新生大鼠缺氧缺血性腦病中miRNA表達譜的改變及分析*

袁 昊,李 婷,張騰偉,肖 娟,楊 劉,黎 巧,阮 滔,朱 昉,肖詠梅,彭湘蓮

湖南省婦幼保健院新生兒一科,湖南長沙 410000

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指足月和近足月新生兒由于圍生期缺氧導致的急性腦損傷。我國報告HIE發生率為活產嬰兒的3‰～6‰,其中15%～20%患兒在新生兒期死亡,存活者中有25%～30%可遺留嚴重的神經功能障礙,包括腦癱、癲癇、視聽障礙、認知障礙、行為異常等,成為影響我國兒童生活質量的重要疾病之一[1-2]。因此,積極研究HIE的發生機制、早期診斷及針對性干預治療,在臨床上具有重大意義。microRNA(miRNA)是一種內源性非編碼RNA(由18～23個核苷酸組成),其功能廣泛,參與細胞周期、增殖和分化、信號傳導和凋亡等過程[3]。有研究證明,許多miRNA在神經系統損傷修復過程中發揮重要的調控作用[4],將成為HIE具有潛力的治療靶點及有效的生物預測指標。本研究利用基因芯片技術,分析出新生大鼠HIE中差異表達的miRNA,篩選特異性的miRNA,探討其可能的發生機制,為HIE的機制研究、臨床診斷及藥物設計提供理論依據和新的治療思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 7 d齡SD大鼠12只,雌雄不限,體質量12～16 g,購自廣東省實驗動物檢測所。隨機分為HIE組及假手術對照組,每組6只。

1.2主要材料及儀器 基因芯片篩選miRNA由新開源晶銳(廣州)生物醫藥科技有限公司完成。

1.3方法

1.3.1造模 采用Rice法制作HIE模型:7 d齡SD新生大鼠乙醚吸入麻醉后,仰臥位固定于手術臺,消毒切開頸部皮膚,分離左側頸總動脈并在遠、近心端進行雙結扎,縫合切口,術后放入37 ℃恒溫箱中30 min,以1.5 L/min不斷輸入含8%氧氣和92%氮氣的低氧氣源2 h。假手術對照組:7 d齡SD新生大鼠只游離左側頸總動脈穿線但不結扎,縫合傷口后不進行缺氧處理。兩組手術時間均低于10 min,環境溫度26～28 ℃。造模后觀察新生大鼠行為情況。

1.3.2取新生大鼠海馬組織 造模后24 h,取海馬組織。給予新生大鼠乙醚吸入麻醉,在低溫環境下快速斷頭取腦,冰上分離海馬組織。將左右兩側海馬放入凍存管中,液氮速凍后放入-80 ℃低溫冰箱備用。

1.3.3基因芯片篩選差異性miRNA 取新生大鼠海馬組織,采用Trizol法進行樣品的總RNA抽提純化并質檢。將提取的總RNA送檢,進行微陣列雜交、芯片掃描,利用生物信息軟件篩選顯著差異的miRNA。本實驗采用illumina Hiseq測序平臺的單端50 bp測序模式對樣本進行高通量測序。原始數據需經過引物與adaptor序列去除,并經過對測序片段堿基的質量檢驗和長度篩選,最終選擇質量可靠的測序片段。將每個樣本的reads比對到已有的miRNA數據庫(miRBase)和新miRNA預測的結果上,從而計算miRNA表達量。利用DESeq軟件進行差異表達分析,篩選差異表達的miRNA,計算每個樣本的表達量和組內均值,并且計算組間差異Fold Change,再計算log2(Fold Change)用于后續篩選差異基因。

1.3.4目的基因GO功能集分析及富集分析 將全部基因作為背景列表,目的基因列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表,利用Fisher精確檢驗計算GO功能集在目的基因列表中是否顯著富集的P值,再對P值經Benjamini &Hochberg多重檢驗糾正后得到FDR。針對這些基因進行KEGG數據庫中通路的功能注釋和歸類,以及DisGeNET疾病數據庫中疾病類型的功能注釋和歸類。

