雅解益栽(心)方對動脈粥樣硬化的大鼠脂代謝和氧化應激及炎性反應作用研究

駱始華 李 易 趙麗娟 陶希睿 劉中勇 段小花 張 超*

1.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650000；2.云南省中醫醫院，云南 昆明 650000；3.《中國民族民間醫藥》雜志社，云南 昆明 650021；4.江西中醫藥大學第一附屬醫院，江西 南昌 3300043

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎[1]。而其所引起的心血管疾病(cardio vascular disease，CVD)已經成為威脅人類健康的首要死因。動脈粥樣硬化是心血管病中最主要的一種，其典型的病變特征是脂質、炎癥細胞、平滑肌細胞和壞死細胞碎片在血管內壁單層內皮細胞下方的內膜腔內終生積累和轉化。AS發病機制復雜，目前較一致的看法是因脂質代謝紊亂、炎癥細胞浸潤、氧化應激等多機制相互作用的結果，其發病過程十分復雜；在過去的幾十年里，廣泛的研究試圖揭示疾病背后的發病機制因此，積極尋找有效防治AS的策略，對于降低CVD的發病率和死亡率具有十分重要的科學意義[2]。西醫學針對AS及易損斑塊的治療手段主要有他汀類藥物和介入治療。介入治療雖可改善血管狹窄，但介入后再狹窄及對沒有從根本上解決血管斑塊的生物學特性；他汀類藥物可降脂、逆轉斑塊形成、抑制炎癥從而降低心腦血管事件，但其可導致肝腎損傷、橫紋肌溶解、肌痛及認知能力降低等副作用。而中醫藥在防治AS療效確切，其抗AS機制具有多角度、多靶點干預的優勢有望在一定程度上穩定斑塊、減少心腦血管事件的發生。

雅解益栽(心)方(以下簡稱YJYXF)是從傣醫臨床文獻資料中收集整理的民族有效驗方，傣醫本科教材《傣醫臨床學》中將“食物毒”定義為：“食物毒”是指因過食導致“四塔”“五蘊”的失衡，毒邪內蘊，內傷臟腑而發病。臨床表現包括全身癥狀等，如循環系統表現為心慌、心悸、胸痛等癥，還可以表現為下肢紫紺、壞疽等癥。“雅解益栽(心)方”具有調節體內“四塔、五蘊”功能，解除人體毒素，保護臟腑功能的解毒方。YJYXF的藥物中的藥物組成，即雅解先打(傣百解)、文尚海(百樣解)性涼，入風、火、水、土塔，調四塔，解酒毒、熱毒和其他毒，護臟腑為主藥；全方合用具有調補四塔、清火解毒之作用，可達調補氣血，解熱毒、酒毒、食物中毒及保護心肝腎之目的[3]。本研究從傣醫的“雅解”理論出發，通過高脂飼料建立動脈粥樣硬化模型來模仿傣醫學“食物毒”的模型，觀察雅解益栽(心)方對AS大鼠脂代謝、氧化應激和炎性反應的影響探討解食物毒可能是通過減輕氧化應激損傷，減輕炎癥反應，從而具有抗AS功效，可能是其抗AS穩定易損斑塊的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性SD大鼠43只，體質量(200±20)g，(由成都達碩實驗動物有限公司提供)合格證號：SCK(川)SCXK(川)2015-030。實驗前動物適應性飼養一周。高脂飼料配方：2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+3%豬油+0.2%丙硫氧嘧啶+94.3%+維生素D3粉劑(1.25×106IU/kg)喂養。

1.2 主要儀器 InfiniteM200PRO酶標儀：瑞士Tecan公司；LG10-2.4A高速離心機：北京醫用離心機廠；HW-80A旋渦混合器：上海精科實業有限公司。電子分析天平，PrecisaXS125A；LG10-2.4A高速離心機，北京醫用離心機廠；微量移液器美國ThermoElectron公司。

