨后，將NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082和激活劑Prostratin分別作用于Met組細(xì)胞作為Met+Y組和Met+A組進(jìn)行通路驗(yàn)證。結(jié)果表明，與Met組相比，Met+Y組細(xì)胞的炎癥因子TNF-α、IL-1β水平、侵襲能力、遷移能力、N-cadherin、vimentin、FN和p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin的蛋白表達(dá)量顯著升高，而Met+A組細(xì)胞中上述指標(biāo)的趨勢(shì)與Met+Y組相反。這說明二甲雙胍通過阻斷NF-κB信號(hào)通路激活抑制高糖誘導(dǎo)的HGPC的炎癥反應(yīng)和EMT進(jìn)程，從而抑制細(xì)胞侵襲和遷移。

綜上所述，二甲雙胍能夠提高D-葡萄糖誘導(dǎo)的HGPC的細(xì)胞活力，通過抑制D-葡萄糖誘導(dǎo)的HGPC的EMT進(jìn)程抑制細(xì)胞侵襲和遷移，其作用機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路活化有關(guān)。本研究從細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、侵襲、遷移和EMT進(jìn)程方面初步探究了二甲雙胍通過抑制NF-κB信號(hào)通路保護(hù)D-葡萄糖誘導(dǎo)的HGPC炎癥損傷。接下來應(yīng)該更深入研究二甲雙胍是否通過其他通路發(fā)揮糖尿病腎病損傷的保護(hù)作用，以便更透徹地了解糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理，為糖尿病腎病患者的治療提供新的分子靶標(biāo)。

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