1.4統計學處理 利用Seqtk(1.0-r82-dirty)對預處理數據進行質量控制分析。序列比對使用Bowtie(1.0.0)軟件分析,采用DESeq軟件進行差異表達分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1行為學評估 HIE組術后1只新生大鼠表現為持續精神萎靡,其余5只均出現先興奮后抑制行為:首先躁動不安;術后30 min,出現呼吸增快、站立不穩、全身震顫癥狀;術后1 h,出現精神萎靡、嗜睡、易激惹、夾尾左旋癥狀。假手術對照組活動正常。

2.2miRNA檢測結果分析

2.2.1測序數據質控 針對每個樣本預處理后所有序列和去重復后的唯一序列,分別采用bowtie軟件與該物種的參考基因組、Rfam序列數據庫、RepBase序列數據庫、miRBase數據庫進行比對,平均質控率大于89.00%,平均對比率約為47.96%,所獲得數據能滿足進一步分析要求。

2.2.2差異表達的miRNA 通過比較兩組miRNA表達量,利用DESeq軟件對兩組進行差異表達分析,篩選出共22個表達存在差異的miRNA,HIE組表達上調的miRNA共9個(mmu-miR-215-5p,mmu-miR-1249-3p,mmu-miR-3072-5p,mmu-miR-324-3p,mmu-miR-690,mmu-miR-874-5p,11_10767,11_10888,13_12928_star),表達下調的miRNA共13個(mmu-miR-141-3p,mmu-miR-182-5p,mmu-miR-183-5p,mmu-miR-190a-3p,mmu-miR-200a-3p,mmu-miR-200b-3p,mmu-miR-200c-3p,mmu-miR-429-3p,mmu-miR-455-3p,mmu-miR-760-5p,mmu-miR-96-5p,6_5971_star,9_8784),見圖1和表1。當滿足P<0.05并且|log2(Fold Change)|≥0.58時,認為該基因表達在組間差異有統計學意義。

表1 HIE組與假手術對照組差異性miRNA篩選

圖1 HIE組與假手術對照組對比的火山圖

2.2.3差異性miRNA的靶基因預測及富集分析 使用miRanda對差異表達的miRNA進行靶標預測,共得到1 495個靶基因。針對目的基因集,采用TopGO軟件進行GO功能分析。圖2展示預測靶基因在生物過程、細胞組成、分子功能的前10個最顯著的GO。結果顯示差異miRNA調控基因在生物過程中主要參與調節生物生長發育、神經元形成與分化過程,在細胞組成中主要與突觸發生、突觸可塑性有關,在分子功能中調節蛋白結合、酶結合及谷氨酸受體活性等。

注:橫坐標代表-lg(P值),縱坐標代表顯著富集的GO名稱。圖2 顯著富集GO柱狀圖

針對這些基因進行KEGG數據庫中通路的功能注釋和歸類。圖3顯示富集到的主要通路有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、神經節鞘磷脂生物合成、細胞內吞作用等。其中以MAPK信號通路最為顯著,HIE組表達上調的11-10767及mmu-miR-874-5p調控的8個靶基因(Braf,Mapt,Ppp5c,Mapk8ip2,Fgf6,Flt1,Ngfr,Tgfb1 )共同參與此信號通路。

注:橫坐標代表顯著富集的KEGG通路名稱,縱坐標代表-lg(P值)。縱坐標越顯著表示該通路越富集顯著,紅色柱表示顯著的通路(P<0.05),藍色柱表示不顯著的通路。圖3 顯著富集KEGG通路柱狀圖

