紅嘴鷗和喜鵲的糞便微生物群多樣性比較研究

摘要：

為評估不同種鳥類的病原體傳播風險，提取紅嘴鷗和喜鵲糞便的總DNA，通過PCR擴增16S rRNA序列V3～V4高變區，基于高通量測序和生物信息學研究兩者腸道微生物群差異。研究結果顯示，紅嘴鷗和喜鵲糞便微生物群組成存在顯著差異，兩者糞便中最豐富的細菌門分別是厚壁菌門和變形菌門，前者糞便中絕對優勢屬是Catellicoccus（豐度均值65.5%）。紅嘴鷗樣本中均檢測出彎曲桿菌屬，檢出率100%，豐度均值1.2%；喜鵲樣本檢出率55.6%，豐度均值0.019%。這表明，青島市紅嘴鷗種群廣泛存在彎曲桿菌屬，紅嘴鷗的接觸安全風險高于喜鵲。

關鍵詞：

紅嘴鷗；喜鵲；腸道菌群；高通量測序

中圖分類號：Q938

文獻標志碼：A

文章編號：10061037（2024）03001507

doi：10.3969/j.issn.10061037.2024.03.03

收稿日期：2023-11-26

基金項目：

國家重點研發計劃（批準號：2018YFA0900802）資助；山東省重點研發計劃（批準號：2019JZZY011009）資助；青島市科技計劃重點研發專項（批準號：20-2-3-4-nsh）資助。

通信作者：

王斌，男，博士，教授，主要研究方向為醫學病毒學等。E-mail：wangbin532@126.com

紅嘴鷗（Chroicocephalus ridibundus）是一種廣泛分布于亞歐大陸的候鳥，候鳥的遷徙行為可能導致病原體的遠距離傳播，每年十月紅嘴鷗遷徙至青島市越冬，可能引發病原體傳播的擔憂［1］。紅嘴鷗能夠攜帶多種病原體，包括沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、德爾塔冠狀病毒（Deltacoronavirus，DCoV）和甲型流感病毒等［2-5］。以DCoV為例，鳥類是DCoV的主要宿主，研究發現麻雀和豬DCoV具有進化關系，表明鳥類和哺乳動物存在潛在種間傳播［6-7］。喜鵲（Pica pica）是一種分布廣泛的鴉科鳥類，主要棲息于城市和鄉村，活動范圍較小（約10～50 km），具有機會性捕食和食腐的特點［8］。目前，針對喜鵲的病原體攜帶研究較少，喜鵲作為對照鳥類參與研究，可明確其腸道微生物群構成，突出紅嘴鷗的腸道微生物群特點。因此，本文跨物種比較了紅嘴鷗和喜鵲的腸道微生物群差異，以期評估紅嘴鷗和喜鵲的接觸安全風險，為野生鳥類腸道微生物群研究提供基礎參考。

1" 材料與方法

1.1nbsp; 樣品采集

紅嘴鷗和喜鵲的糞便樣本分別采集于南姜碼頭（120°57′84″ N， 36°09′81″ E）和小麥島地區（120°42′28″ N， 36°06′11″ E），采樣日期為2022年4月4日～2022年4月27日，樣品分多次采集。地面或景觀綠化上鋪設潔凈塑料布，觀察鳥類排泄后，采集新鮮、未被污染且來源明確的糞便樣本于1.5 mL離心管中，放置于冰盒內短期保存。待回實驗室后，保存于-80" ℃超低溫冰箱。共采集12份紅嘴鷗樣本和11份喜鵲樣本。

1.2" DNA提取、聚合酶鏈式反應和高通量測序

通過Omega E.Z.N.A. Stool DNA Kit提取糞便總DNA，采用Qubit 2.0熒光分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質量。用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）擴增16S rRNA基因V3～V4高變區［9］。Polymerase Chain Reaction（PCR）反應體系：2×PCR Master Mix 15 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 10 ng，雙蒸水補足30 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循環；72 ℃延伸5 min。產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，后用Nanodrop定量。PCR產物委托北京貝瑞和康生物技術有限公司建庫后測序。通過TIANSeq快速DNA文庫構建試劑盒建立測序文庫，用Qubit和Agient2100定量并檢測文庫質量，質檢合格的文庫基于Illumina MiSeq平臺測序。

青島大學學報（自然科學版）第37卷

第3期""" 劉文軒等：紅嘴鷗和喜鵲的糞便微生物群多樣性比較研究

1.3" 數據處理和生物信息學分析

Trimmomatic（version 0.33）過濾原始數據，Cutadapt（version 1.9.1）識別和去除引物序列［10-11］。QIIME2（version 2020.6）去噪、拼接序列和去除嵌合體得高質量序列［12］。樸素貝葉斯分類器以Silva.138為參考數據庫完成分類學注釋，在界（Kindom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）7個分類等級統計物種分布［13］。QIIME2以最低樣本序列數總量的95%做標準化處理，以保證樣本間菌群多樣性的可比性。QIIME2用于完成樣本的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。通過Welch′s t-test做兩組間物種豐度的差異分析，Plt;0.05時為具有顯著差異。PICRUSt2預測群落功能［14］。R語言繪制Venn圖，展示共有和特有的組間分類操作單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）。

