植物GYF結構域的進化和功能分析

摘 要：根據GYF結構域蛋白質分布的廣泛性及功能的多樣性，更深入地研究GYF結構域蛋白，并對其進行進化分析是十分必要的。因AtEXA1是植物里研究最為透徹的GYF結構域蛋白，因此，本研究主要聚焦于與AtEXA1類似的蛋白的研究。通過分析真核生物（范圍從單細胞低等真菌到高等生物）中的8 053個GYF結構域蛋白，研究發現類似AtEXA1的蛋白質主要存在于植物物種中，而來自動物的GYF蛋白質與AtEXA1的相似性較低。研究還發現，類似AtEXA1的蛋白質存在于幾乎所有的農作物中。本研究展示了GYF結構域蛋白的保守性，初步解構了GYF結構域蛋白進化的歷程，并為后續對GYF結構域蛋白功能特征的研究提供了啟示。

關鍵詞：GYF結構域；保守性；蛋白進化；蛋白功能

中圖分類號：Q516；Q71" " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.03.008

Evolutional and Functional Analysis of Plant GYF Domains

LU Xun1， LU Jianhua1， PENG Shuming1， XIA Qingzhu1， PENG Bo1， LI Benben3， ZHANG Xiaobo2*

（1. Agricultural Science Academy of Xiangxi Tujia and Miao Autonomous Prefecture， Xiangxi 416000， China; 2. College of Life and Health Science， Kaili University， Kaili 556011， China; 3. Pingjiang County Agriculture and Rural Bureau Plant Protection and Inspection Station， Yueyang 414500， China）

Abstract： According to the extensive distribution of GYF domain proteins and the diversity of its functions， it is necessary to study GYF domain proteins further and conduct evolutionary analysis. Since AtEXA1 is the most well-studied GYF domain protein in plants， this study mainly focuses on the proteins similar to AtEXA1. Analysis of 8 053 GYF domain proteins in eukaryotes ranging from unicellular lower fungi to higher organisms showed that AtEXA1-like proteins are mainly found in plant species， while GYF proteins from animals have low similarity to AtEXA1. It was also found that AtEXA1-like proteins are present in almost all agricultural crops. This study demonstrates the conservation of all GYF domain proteins， initially deconstructs the evolution of GYF domain proteins， and provides implications for subsequent studies on the functional characteristics of GYF domain proteins.

Key words： GYF domain; conserved domain; protein evolution; protein function

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（3）： 253-258）

隨著世界人口的不斷增長，食品安全一直是人類最關注的問題。人類消費的大部分食物直接或間接來自植物，而植物病害每年給人類造成了巨大的損失。植物和病原體之間的斗爭已經持續了數億年，長期以來，植物和病原體的共同進化一直是研究人員關注的熱點。植物已經演化出了精確的防御系統來抵御病原體。核苷酸結合亮氨酸重復結構域蛋白（nucleotide-binding leucine-rich repeat domains-containing proteins，NLRs）是植物防御系統的主要力量［1］。NLRs的穩態平衡至關重要，過多的NLRs會導致自身免疫，產生適應成本［2］。有報道稱，AtEXA1是一種典型的甘氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸（glycine-tyrosine-phenylalanine，GYF）結構域蛋白質，GYF結構域蛋白AtEXA1通過翻譯抑制調節NLRs的穩態平衡，參與植物防御［3］。然而，GYF蛋白在NLRs穩態平衡調節中的案例很少，對其進化進行深入分析了解可能對植物防御研究有很大幫助。

蛋白質間的相互作用涉及到所有生物體內大多數生物學功能的正確執行。蛋白質通常通過結構域-結構域相互作用來識別它們的伴侶。GYF結構域是負責識別富含脯氨酸序列（proline rich sequence，PRS）的保守結構域。在所有PRS識別模式結構域（pattern recognition domain，PRD）中，GYF結構域是最具進化保守性的［4］。作為一種多功能結構域蛋白，GYF結構域蛋白已被報道參與近年來的植物防御。到目前為止，研究者已經發現了數十種含有GYF結構域的蛋白質，其中一些已經被研究鑒定，但目前尚不清楚GYF結構域蛋白為何以及如何參與到如此多重要的生命活動中。

GYF結構域被定義為小型、多功能且保守的接合結構域，可識別PRS［4］。GYF結構域最初在CD2BP2中被識別為接合結構域，負責與T細胞黏附分子CD2的PPG基序結合［5］。此后，更多含有GYF結構域的蛋白質被相繼報道，并基于不同的結合模式被分類為CD2BP2型和SMY2型［4］。有研究提到，存在一組植物特異性的GYF結構域蛋白［6］。研究表明，GYF結構域參與翻譯起始、mRNA剪接、監督和抑制翻譯、泛素連接、信號轉導、免疫蛋白酶調節和動物傷口愈合反應［7-12］。據報道，GYF結構域蛋白還參與植物防御病毒和微生物病原體，并在細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）中發揮作用［13-14］。雖然相關研究報道很多，但仍然缺乏更深入的進化分析和結構分析。在之前的研究中也發現，甘藍型油菜中的部分GYF結構域蛋白編碼基因對核盤菌的入侵有響應［15］。

