牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲的抗衰老作用研究

魏潤霞,盧虹玉,2*,秦小明,2*,王麗瑤

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋生物制品工程實驗室, 廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東 湛江,524008) 2(大連工業大學,海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,遼寧 大連,116034)

衰老是機體各器官功能隨著年齡增長的自然退行性變化[1]。隨著社會的發展,生育率降低和人均壽命的延長使得社會老齡化問題日益凸顯,人們對抗衰老功能性產品的需求日益增長。在對衰老機制的不斷研究中,學者發現衰老跟自由基的產生密切相關,很多能夠清除自由基和具有抗氧化活性的天然物質表現出較好的抗衰老作用,只因這類物質可通過影響機體內抗氧化基因水平的表達,增強機體內氧化-還原防御系統,減少自由基損傷,從而起到抗衰老的作用[2-3]。目前研究的抗衰老功能性產品的原料多來自植物,如多酚類和黃酮類,相對而言動物成分相關研究報道較少。最新研究發現,由于生活環境的特殊性,海洋動物的機體內含有許多結構特殊的生物活性物質和代謝產物,在抗衰老作用中具有潛在的廣闊前景。

牡蠣又稱生蠔、海蠣子,廣泛分布于我國沿海地區,是我國第一大養殖貝類[4]。牡蠣肉質鮮美,口感爽滑,含有蛋白質、氨基酸、多糖、牛磺酸等豐富的營養成分[5],素有“海洋牛奶”的美譽,具有抗氧化[6]、抗衰老[7]、免疫調節[8]、抗腫瘤[9]、降血脂[10]等多種生物活性,表現出極高的藥用價值和食用價值,是國家衛生健康委員會第一批批準的藥食同源食品之一[11]。近年來幾項研究表明,牡蠣具有改善小鼠生殖衰老狀態、保護光老化損傷的皮膚以及延長秀麗隱桿線蟲壽命的作用[12-14],這為牡蠣在抗衰老功效產品的研發提供了新思路。然而目前的研究還不夠深入和系統,存在著很多問題,比如不同加工處理的牡蠣提取物作用是否一致、主要功效因子尚不清楚、作用機制如何等,需要更多的研究去闡明。本文擬采用秀麗隱桿線蟲為動物模型,探究3種不同的牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲的壽命、急性氧化應激損傷以及體內相關酶活力的影響,試圖評價不同牡蠣提取物的抗衰老作用差異,為牡蠣的抗衰老功能性產品開發和附加產值資源化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣,購自湛江市場;N2型秀麗隱桿線蟲、OP50大腸桿菌,福建上源生物科學技術有限公司;盛美諾牡蠣肽(oyster peptide,OP),海南翔泰漁業股份有限公司(OP為市售產品,樣品總重均分子質量為393 Da,1 000以下的分子質量占比約97.6%)。

木瓜蛋白酶(食品級),上海源葉生物科技有限公司;線蟲生長培養基(nematode growth medium,NGM),石家莊西默科技有限公司;LB(Luria-Bertuni)瓊脂,廣東環凱微生物科技有限公司;LB肉湯,青島高科技工業園海博生物技術有限公司;瓊脂粉,上海瑞永生物科技有限公司;鹽酸四咪唑、5-氟脫氧尿苷(floxuridine,FUdR),上海麥克林生化科技有限公司;NaClO,上海易恩化學技術有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒,北京盒子生工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-S4數顯恒溫攪拌水浴鍋,常州市金壇友聯儀器研究所;N-1300V-W旋轉蒸發儀,上海愛朗儀器有限公司;SW-CJ-2F雙人單面垂直送風凈化工作臺,廣州吉迪儀器有限公司;B60F正立生物熒光顯微鏡;Thermo Lynx 6000 高速落地離心機,美國 Thermo Fisher Scientific 公司;SRL7045顯微鏡,北京天諾翔科學儀器有限公司;FD8508 冷凍干燥機,成都國光電氣股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣提取物的制備