3 討 論

新生兒HIE病理生理改變主要包括腦血流低灌注或過度灌注、腦細胞能力代謝障礙、自由基損傷及神經元壞死或過度凋亡等。臨床治療策略主要通過增加氧分壓、維持腦血流灌注等多方法聯合治療,但不能有效阻斷神經損傷。如何進行早期診斷及高效治療,最大程度上減少后遺癥發生,是近年來國內外研究熱點。miRNA被認為參與多種疾病的發病機制,能夠通過轉錄后調控靶基因的表達來調節不同的細胞過程[5],可用于疾病分子生物診斷、靶向治療和評估。目前,已有大量研究證明,miRNA在HIE損傷修復過程中發揮重要的調控作用,將有助于新生兒HIE早期診斷、評估預后及靶向治療[6-7]。

本研究通過構建HIE新生大鼠模型,在HIE發生24 h進行基因測序,共篩選出22個表達差異的miRNA,其中9個表達上調,13個表達下調。通過靶基因預測,將目的基因進行GO功能富集分析,顯示調控基因主要涉及調節生物生長發育、神經元形成與分化的過程,促進突觸發生。因此,筆者推測在HIE發生腦損傷早期,miRNA大多富集在與神經元功能相關的生物通路中,修復受損神經元。

在HIE表達上調的miRNA中,mmu-miR-215-5p差異倍數最為明顯,大量研究認為,其參與調控腫瘤發生、發展。在非小細胞肺癌,miR-215-5p通過調控MAPK/ERK信號通路靶向調節ZEB2表達,參與細胞凋亡及死亡[8]。在惡性胸膜間皮瘤中,miR-215-5p通過激活基因p53功能,參與DNA損傷修復、細胞周期調控、細胞凋亡及抑制血管生成等過程,其低表達與該疾病不良預后有關[9]。在其他腫瘤疾病如乳腺癌、結腸直腸癌、髓系白血病等中均有異常表達[10]。本研究中發現mmu-miR-215-5p表達明顯上調,考慮可能參與缺氧缺血損傷后神經元凋亡及死亡的調控機制,需進一步研究驗證,其有望成為評估HIE的生物標志物。

在HIE表達下調的miRNA中,miR-200家族最為明顯。miR-200家族成員包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429,其參與多種疾病的發病機制,包括神經退行性病變、纖維化、腫瘤等[11]。在缺氧缺血發生后,少突膠質前體細胞迅速反應、增殖、遷移到損傷部位,分化為成熟的少突膠質細胞,包繞軸突形成髓鞘,促進神經修復。在腦卒中的研究中發現,miRNA-200過表達可抑制血清反應因子表達,從而抑制少突膠質前體細胞分化[12]。在缺氧研究中發現,抑制miRNA-200表達可誘導內皮細胞血管生成,改善組織缺氧[13]。由此可見,miRNA-200參與神經系統損傷修復的病理過程。本研究發現miRNA-200表達下調,GO功能富集提示主要與神經元形成與分化有關,推測新生大鼠神經系統損傷后,機體修復神經元及促進血管生成,與上述研究結論一致。故本研究認為,miR-200家族有望成為HIE治療靶點之一。

在HIE中KEGG通路分析結果顯示MAPK信號通路激活。MAPK家族主要包括細胞外調節蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK),通過調節細胞內相關基因轉錄,參與細胞增殖、分化、癌變、轉移、凋亡等生理過程,介導生長發育、炎癥反應等[14]。研究表明,MAPK參與調節腦缺血再灌注損傷的發生、發展過程,但存在腦保護及腦損傷雙重作用[15-16]。本研究發現HIE組表達上調的11-10767及mmu-miR-874-5p調控的8個靶基因(Braf,Mapt,Ppp5c,Mapk8ip2,Fgf6,Flt1,Ngfr,Tgfb1 )共同參與此信號通路,可為治療靶點提供參考方向。

綜上所述,本研究初步篩選出HIE中差異miRNA表達譜,構建靶基因調控網絡,提示HIE發生機制復雜多樣,需進一步對差異表達的miRNA進行驗證、分子機制及信號通路調控的研究。隨著不斷發現及深入研究miRNA及其靶位點,miRNA在HIE中發揮的作用將逐步被揭開,分子機制也將逐漸闡明。這將為HIE找到新的生物標志物和治療靶點提供思路及理論基礎。