最初，GYF結構域蛋白根據氨基酸序列的差異被分為兩個主要亞型（CD2BP2型和SMY2型），還有一組植物特異性GYF蛋白［6］。對植物特異性GYF蛋白進化的深入了解，能給研究人員提供更廣泛的GYF域蛋白研究視角，并促進植物GYF蛋白的研究。

AtEXA1被報道參與了擬南芥中的無義介導（nonsense mediated mrna decay，NMD）的RNA降解和細胞程序性死亡［14］。AtEXA1屬于SMY2亞組，盡管與其他SMY2亞組蛋白共享保守的基因序列，但它顯示出與典型的SMY2亞組蛋白更為特殊的保守標志，并且其功能與其他SMY2亞組蛋白有很大的差異。本研究分析了從單細胞低等真菌到高等真核生物的數千個GYF結構域蛋白，通過分析發現了更多來自植物的類似AtEXA1的蛋白。這些結果為更深入理解植物源性的GYF蛋白提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

分類信息從Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）中提取。 GYF蛋白的組成和注釋數據也從此數據庫中下載。

1.2 方法

使用生信分析軟件MEGA X的Muscle方法對序列進行了比對。本研究中的系統發育分析是使用MEGA X的最大似然（maximum likelyhood，ML）算法生成的，并通過5 000次重復的引導分析來構建系統發生樹。本研究中的序列logo是從weblogo網站（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）生成的，餅圖是使用Microsoft Excel軟件生成的，所有圖形都使用Adobe Illustrator軟件進行美化修飾。

2 結果與分析

2.1 GYF結構域蛋白的分類分布

截至2023年3月11日，在Uniprot數據庫中共搜集了8 053個GYF結構域蛋白家族PF02213的序列信息，本研究從中提取了其分類分布結果，如圖1所示。從圖1可以看出，GYF結構域蛋白幾乎全部分布在真核生物中，而在真核生物已知的GYF結構域蛋白序列中，4 739個存在于后鞭毛生物（Opisthokonta）中，2 710個存在于綠色植物（Viridiplantae）中，而僅有545個存在于Sar超組中，其他真核生物分類中僅有少量的GYF結構域蛋白序列。這些數據可以在一定程度上反映GYF結構域蛋白在真核生物中的分布情況。在后鞭毛生物中，動物和真菌占據了大多數，分別為2 582個和2 147個（圖1c）。在兩側對稱動物（Bilateria）中，后口動物（Deuterostomia）和原口動物（Protostomia）共有2 551個GYF結構域蛋白，其中后口動物中有1 681個，原口動物中有870個（圖1d）。在綠色植物中，有2 710個GYF結構域蛋白，其中2 642個在鏈形植物（Streptophyta）中，68個在綠藻（Chlorophyta）中。裸子植物中已知的GYF結構域蛋白序列主要存在于被子植物和五瓣植物中，包括薔薇目（Rosids）、瓜葉菊目（Asterids）、石竹目（Caryophyllales）、景天科（Kalanchoe fedtschenkoi）等，其各自已知的GYF結構域蛋白序列如圖1所示。總之，GYF結構域蛋白是一類廣泛分布于真核生物中的蛋白質，物種多的分支通常擁有更多的GYF結構域蛋白，而高等物種通常擁有更多的GYF結構域蛋白。

2.2 GYF結構域蛋白進化分析

作為一種高度保守的多功能接合結構域，GYF結構域已經引起了人們的廣泛關注。已有多個GYF結構域蛋白被研究和報道，其中人類HsCD2BP2是首個被報道的GYF結構域蛋白，被命名為CD2BP2型GYF結構域蛋白［5］。ScSMY2比HsCD2BP2更早被報道，但該論文沒有提及GYF結構域，因為當時GYF結構域還未被定義［16］。Nishizawa等［5］通過對SWISSPROT和GenBank數據的翻譯序列進行標準BLAST搜索，發現并報道了酵母ScSMY2和另外幾個GYF結構域蛋白。后來，更多的GYF蛋白被報道，如HsGIGYF1/2，它們被報道為與Grb10相互作用的GYF蛋白質［17］。到目前為止，已經有9種GYF蛋白質被報道（表1），其中包括了它們的部分功能。作為唯一被報道的植物GYF結構域蛋白，AtEXA1被報道為PIAMV感染中的一個必要因子［13］，通過結合eIF4E和RPL18具有了翻譯抑制能力［3］，并能限制病原體感染期間的細胞死亡［14］。我們從Uniprot中獲取了8 053個PF02213（GYF結構域蛋白家族）的蛋白序列，它們來自1 047個屬的1 958個物種。由于序列太多，無法進行序列比對和系統發育分析，因此，我們對其中1%的蛋白質序列進行了系統發育樹構建（圖2a）。系統發育樹分為3個主要分支，區分了植物、動物和微生物的GYF蛋白質，并且序列logo顯示了每個分支的GYF結構域區域的保守氨基酸殘基。如圖2b、2c所示，一個結合了序列比對的系統發育樹展示了CD2BP2型和SMY2型GYF蛋白質的系統發育關系和殘基多態性。