新鮮牡蠣去殼后清洗牡蠣肉,瀝干水分,勻漿,固液比均為1∶4(g∶mL),分別用水提法和酶解法來提取。具體步驟如下:(1)水提法:在50 ℃水浴鍋中蒸煮1 h,用 200目紗布過濾,取濾液,再次將濾渣蒸30 min,過濾后合并濾液,得水提液;(2)酶解法:參考張雪妍[15]的研究,制備成溶液后加入3 000 U/g木瓜蛋白酶,用0.1 mol/L NaOH或HCl溶液調節至pH 6.5,62.5 ℃酶解4.5 h,充分攪拌并用均質機均質10 min,酶解適當時間后,沸水浴10 min,8 000 r/min離心20 min取上清液,得酶解液。將得到的水提液與酶解液于30 ℃旋蒸濃縮,真空冷凍干燥,得到牡蠣水提物(oyster water extract, WPO)與牡蠣酶解提取物(enzymolysis extract of oyster, EPO),置于-80 ℃下保存。

1.3.2 基本營養成分的測定

蛋白質測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法;脂肪測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法;灰分測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》中的高溫灼燒法;總糖測定參照GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測定》中的硫酸-苯酚法。

1.3.3 秀麗隱桿線蟲的培養和同期化

參考張培麗等[16]的方法并稍作修改:配制NGM培養基,進行高壓滅菌,加入雙抗添加劑后倒入60 mm的培養皿中,冷卻凝固后得到新鮮培養板,于培養板上滴入300 μL的OP50菌液,晾干,置于20 ℃培養箱中進行培養直至長出菌斑。使用高氯酸鈉裂解法[17]。將3日齡的線蟲用M9溶液沖洗至2 mL EP管中,靜止2 min,去掉上清液獲得蟲體沉淀,每個EP管中加入500 μL蟲體沉淀,1 mL線蟲裂解液,蓋上蓋子充分搖晃5 min直至線蟲裂解完全,常溫下于3 000 r/min離心30 s,棄上清液留沉淀,用M9溶液重復清洗3次至NaClO刺鼻味消失,將蟲卵置于涂有OP50的培養基中,放入20 ℃培養箱中培養48 h后得到同期化線蟲。

1.3.4 牡蠣提取物對線蟲壽命的影響

收集同期化培養至L4期的線蟲,置于含有OP50的NGM培養板表面。培養基板含有不同質量濃度的提取物[50 μg/mL(低劑量)、200 μg/mL(中劑量)、800 μg/mL(高劑量)]和150 mmol/L FUdR(防止產卵),空白對照組以超純水代替提取物,每組設置3個培養皿,每個培養皿內放置30條線蟲,于20 ℃恒溫培養箱中進行培養。從轉移之日起開始統計死亡線蟲,轉移當天記為壽命實驗第0天。線蟲死亡判別標準為挑針觸碰蟲體而無任何反應并呈現僵直狀態,即可斷為死亡。直至全部線蟲死亡,停止計數,繪制壽命曲線。

1.3.5 牡蠣提取物對線蟲產卵能力的影響

參考魏偉[18]的方法并稍作修改:收集同期化線蟲培養至L4時期,3種提取物不同質量濃度(50、200、800 μg/mL)處理,設空白對照組,每個培養皿內放置1條線蟲,為一個處理組,設置5個平行,將線蟲開始產卵的當天記為第 1 天,進行產卵計數,每隔24 h再次計數,并將線蟲轉移至新的培養皿中,直至線蟲停止產卵,統計每天產卵總數,繪制曲線。

1.3.6 牡蠣提取物對線蟲脂褐素的影響

收集同期化線蟲培養至L4時期,3種提取物不同質量濃度(50、200、800 μg/mL)處理,設空白對照組,每個培養皿放置5條線蟲為一個處理組,設置3個平行,培養條件同1.3.4節,培養3 d后將線蟲用1 g/L的鹽酸四咪唑溶液將其麻醉,轉移到2%瓊脂糖載玻墊片上,采用熒光顯微鏡觀察并采集圖片。使用Image J軟件統計分析熒光強度。