2" 結果

2.1" 兩組樣本16S rRNA擴增子測序結果

12份紅嘴鷗樣本和11份喜鵲樣本的PCR產物中，分別有10份和9份經瓊脂糖凝膠電泳檢測后質檢合格，并成功建庫。紅嘴鷗樣本共獲得1 044 175條有效序列，喜鵲樣本共獲得831 090條有效序列，分別占原始數據80.5%和70.8%。標準化后樣品測序深度為60 566，總OTUs數量為4 262。由圖1可知，兩組樣本共有及特有的OTUs數目中，紅嘴鷗樣本和喜鵲樣本有628個共有OTUs，分別有1 636個和1 868個特有OTUs。紅嘴鷗樣本中所得OTUs歸類于11個門、39個綱、56個目、271個科、819個屬和877個種，喜鵲樣本中所得OTUs歸類于12個門、34個綱、37個目、312個科、1 067個屬和731個種，無法鑒別的OTUs數目分別占OTUs總數5.0%和7.1%，表明測序質量良好。隨著測序數據量增加，稀釋性曲線趨于平坦，表明測序數據量充足（圖2）。

2.2" 兩組樣本微生物群多樣性分析

Alpha多樣性反映樣品的物種豐度和物種多樣性，其中ACE和Chao1指數反映樣品物種豐度，Simpson和Shannon指數反映樣品物種多樣性。由表1可知，所有Alpha多樣性指數覆蓋率均大于99.9%。喜鵲樣本ACE、Chao1、Simpson和Shannon指數均略高于紅嘴鷗樣本，表明喜鵲糞便微生物群豐富度和多樣性略高，但兩組間差異不顯著（Kruskal-Wallis秩和檢驗，Pgt;0.05）。由圖3可知，Beta多樣性反映兩組間微生物群落差異，基于bray-curtis距離的主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA），紅嘴鷗樣本和喜鵲樣本Beta多樣性存在顯著差異（Kruskal-Wallis秩和檢驗，P=0.000 327）。

2.3" 兩組樣本微生物群組成分析

門水平上，紅嘴鷗樣本和喜鵲樣本分別鑒定出11個菌門和12個菌門（圖4（a））。紅嘴鷗樣本的優勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes，77.00%）、變形菌門（Proteobacteria，12.35%）和擬桿菌門（Bacteroidota，3.24%）；喜鵲樣本的優勢菌門為Proteobacteria（50.89%）、Firmicutes（42.00%）和放線菌門（Actinobacteriota，4.22%）。紅嘴鷗樣本中梭桿菌門（Fusobacteriota）、泉古菌門（Crenarchaeota）、Firmicutes和熱脫硫桿菌門（Desulfobacterota）的豐度顯著高于喜鵲樣本；而喜鵲樣本中Actinobacteriota、Proteobacteria和Bdellovibrionota豐度顯著高于紅嘴鷗樣本（圖4（b））。

屬水平上，紅嘴鷗樣本和喜鵲樣本分別鑒定出819個菌屬和1 067個菌屬，其中67個菌屬存在顯著豐度差異（圖5（a））。Catellicoccus是紅嘴鷗樣本的主要菌屬，平均豐度占比65.5%，部分樣本豐度占比超過90%。豐度大于1%的菌屬中，紅嘴鷗樣本中Catellicoccus豐度顯著高于喜鵲樣本，而喜鵲樣本中Rickettsiella、Sarcina、腸球菌屬（Enterococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）豐度顯著高于紅嘴鷗樣本（圖5（b））。此外，紅嘴鷗樣本中重要人畜共患病病原體彎曲桿菌屬（Campylobacter）豐度顯著高于喜鵲樣本。10份紅嘴鷗樣本均檢出Campylobacter，豐度均值1.2%；9份喜鵲樣本中5份檢出Campylobacter，豐度均值0.019%。

2.4" 兩組樣本微生物群功能預測

PICRUSt2預測發現，紅嘴鷗樣本和喜鵲樣本微生物群功能存在差異，主要功能差異集中于KEGG一級分類中人類疾病（Human diseases）、環境信息處理（Environmental information processing）、細胞過程（Cellular processes）、代謝（Metabolism）和有機系統（Organismal systems）。而在細分的KEGG二級分類中，紅嘴鷗糞便微生物群的細菌性傳染病（Infectious disease： bacterial）、膜運輸（Membrane transport）、核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）和轉錄（Transcription）功能顯著高于喜鵲（圖6）。