2.3 植物GYF蛋白AtEXA1潛在的進化路徑

在幾項研究中均提到了一個植物特異性的GYF結構域蛋白組［3， 6， 14］。報道稱，AtEXA1通過植物與病毒相互作用，在植物防御、R蛋白的穩態調控以及病原體感染期間限制細胞死亡方面具有功能［19］。據報道，AtEXA1通過GYF結構域和PPGF基序與AtSMG7相互作用，并通過與eIF4E和RPL18相互作用，對植物NLR蛋白進行翻譯抑制［6，14］。為了分析植物特異性的GYF蛋白，本研究對植物GYF蛋白進行了深入分析。又因AtEXA1是植物里首次報道的而且也是研究較為透徹的GYF結構域蛋白，所以本研究選擇AtEXA1作為研究植物GYF結構域蛋白的切入點。本研究使用AtEXA1的氨基酸序列進行了UniProtKB數據庫和Swiss-Prot數據庫的BLAST分析，下載了前250個序列，并生成了前100個序列的系統進化樹，它們來自71個物種，展現出了6個主要支系，包括十字花科（Brassicaceae）、菜豆族（Phaseoleae）、殼斗科（Fagales）、薔薇科（Rosales）、無患子目（Sapindales）和茄目（Solanales）（圖3a）。前100個序列中AtEXA1的序列同源性在42.0%～93.5%（圖3a、3d）。前100個序列的序列logo圖顯示高度保守，這意味著很多植物具有AtEXA1直系同源蛋白，其在真雙子葉植物（Eudicotyledon）和百合綱（Liliopsida）植物中廣泛存在（圖3b、3c）。前250個序列來自于122個物種。有趣的是，它們都是植物。我們查看了前250個GYF蛋白的分類分布，真雙子葉植物占據了大部分AtEXA1的同源蛋白，百合科居第2位（圖3b）。十字花科支系包含10個AtEXA1的同源蛋白，它們與AtEXA1的序列相似度非常高，其與AtEXA1的序列同源性在66.2%～93.5%，這表明EXA1的進化與物種的進化相互協調。研究他們的進化關系對各種蔬菜水果及糧食作物的抗病品種改良具有重要意義。

3 討論

GYF結構域是高度保守的接合結構域，存在于幾乎所有真核生物中，它們能夠識別PRS。近年來發現和鑒定了許多含有GYF結構域的蛋白質。AtEXA1是一種典型的GYF蛋白質，它含有一個保守的GYF結構域，并參與了植物對病毒和微生物病原體的防御［5］。

自1998年CD2BP2-GYF首次被鑒定以來，GYF結構域引起了研究人員的關注［20］。GYF結構域蛋白廣泛分布于幾乎所有真核生物中。在人體內，GYF結構域蛋白CD2BP2和GIGYF1/2已經得到深入研究，而植物GYF結構域蛋白則受到研究人員較少的關注。本研究分析了GYF蛋白的進化，并發現了一些植物GYF蛋白的特殊特征，符合研究的預期。高等生物通常擁有更多的GYF蛋白，這是因為高等生物通常具有更復雜的生命活動，而多倍體在高等生物中普遍存在。

大約40億年前，地球上出現了藍藻，標志著植物的誕生［19］。動物的起源可以追溯到大約5.5億年前出現的艾迪卡拉生物群［21］。隨著真菌、植物和動物的出現，它們分別演化出了自己的命運。

AtEXA1是首個被報道的植物GYF結構域蛋白，因此，本研究進行了BLAST搜索其同源蛋白，獲得了前250個相似序列，它們來自122個物種，且都是植物。分析表明，AtEXA1的進化與物種的進化相協調。

本研究構建了GYF蛋白的系統進化樹，顯示了3個分支，區分了植物、動物和微生物的GYF蛋白。對GYF結構域蛋白的分類分布進行分析顯示，高等物種通常擁有更多的GYF結構域蛋白；對GYF結構域蛋白的進化分析顯示，在真核生物中它們的分布與所屬生物界具有相關性。本研究結果對以后各類植物的抗病品種改良具有重要意義。

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