1.3 藥物與試劑 (YJYXF)的制備：解先打(傣百解)20 g，文尚海(百樣解)20 g，嘿濤罕(大黃藤)15 g，毫命(姜黃)15 g，蟑螂15 g，咪多領15 g，鄧嘿罕(定心藤)15 g，賓蒿(白花臭牡丹)15 g，帕蚌板(三七)5 g，奶子藤10 g，合罕郎跌打(葛根)20 g，管底(三葉蔓荊)10 g，芽害補(野甘草)10 g；將方藥用水煎煮、共煎兩次，兩次水煎液混合后濃縮成稠浸膏至含生藥2.4 g/mL，置于-18℃冰箱冷藏備用。辛伐他汀鈣片(北京雙鷺藥有限公司，批號：20181215，規格：10 mg/片)；血脂試劑盒：[總膽固醇(TC)試劑盒(批號：F006-1-1)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號：A110-2-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號：A113-2-1)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號：A112-2-1)(南京建成生物工程研究所有限公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(批號：H052-1)、白介素-6(IL-6)試劑盒(批號：H007-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號：A005-1-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號：A003-1-2)、過氧化氨酶(CAT)試劑盒(批號：A007-1-1)。

1.4 造模與分組 選用清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重(200±10)g。清潔級動物房飼養，恒溫，恒濕，自由飲水，飼固體飼料。適應性喂養3 d，開始試驗。采用腹腔注射VD3+高脂飼料(高脂飼料配方：2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+3%豬油+0.2%丙硫氧嘧啶+94.3%維生素D3粉劑(1.25×106IU/kg)喂養，實驗開始時于右下肢肌內注射維生素D3(3×105IU/kg)針劑，每30 d重復1次)喂養9周建立大鼠動脈粥樣硬化模型建立食物毒致AS動物模型，隨機分5組，每組10只。對照組：Normal；模型組：Normal+腹腔注射VD3+高脂飼料；辛伐他汀組：Normal+腹腔注射VD3+高脂飼料+辛伐他汀(4 mg/kg/d)干預4周；雅解益栽(心)方高劑量組：Normal+腹腔注射VD3+高脂飼料+雅解益栽(心)方(1.4 mg/kg/d)干預9周；雅解益栽(心)方低劑量組：Normal+腹腔注射VD3+高脂飼料+雅解益栽(心)方(0.35 mg/kg/d)干預9周。

1.5 觀察指標 血清指標：測定血清中甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)的含量，各組主動脈組織中谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氨酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量；測定大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α含量。

1.6 統計學方法 實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，各組數據均進行正態檢驗及方差齊性檢驗，采取方差分析。

2 結果

一般情況各組大鼠體重均明顯增加，其中以模型對照組最為明顯。YJYXF高劑量組大鼠性情較溫順，精神狀態好，毛色光澤，體態勻稱，進食水及排尿便正常。模型對照組、低劑量組、辛伐他汀組大鼠性情較暴躁，易撕咬，體態肥胖，便溏，多數大鼠精神不同程度萎靡，運動有所減少，皮毛蓬松而無光澤，其中又以模型對照組更為突出，排便相當。

2.1 雅解益栽(心)方對實驗大鼠脂代謝的影響 結果表明(見表1和如圖2所示)，與正常組比較，模型組血清TG、大鼠LDL含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01)，HDL含量無明顯變化(P>0.05)，提示動模型建立成功。與模型組比較，YJYXF高低劑量組血清中TG、大鼠LDL含量減少，HDL含量增加，二者差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。與陽性藥物組比較，高劑量血清TG、HDL含量差異無統計學意義(P>0.01)。表明YJYXF能改善大鼠血脂，在降低TG、升高HDL方面具有優勢。詳見表1。

