基于深度學習的SMYD2抑制劑的篩選與活性評價

摘要： 使用2個深度學習模型（Chemprop和RTMScore）從TopScience商業數據庫中篩選潛在的SMYD2抑制劑，再使用CCK-8法測定化合物抑制活性，并分別采用細胞克隆和細胞劃痕實驗測定化合物抗A549細胞增殖、遷移能力，最終用細胞熱轉移實驗和蛋白質印記實驗驗證化合物5與蛋白質的結合能力。結果表明，深度學習模型篩選出的化合物5對A549細胞增殖具有明顯抑制作用（抑制率≥ 80%），IC50為10.89 μmol/L；給予10 μmol/L的化合物5后，A549細胞的克隆形成數和遷移面積均明顯少于對照組（Plt;0.05）。細胞熱轉移實驗證明化合物5與SMYD2能夠結合。

關鍵詞： 深度學習；SMYD2抑制劑；增殖抑制

中圖分類號： R914""""""" 文獻標志碼： A

隨著以組蛋白修飾酶為靶點的抗腫瘤藥物（如伏立諾他、他澤司他等）在臨床上的應用，組蛋白修飾引起了越來越多的關注。蛋白質賴氨酸甲基轉移酶SMYD2（SET和MYND結構域蛋白2）已被證實在肺癌、胃癌、結直腸癌等多種腫瘤中表達上調。然而，關于SMYD2的各種生物學功能尚未得到充分的研究。生物學功能的不明確限制了抑制劑的開發，導致缺乏有效的靶向SMYD2的小分子抑制劑。因此，靶向SMYD2抑制劑研究成為一個熱點方向。迄今為止所有報道的SMYD2抑制劑仍處于臨床前水平，主要包括三種作用模式^［1］： 底物競爭性（包括AZ505、LLY-507和BAY-598等）、底物非競爭性和SAM非競爭性（EPZ033294和EPZ032597）、SAM競爭性抑制劑（PFI-5，結構見圖1）。但大多數抑制劑沒有表現出令人滿意的增殖抑制活性，造成這種細胞增殖表型差異的原因尚不完全清楚。其中LLY-507是第一個被報道具有高細胞活性的SMYD2抑制劑^［2］。雖然LLY-507對SMYD2的選擇性是對SMYD3、SUVH420H1和SUV420H2在內的24種蛋白質的100倍^［3］，但是，LLY-507對240個癌癥細胞系均具有抗增殖能力^［4］，包括低表達SMYD2的癌細胞系，這表明LLY-507的活性可能是由其脫靶效應而不是對SMYD2的抑制作用引起的。而EPZ033294和EPZ032597等抑制劑對癌細胞沒有增殖抑制作用，因此尋找靶向SMYD2新型抑制劑迫在眉睫。

高通量篩選和虛擬篩選是普遍的尋找新化合物的方式，而虛擬篩選更加高效且節約成本。其中深度學習神經網絡具有特征學習的特點，通過神經網絡逐層特征變換，將化合物的原本的特征表示變換成新的特征表示以便于篩選，因此基于深度學習的虛擬篩選可快速獲得結構多樣的命中化合物。本研究利用兩種深度學習模型（Chemprop和RTMScore）對超過1.95億個化合物進行虛擬篩選（圖2），并挑選潛在的命中化合物進行腫瘤細胞抑制活性、增殖和遷移能力驗證。

1 基于深度學習模型的篩選

1.1 數據庫的準備

首先，從ChEMBL和BindingDB數據庫中下載化合物2D結構，去除重復結構后共獲得509個化合物。為了擴大化合物的化學覆蓋空間，采用隨機SMILES（randomized SMILES）模型^［5-6］將原數據集擴大10倍，去重復后剩余5513個化合物，包括3311個陽性數據（SMYD2 IC50 ≤ 1 μmol/L）和2202個陰性數據（SMYD2 IC50gt;1 μmol/L）。該數據集以8∶1∶1的比例被分割為訓練集、驗證集和測試集。

TopScience提供超1.09億個化合物的數據庫，為了加速虛擬篩選過程，采取如下規則^［7-11］進行初步過濾： （1）移除泛活性篩選干擾化合物（PAINS）；（2）基于Lipinski規則，移除分子質量gt;500 u、氫鍵給體數gt;5、氫鍵受體數gt;10、脂水分配系數gt;5、可旋轉鍵gt;10、拓撲極性表面積gt;150 ²的化合物；（3）以功能類指紋（FCFP_4）為標準，移除與訓練集化合物相似性（Tanimoto參數）小于0.6的化合物。最后，篩選數據集共剩余1 395 937個化合物。

