HPLC同時測定明目益睛丸中5種有效成分含量

楊春紅，李 睿，趙 琪，石倩，劉雅琴，賴先榮，李姝

明目益睛丸是由眉山市中醫醫院自制的院內制劑，由鹽菟絲子、五味子、青皮、鹽車前子、三七等10味中藥材組成，具有滋陰補肝腎、益氣生津的藥用功效。該方臨床用于治療肝腎虧虛，目失濡養所致的近視、糖尿病性視網膜病變、視網膜脫離、視神經萎縮等各類眼病[1-2]。作為經驗方劑，目前對其質量控制系統研究較少。根據現有藥理研究，菟絲子補益肝腎，明目，主要成分金絲桃苷可抗肝損傷、保護腎臟，還能改善糖尿病高血糖引起的視網膜病理損傷[3]；五味子補虛益目，五味子醇甲具有保肝護肝、抗炎作用[4]；青皮理氣，橙皮苷參與抗炎、保肝作用[5]；車前子利水清熱明目，毛蕊花糖苷具有明顯的抗炎及肝保護作用，還可改善腎功能[6]；三七行血氣，其中人參皂苷Rg1作為主要藥效成分可保護視網膜、顯著護肝及抗炎[7]。為對明目益睛丸進行質量控制，本實驗以上述5種物質作為明目益睛丸的有效成分，建立高效液相色譜法含量測定方法，為后續質量標準研究提供科學依據及參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），HTP-312型電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆?，BSA124S型電子分析天平、CPA225D型電子分析天平均購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，KQ-50B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），RATK060L0樂楓超純水系統（上海樂楓生物科技有限公司）

圖1 專屬性試驗HPLC圖A. 空白溶液；B. 混合對照品溶液；C. 供試品溶液；D. 缺鹽菟絲子陰性對照溶液；E. 缺鹽車前子陰性對照溶液；F. 缺青皮陰性對照溶液；G. 缺三七陰性對照溶液；H. 缺五味子陰性對照溶液1.金絲桃苷；2.毛蕊花糖苷；3. 橙皮苷；4.人參皂苷Rg1；5.五味子醇甲

1.2 試劑與對照品

明目益睛丸（自制，批號M Z 2 2 111 8-1、MZ221118-2、MZ221118-3），乙腈及甲醇為色譜純，均購于Sigma（中國）有限公司；磷酸（色譜純）、甲醇（分析純）均購于成都市科隆化學品有限公司。

對照品由成都德思特生物技術有限公司提供，純度均大于98.0%：金絲桃苷（批號：DST210912-023）、橙皮苷（批號：DST220704-038）、五味子醇甲（批號：DSTDW001001）、毛蕊花糖苷（批號：DSTDL006101）、人參皂苷Rg1（批號：DSTDR000902）

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate?ODS-3（4.6×250 mm，5 μm），柱溫30℃，流速：1 mL/min，進樣量：10 μL，檢測波長：203 nm，洗脫序列見表1。

表1 流動相梯度洗脫時間表

2.2 溶液制備

對照品溶液制備：精密稱取金絲桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人參皂苷Rg1適量，甲醇稀釋，制成質量濃度分別為0.530 mg/mL、0.517 mg/mL、0. 871 mg/mL、0.556 mg/mL、0.744 mg/mL，作為對照品儲備液。分別精密移取上述各儲備液適量，甲醇稀釋制成質量濃度為0.0530 mg/mL、0.0510 mg/mL、0.0871 mg/mL、0.0556 mg/mL、0.0744 mg/mL混合對照品溶液。

供試品溶液制備：取自制明目益睛丸粉末2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入85%甲醇40 mL，稱重，超聲50 min，放冷，用85%甲醇補足重量，搖勻，濾過，取續濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

陰性對照品溶液制備：按處方比例，分別取缺鹽菟絲子、五味子、青皮、鹽車前子、三七采用同供試品制備工藝，制備陰性樣品后，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶液與2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。由圖1可知，各成分峰形完整，與其他相鄰峰分離度均大于1.5，且空白溶液及陰性對照品相應位置處無干擾峰出現，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性試驗 精密量取2.2項下對照品溶液，加甲醇適量稀釋成系列梯度，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，并記錄峰面積。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），結果見表2，各成分r均大于0.9995，表明線性關系良好。

表2 線性試驗結果

2.3.3 精密度試驗 照2.2項下制備供試品溶液，于同一天內連續進樣6次，記錄峰面積。結果，金絲桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人參皂苷Rg1峰面積的RSD均小于3%，分別為0.71%、0.74%、2.24%、0.20%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，放置0、2、4、6、8、12、18、24 h后，照2.1項下進樣測定并記錄峰面積。結果，5個化學成分峰面積的RSD均小于3%，依次為0.46%、0.74%、0.20%、0.52%、1.89%，說明該方法在24 h內穩定性較好。

2.3.5 重復性試驗 精密稱取同一批次明目益睛丸樣品共6份，按“2.2”項下制備供試品溶液，照“2.1”項下條件進樣測定，并記錄峰面積。根據線性曲線方程計算各成分含量。結果見表，5種成分的RSD均小于3%，表明該方法重復性較好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的明目益睛丸6份，每份約1.0 g，精密稱定，按已知含量的100%加入混合對照品，照2.2項下方法制備供試品溶液，同2.1項下進樣條件進行測定，計算加樣回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）

2.4 含量測定

取3批自制明目益睛丸，按2.2項下制備供試品溶液后，照2.1項下進樣條件進行含量測定，各批次平行測定3次，5種有效成分平均含量結果見表4。

表4 5種有效成分含量測定結果（n=3）

3 結論與討論

本實驗采用HPLC同時測定明目益睛丸中金絲桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人參皂苷Rg1成分含量。該檢測方法下各成分線性曲線相關系數≥0.9995，精密度、重復性及穩定性的RSD值均小于3%，加樣回收率在90%～110%之間，表明該方法穩定可行。

在測定各成分含量時，對流動相進行了考察，選擇乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水進行梯度洗脫，結合峰形分離度及響應值等因素，最終確定以乙腈-0.1%磷酸水作為本實驗流動相條件。同時分別對柱溫25℃、30℃、35℃及流速0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min進行考察，確定以柱溫30℃、流速1 mL/min作為此實驗的進樣條件。

本實驗所建立的方法重現性好、穩定可靠，為明目益睛丸的有效成分含量測定提供了簡便方法，同時為相關質量標準的進一步研究提供科學依據及實驗基礎。