表1 各組血清中TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.2 雅解益栽(心)方對實驗大鼠抗氧化的影響 雅解益栽(心)方對大鼠血清GSH-Px、SOD和CAT的活性及MDA含量的影響見表2：與空白對照組相比，模型組大鼠血清 SOD、CAT、GSH-PX活性降低，MDA 含量升高，且差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，YJYXF高、低劑量組均能升高 GSH-PX、SOD、CAT 活性，降低 MDA 的含量，且差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組主動脈組織中GSH-PX、CAT、SOD、MDA的含量水平比較

2.3 雅解益栽(心)方對實驗大鼠血清炎癥因子IL-6和TNF-α含量的影響 對AS大鼠血清TNF-α、IL-6的影響見表3：與正常組比較，模型對照組動物血清TNF-α、IL-6含量均顯著升高，且差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，YJYXF高劑量組、YJYXF低劑量組與辛伐他汀組TNF-α、IL-6含量均顯著下降，且差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

表3 表3 各組鼠血清炎癥因子IL-6和TNF-α含量比較

3 討論

傣醫學是傣族人民在兩千多年的生活和醫療實踐中形成的以“四塔”“五蘊”為基礎理論的核心，“三盤”學說、“雅解”學說為理論特色的一門醫學學科。其中，傣醫“雅解”理論最具特色，其核心內容包括“未病先解，先解后治，同解同治”及系列“雅解”方藥，而解“食物毒”是“雅解”理論的重要組成部分。“雅解”為傣語，意譯為解藥，指能解除體內各種毒素，平衡和協調“四塔五蘊”以及臟腑功能的一類傣醫方藥的統稱。傣醫解“食物毒”歷史悠久，傣醫藥經書和文獻中均有記述。如醫祖龔麻臘別用文尚海(百樣解)解“食物毒”；《阿皮踏麻基干比》《羅格牙坦》《檔哈雅龍》等傣族醫學文獻記載醫學大師臘西達菲創立“雅給”方解“食物毒”；傣醫學[4- 5]認為，人過食膏粱厚味，盡管它們是人體所必需的營養物質，但過量對人體而言卻是一種毒，這種毒傣醫學認為是來自于過食食物所產生的毒稱為“食物毒”(故采用腹腔注射VD3+高脂飼料喂養建立大鼠動AS模型模仿人過食過食食物而產生的毒)，其可導致機體臟腑功能代謝失調進而內生毒素，在幾千年前的傣醫經書《嘎牙山哈雅》(人體解說)一書中即有記載，說明傣醫學對臟腑及其功能很早就有了較全面的認識。根據書中所述，食物所產生的毒能導致體內“四塔五蘊”功能失調而發病，傣醫學中沒有“動脈粥樣硬化”的病名，但從病因病理和患者的癥狀方面來看，動脈粥樣硬化可歸屬于傣醫的心慌、心悸、胸痛，傣醫認為心慌、心悸、胸痛是由于體內塔攏(風、氣)不行，留滯胸中，則血運不通，不通則痛；或感受外在的帕雅攏(風邪)，病邪入心，阻滯血脈運行而致。在治療上，其病位在中上盤，應以先解后治，先服解藥，再按上病治上，中病治中的原則分別治以調補中上盤火，除風通氣，活血止痛，補火溫心，除風止痛和補水清火，養心止痛。