1.2 Chemprop模型

Chemprop模型以定向信息傳遞深度神經網絡模型（D-MPNN）為主要組成部分，通過迭代地聚集分子中單個原子和鍵的特征來構建新的分子特征（圖卷積和描述符的混合分子特征），完成分子信息從圖形到連續向量的轉換。采用Chemprop模型^［12］構建分類模型^［13-15］，并對篩選數據集進行預測。模型篩選化合物得到的預測分數越高，化合物能夠抑制SMYD2的概率越高。

1.3 RTMScore模型

RTMScore模型分為三個模塊： 特征提取、特征拼接以及混合密度網絡（MDN）。該模型通過Graph Transformer對蛋白殘基以及配體原子的節點特征進行提取，并通過MDN獲取各個蛋白殘基和配體原子的距離的概率密度分布，并將其轉化為統計勢以用于蛋白-配體間的結合強度的評估。使用RTMScore模型首先需要在對接程序AutoDock Vina^［16］中生成化合物的潛在結合模式，每個配體最多保留10個構象；然后通過RTMScore^［17］對這些構象進行重新評分。RTMScore評分最高的構象通常被認為是最合理的結合構象。

2 化合物5的活性驗證

2.1 A549細胞培養

人非小細胞肺癌A549細胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司。A549細胞在添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/鏈霉素（P/S）的RPMI Medium 1640中培養。細胞為支原體陰性，并在15代之內使用^［18］。

2.2 CCK-8法

A549細胞以3×10³個/100 μL的密度接種于96孔板中，孵育24 h?；衔锓謩e以不同濃度（0、1、5、10、20、30、40、50 μmol/L）加入96孔板中處理細胞48 h。然后加入10 μL CCK-8試劑（Cat^#： C0040，碧云天生物科技），在37 ℃下孵育1 h后，在酶標儀上讀取其在450 nm波長處的吸光度（A），并計算抑制率和半數抑制濃度IC50。

2.3 細胞克隆實驗

A549細胞按8×10²個/2 mL的密度接種于6孔板中，孵育24 h，將化合物按照0、5、10、20 μmol/L濃度梯度加入6孔板中，0 μmol/L設為空白對照，每個濃度設置兩個復孔。在37 ℃培養箱中培養12 d后，棄去培養液，用PBS潤洗2遍，甲醇固定細胞15 min，風干后用1%結晶紫染料染色30 min，用PBS沖洗3次，風干后拍照，并記錄細胞克隆數量^［17］。

2.4 劃痕實驗

A549細胞于6孔板中培養，待融合率達到90%以上，用槍頭垂直劃痕，PBS洗去劃下的細胞。分別加入終濃度為0、1、5、10 μmol/L化合物的無血清培養基同時將0 μmol/L設為空白對照，并在0、24、48 h于倒置顯微鏡下拍攝細胞劃痕愈合情況，使用Image J軟件計算劃痕面積^［19］。

愈合率=（0 h面積-24 h或48 h面積）/0 h面積

2.5 細胞熱轉移分析技術

細胞熱轉移分析技術 （Cellular thermal shift assay， CETSA）是一種直接在細胞或組織內檢測藥物和標靶蛋白相互作用的方法^［17］，基本原理是配體和蛋白結合后，蛋白的熱穩定性會有一定程度的提高，基于此可以驗證其與配體結合的能力。本研究以6×10⁴個/cm²的密度將處于對數生長期的A549細胞接種于3個10 cm培養皿中，使次日密度均大于90%。用1 mL含有PMSF的PBS緩沖液刮下全部細胞收集于1.5 mL離心管中，在液氮和37 ℃水浴鍋中反復凍融含有細胞的緩沖液（至少3次），于4 ℃、120 000 r/min條件下離心20 min以沉淀細胞碎片，吸取蛋白上清液進行BCA蛋白定量。用PBS稀釋含細胞的緩沖液至3～5 μg/μL，均分為2管，1管加入藥物，1管加入相應體積的DMSO，室溫孵育1.5 h。各處理組分別分裝裂解液至0.2 mL離心管（10管）中，進行梯度加熱（45～70 ℃）5 min，隨后室溫靜置5 min。在4 ℃、120 000 r/min條件下離心分離可溶性蛋白上清液及變性后的聚集蛋白沉淀。加入SDS蛋白緩沖液后進行免疫印跡法（Western blotting）實驗。