3" 討論

野生鳥類糞便樣本采樣困難，導致微生物群相關研究較少。由于飲食結構和物種的差異，紅嘴鷗和喜鵲的糞便微生物群構成存在明顯區別。研究發現，紅嘴鷗糞便微生物群中的Catellicoccus marimammalium平均豐度為67.5%，是紅嘴鷗糞便微生物群的核心菌種。Catellicoccus菌屬最初分離自鼠海豚和灰海豹，屬于腸球菌科（Enterococcaceae），Catellicoccus marimammalium是Catellicoccus菌屬的唯一種［15］。與以

往研究相似，Catellicoccus marimammalium是紅嘴鷗腸道內的絕對優勢菌種，同樣是鷗科動物腸道微生物群的特征性物種。海鷗糞便污染是部分沿海地區糞便污染的常見來源。Catellicoccus marimammalium能夠用于海水糞便污染溯源，該菌種富集提示海鷗來源的糞便污染，而腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細菌富集提示人源糞便污染［16］。通常人源糞便污染的安全風險高于海鷗來源，明確海水糞便污染來源對風險評估具有重要意義，能減少諸如非必要海灘關閉等引發的經濟損失。

沙門氏菌屬（Salmonella）和Campylobacter是鳥類攜帶的兩種最重要人畜共患病病原體之一，鳥類通過排出帶菌糞便污染農田和水源，進而引發跨物種傳播風險［17］。海鷗的棲息范圍與人類存在較大重疊，已發現部分海鷗物種攜帶Salmonella和Campylobacter病原體［18-19］。紅嘴鷗樣本和喜鵲樣本中均未檢出Salmonella，所有紅嘴鷗樣本中均檢出Campylobacter。Campylobacter是發達國家和發展中國家消化道傳染病的重要原因［20］。除經典的空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）外，其他新發現的Campylobacter成員Campylobacter concisus和Campylobacter ureolyticus等均具有臨床重要性，而禽類是彎曲桿菌向人類傳播的主要宿主和傳染源［21］。流行病學方面，2017～2019年北京市感染性腹瀉細菌病原譜的調查發現，18 182例腹瀉患者中4 025例腸道致病菌檢測呈陽性，共分離到4 202株陽性菌株，其中彎曲桿菌539株，占比12.83%［22］。全國范圍內的急性腹瀉監測發現，Campylobacter jejuni和結腸彎曲桿菌（Campylobacter coli）年齡標準化陽性率分別為1.11%和0.21%，僅次于13種常規監測病原菌中的致瀉性大腸埃希氏菌（7.41%）、非傷寒沙門氏菌（4.90%）和副溶血性弧菌（1.80%）［23］。盡管彎曲桿菌感染病死率較低，但可引起部分慢性消化道疾病，包括炎癥性腸病和腸應激綜合征等，其長期感染與嚴重神經系統疾病格林-巴利綜合征相關［24-26］。因此，需要持續關注彎曲桿菌的流行特征。Campylobacter在青島市紅嘴鷗種群中廣泛存在且豐度較高，與紅嘴鷗的接觸可能增加Campylobacter的傳播風險。

4" 結論

本文分析了野生狀態下紅嘴鷗和喜鵲的糞便微生物群組成及多樣性，發現兩種鳥類腸道菌群結構存在顯著差異，并鑒定各自優勢的分類單元。組成分析和功能預測發現紅嘴鷗致病菌Campylobacter的豐度顯著高于喜鵲，提示接觸紅嘴鷗安全風險高于喜鵲。后續研究將考慮從紅嘴鷗糞便中分離Campylobacter細菌，通過藥敏試驗和毒力分析評價其致病潛力，并持續監測紅嘴鷗中彎曲桿菌的流行特征，為減少紅嘴鷗來源彎曲桿菌的暴露風險提供理論指導。

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Comparative" Study on the Fecal Microbiota Diversity of" Black-Headed Gull and Magpie

LIU Wen-xuan， YANG Xiao-li， LI Zong-hui， WANG Bin

（School of Basic Medicine， Qingdao University，Qingdao 266000， China）

Abstract：

Total DNA from fecal samples were extracted and the V3～V4 hypervariable region of the 16S rRNA sequence was amplified to assess the potential risk of bird-to-human pathogen transmission in different bird species. Gut microbiota characterizations were determined with high-throughput sequencing and the followed bioinformatical analyses. The results show remarkable differences in the fecal microbiota between black-headed gulls and magpies. Firmicutes and Proteobacteria are the primary bacterial phyla in black-headed gull and magpie feces， respectively. Catellicoccus is the predominant genus in black-headed gull feces， and the average abundance is 65.5%. The detective rate of Campylobacter in black-headed gull feces is 100%， and the average abundance is 1.2%. But in magpie feces， the detective rate is 55.6%， and the average abundance is 0.019%. This suggests that Campylobacter is widespread in the population of black-headed gull in Qingdao， and the safety risk of exposure to black-headed gulls is higher than magpies.

Keywords：

black-headed gull; magpie; intestinal microbiota; high-throughput sequencing