傣醫學認為當人體發病后應先服用“解藥”，以解除過食食物產生的毒副作用，從而調節人體生理功能，保持體內“四塔”(風、火、水、土)、“五蘊”(色、識、受、想、行)功能的平衡和協調[6]。“雅解益栽(心)方”是從傣醫臨床文獻資料中收集整理的民族有效驗方，該方是具有調節體內四塔、五蘊功能，解除人體毒素，保護臟腑功能的解毒方[3]。“雅解益栽(心)方”的藥物組成中，雅解先打(傣百解)、文尚海(百樣解)性涼，入風、火、水、土塔，調四塔，解酒毒、熱毒和其他毒，護臟腑為主藥；嘿濤罕(大黃藤)性寒涼，入四塔，有調四塔，解百毒之作用；蟑螂味咸，入土、水塔，有解毒健脾之功；咪多領性溫，補火塔，理氣止痛；毫命(姜黃)味苦、微辣，有臭氣，性平偏熱，入水、土、風塔，具活血止痛，清火解毒之功；管底(三葉蔓荊)根味苦、性涼，入風、水、土塔，清火解毒，治瘡癤腫痛等[7-8]。全方合用具有調補四塔、清火解毒之作用，可達調補氣血，解熱毒、酒毒、食物中毒及保護心肝腎之目的。現代研究[9]表明咪多領具有對傷寒桿菌等較強抗菌作用；蟑螂能在一定程度上調節大鼠潰瘍性結腸炎腸道菌群大鼠腸道微生態環境，平衡腸道菌群[10]。前期研究[11-12]表明雅解益栽(心)方對乙硫氨酸引起的小鼠肝臟脂肪蓄積有一定的預防作用，能抑制肝脂中總膽固醇的升高及肝指數的升高，表明其對脂肪輸出障礙(脂肪代謝紊亂型脂肪肝)有一定的療效；對外源性脂質顯著增加所致的脂肪肝有一定的預防作用。該實驗采用腹腔注射VD3+高脂飼料喂養建立大鼠動脈粥樣硬化模型模仿人過食食物而產生的毒(食物毒)，其可導致機體臟腑功能代謝失調進而內生毒素，造模后大鼠血脂水平明顯升高。

機體的自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動態平衡狀態，平衡狀態被打破時就產生了自由基。當自由基的活動超過一定量，就會發生疾病。機體抗氧化酶促系統包括SOD、 GSH-Px、 CAT等。 SOD是酶促防御系的一種重要的氧自由基清除劑，保護細胞免受損傷。CAT是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，過氧化氫它能夠對機體造成損害。GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，主要清除過氧化氫等自由基，防止脂質過氧化物的生成，起到保護細胞膜結構和功能完整性的作用。MDA是脂質過氧化降解的中間產物，其含量可以反映機體內脂質過氧化的程度，可破壞細胞結構和功能，反映細胞的受損程度。

本研究中YJYXF干預后能顯著改善血清中TG、LDL-C、和HDL-C的含量，即YJYXF能夠有效改善模型大鼠的脂質代謝水平。給予大鼠高脂飲食聯合維生素D3可導致大鼠內皮細胞抗氧化能力下降，血清MDA含量增加、GSH-Px、CAT、SOD活性降低，自由基產生和清除的平衡被破壞，脂質過氧化作用增強，促使形成AS，而MDA、GSH-Px、CAT和SOD是氧化應激反應的標志物之一，能夠反映機體的氧化應激狀態[13]。YJYXF各劑量組與模型組相比能夠有效降低MDA的含量，提升GSH-Px、CAT、SOD的活性，表明YJYXF能夠在AS中抑制氧化應激反應。

高水平IL-6都是影響斑塊性質穩定性的重要生物學指標。TNF-α可以激活炎癥通路而導致內皮細胞損傷，進一步加重AS[13]。實驗結果表明，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6的表達水平明顯升高，提示TNF-α、IL-6炎性因子在其中起到重要作用。YJYXF干預后，大鼠血清中的IL-6和TNF-α炎性細胞因子水平與辛伐他汀類似，YJYXF各劑量組均可抑制炎性因子的表達，表明YJYXF對大鼠AS炎性反應具有一定的緩解作用。

綜上所述，YJYXF能通過調節模型大鼠的脂質代謝水平，降低炎性反應、氧化應激來升高AS大鼠的抗AS能力，降低動脈內皮細胞的脂質過氧化損傷，可改善炎癥反應、主動脈病變和穩定斑塊，對大鼠AS具有明顯的保護作用，其作用機制可能是通過降低動脈內皮細胞的脂質過氧化損傷，減輕炎癥反應來解食物毒，從而抑制動脈粥樣硬化進程。