2.6 Western blotting

以2×10⁵個/2 mL的密度將A549細胞接種于6孔板，以終濃度0、5、10、15、20 μmol/L的化合物干預細胞48 h，常規消化并收集各組細胞。加含PMSF的裂解液置冰上裂解30 min， 在4 ℃、120 000 r/min條件下離心20 min，取上清，并用BCA蛋白定量試劑盒進行總蛋白定量。根據蛋白定量結果，加入適量蛋白上樣緩沖液和樣品混勻，95 ℃變性5 min，每組取20 μL總蛋白樣本于10% SDS-PAGE電泳，用聚偏乙烯（PVDF）膜進行轉膜，5%牛血清白蛋白封閉緩沖液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入稀釋比為1∶1000的一抗和稀釋比為1∶5000的內參后，4 ℃孵育過夜。TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min，用HRP標記的二抗在室溫下孵育2 h，TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min，加入電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑，通過ImageQuant LAS 500生物分子成像儀曝光顯色。

2.7 統計學處理

統計學方法以均數±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組之間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析（e-way ANOVA）分析差異的顯著性，運用SPSS統計軟件對數據進行統計分析，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 基于Chemprop模型篩選化合物數據庫

基于已報道的SMYD2抑制劑構建Chemprop分類模型，訓練集化合物與LLY-507相似性打分最高僅為0.27，如圖3（a），表明訓練Chemprop模型的化合物結構是多樣的。測試集結果顯示曲線下面積（ROC-AUC）達到0.894±0.011（圖3（b）），真陽性率（TPR）為59.1%（圖3（c）），證明模型的可靠性。使用該模型對篩選數據集進行預測，并給每個化合物賦予一個［0，1］的預測分數，如圖3（d），其中預測分數越小的化合物數量越多?；凇盎衔锏念A測分數越高，對SMYD2產生抑制的可能越大”的理論，最終選擇預測分數大于0.8的共307 777個化合物進入下一步研究。

3.2 基于RTMScore模型篩選數據庫

繼續使用RTMScore模型對上述Chemprop模型獲得的307 777個化合物評估結合模式，最終選擇Chemprop和RTMScore兩個模型打分均最高的5個化合物進行分析。如表1所示，Chemprop預測5個化合物的分數最高，且均大于130，Vina 打分小于-10，說明化合物與蛋白的結合力強?；衔锱cSMYD2結合模式（圖4）顯示，化合物5與LLY-507的結合構象類似，呈一個扁平的“C”形，插入到賴氨酸通道（TYR240、TYR258、VAL215、THR238、PHE184），且5與TYR240形成氫鍵。雖然化合物1、2、3、4也與這些關鍵氨基酸作用，但是在蛋白結合口袋處呈現“一”字形，與LLY-507和化合物5的構象存在較大差異。

3.3 模型分析

本研究采用Chemprop和RTMScore模型篩選獲得SMYD2抑制劑。Chemprop模型的優勢在于能夠根據結構信息，在包含1.95億分子的數據庫中高效且準確地篩選出 307 777個化合物。與傳統的需要手動設計的分子特征相比，此模型自動將訓練集化合物的每個分子結構都與其屬性對應映射成分子特征，提高了效率，同時模型根據訓練集化合物結構特征篩選數據庫能更準確地篩選出SMYD2抑制劑。但其缺陷是僅僅通過小分子的結構特征篩選化合物，未考慮與靶點結合情況，篩選出的化合物僅具有抑制劑的結構特征。而RTMScore模型對Chemprop模型篩選出的307 777個化合物進一步篩選，最終得到兩個模型綜合結果最好的5個化合物。這一過程中RTMScore模型的優勢在于可以得到化合物與蛋白的結合強度以及結合姿勢進一步提高篩選準確性。但因需求的計算力較高，所以模型的篩選能力有限。因此，本研究先利用Chemprop模型在大型數據庫中高效地篩選化合物，再利用RTMScore模型準確地篩選與蛋白質相互作用強的分子。

3.4 化合物的活性評價

3.4.1 化合物對人非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制作用 CCK-8法檢測化合物干預A549細胞后的吸光度，如圖5（a）所示，化合物5在20 μmol/L下的抑制率可以達到80%，IC50值為10.93 μmol/L，并且呈時間-濃度依賴性，表明化合物5對A549細胞有增殖抑制作用。但化合物1、2、3、4干預A549細胞，50 μmol/L下的抑制率均小于50%，表明這4個化合物對A549細胞沒有抑制作用。因此，本研究選取化合物5進入下一步研究。

3.4.2 細胞克隆法檢測化合物對A549細胞的增殖抑制能力 從圖5（b）～（c）觀察到，與空白對照0 μmol/L組比，在濃度為1、5、10 μmol/L的化合物5干預下，A549細胞克隆形成量會隨著濃度的增加呈遞減趨勢。A549細胞在1 μmol/L時的克隆形成量與0 μmol/L時對比，差異無統計學意義（Pgt;0.05），在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下的克隆形成量與0 μmol/L時對比均呈現明顯減少（Plt;0.05），表明化合物5在5 μmol/L和10 μmol/L下對A549細胞有顯著抑制作用。

3.4.3 細胞劃痕實驗檢測化合物對A549細胞的遷移抑制 細胞劃痕實驗結果如圖5（d）所示，A549細胞經過化合物5（5 μmol/L和10 μmol/L）干預24 h后，A549細胞的遷移率分別為6.6%和

1.8%，低于空白對照0 μmol/L組（17.8%），差異有統計學意義（Plt;0.05）。10 μmol/L化合物干預48 h后，A549細胞的遷移率為11.9%，顯著低于5 μmol/L組和空白對照0 μmol/L組（Plt;0.05），說明化合物

5可有效抑制A549細胞的遷移，并呈時間-濃度依賴，如圖6。研究發現SMYD2可以單甲基化p53的賴氨酸370位點，抑制p53的活性，從而影響腫瘤的

發生和發展。Western blotting實驗結果如圖7（a）、7（c），甲基化p53蛋白表達量隨著化合物5濃度增加呈現明顯的下調趨勢，初步說明化合物5能通過抑制SMYD2阻止p53甲基化，從而抑制癌細胞的增殖與遷移。

3.4.4 化合物5與SMYD2結合的熱穩定性分析 采用細胞熱轉變實驗（CETSA）研究SMYD2在細胞環境下對化合物5結合的生物效應。在本實驗中，將化合物5加入到細胞裂解液中，然后在不同溫度（45～65 ℃）下孵育1 h。高溫變性后，SDS-PAGE測定的蛋白條帶代表了配體的穩定作用。結果顯示，當培養溫度從60 ℃以5 ℃為間隔升高至70 ℃時，加入化合物5后得到的蛋白條帶與加入DMSO得到的條帶對比發現，雖然加入化合物5的條帶有下降的趨勢，但是加入DMSO的條帶下降更明顯，如圖7（b）、7（d）。說明化合物5與靶蛋白SMYD2發生結合，導致蛋白質的熱穩定性增加。此實驗驗證了化合物5能夠與靶蛋白結合，同時化合物5能夠抑制A549細胞增殖，初步說明利用深度學習模型篩選化合物的方法具有可行性，此方法與傳統的高通量篩選相比不僅能提高篩選效率，還能節約成本。

4 結 論

本研究使用兩種深度學習模型（Chemprop和RTMScore），分別從化合物結構和蛋白-化合物相互作用角度出發篩選SMYD2抑制劑，以提高篩選結果的可信度。Chemprop模型和RTMScore模型各有其優劣之處： Chemprop模型需要依賴數據量大的訓練集訓練模型識別抑制劑的結構特征，篩選出的化合物僅在結構方面與已有抑制劑相似；而RTMScore模型的優勢在于其可以利用化合物與靶蛋白的相互作用強度篩選化合物。兩個模型篩選化合物時互補，可更加準確又高效地篩選化合物。經過MTT、細胞熱轉移、細胞克隆及細胞劃痕等實驗驗證模型篩選出得分最高的化合物5，能夠明顯地抑制人非小細胞肺癌細胞系A549的增殖與遷移，且存在明顯的濃度依賴性。此外，化合物5能有效抑制SMYD2對p53的甲基化活性，證明化合物5的生物作用機制。化合物5可作為苗頭化合物進一步修飾，為治療肺癌藥物的開發提供研究思路。

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Screening and Activity Evaluation of SMYD2 Inhibitors Based on Deep Learning

LIU Xiaoqian， ZHU Yanjuan， FENG Dawei， WANG Luqi， LIU Yuhang， LU Jing

（School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation （Yantai University），Ministry of Education， Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong， Yantai University，Yantai 264005，China）

Abstract：" Two deep learning models， Chemprop and RTMScore， were used to screen for potential SMYD2 inhibitors from the TopScience commercial database. The inhibitory activity of the potential compounds was then determined using the CCK-8 method， and their effects on the anti-proliferation and migration of A549 cells were assessed using cell cloning and cell scratch， respectively. Finally， the binding ability of the compound 5 bound to SMYD2 was verified using cellular thermal shift assay and Wesrern blotting. The results showed that compound 5， identified by the deep learning model， exhibited significant inhibitory effects on the proliferation of A549 cells （inhibition rate ≥ 80%） with a IC50 value of 10.89 μmol/L. Treatment with 10 μmol/L of compound 5 resulted in a significant reduction in both the number of clones formed and the migration area of A549 cells compared to the control group （Plt;0.05）. The cellular thermal shift assay confirmed that compound 5 could bind to SMYD2.

Keywords：" deep learning; SMYD2 inhibitor; proliferation inhibition

（責任編輯 周雪瑩）