1.3.7 牡蠣提取物對線蟲身體頭尾擺動次數的影響

收集同期化線蟲培養至L4時期,根據上述實驗確定的最佳作用濃度,進行線蟲處理,每個培養皿放置5條線蟲,每組設置3個平行,培養期間觀察并記錄線蟲第5、7、9 天的運動能力。基本過程如下:向空培養皿板中滴1滴M9溶液,挑取1條線蟲置于M9溶液中,使其在M9溶液中適應20 s,開始記錄線蟲蟲體10 s內的身體擺動次數(線蟲頭部與尾部同時朝著相反的方向擺動一次后再同時擺回來為1次身體擺動)。

1.3.8 牡蠣提取物對急性氧化應激損傷秀麗隱桿線蟲的影響

1.3.8.1 牡蠣提取物對百草枯損傷線蟲存活率的影響

收集同期化線蟲培養至L4時期,3種提取物在800 μg/mL質量濃度下處理線蟲,每組設置3個平行,培養3 d后將其放入96孔板,每個孔板為15條線蟲,分別加入200 μL 100 mmoL/L百草枯溶液,于20 ℃培養箱中培養5 h后觀察存活率,繪制曲線。

1.3.8.2 牡蠣提取物對百草枯損傷線蟲體內抗氧化酶活力的影響

收集同期化線蟲培養至L4時期,給藥和培養同1.3.8.1節,培養3 d后收集各組線蟲于2 mL EP管中,用M9緩沖液洗滌多次,在提取液與水體積比500∶1的條件下處理樣品,冰浴超聲破碎3 s,間隔10 s,重復30次,8 000 r/min、4 ℃離心 10 min,取上清液置于冰上待測,按照試劑盒所述方法測定SOD、GSH-Px活力和 MDA 含量。

1.3.9 實驗數據分析

每組實驗獨立重復3次。采用SPSS 26軟件進行顯著性分析(P<0.05),結果以平均值±標準差表示。數據分析采用GraphPad Prism 9作圖。

2 結果與分析

2.1 基本營養成分測定結果

如表1所示,3種牡蠣不同提取物的成分具有差異性,總蛋白質的含量均最高,其中OP的蛋白質含量最高,為66.59%,WPO、EPO蛋白質含量分別為56.06%和55.71%,無顯著性差異(P>0.05);總糖和灰分的含量較為接近,分別為8.63%～9.78%和7.67%～10.53%,其中,EPO的總糖含量較高;而EPO中的礦物質含量最高,WPO含量最低,對于兩者之間的不同,說明單純通過水提取可能會損失較多的礦物質元素。3種提取物的脂肪含量均很低,且無顯著性差異。因此,不同制備方法得到的牡蠣提取物基本成分具有一定的差異,推測其具體成分可能也存在較大差異,其功效可能也有所不同。

表1 三種牡蠣提取物基本成分結果 單位:%

2.2 牡蠣提取物對線蟲壽命的影響

線蟲的壽命是衡量線蟲衰老最重要的一個直觀指標[19]。與空白對照組相比,3種牡蠣提取物在不同質量濃度下(50～800 μg/mL)均能延長線蟲平均壽命,壽命曲線均向右移(圖1),但低質量濃度(50 μg/mL)下作用不顯著,隨著濃度的增加,平均壽命均延長顯著(P<0.05),最長為(12.21±0.08) d,最多可增加平均壽命32.7%,800 μg/mL的EPO和OP均能使線蟲最長壽命從15 d延長至18 d(表2)。綜合來看OP的作用最強,生命曲線變化趨勢最為明顯(圖1-b),表明3種不同提取物延長壽命的作用有所不同,可能與其成分不同有關。王力等[14]的研究結果表明,牡蠣酶解產物經超濾制備的組分在高劑量濃度下可使秀麗隱桿線蟲平均壽命延長35.4%,與本實驗的結果較為一致。

表2 牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 2 Effects of oyster extracts on lifespan of C.elegans

a-EPO 處理組;b-OP 處理組;c-WPO 處理組圖1 牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲壽曲線命的影響Fig.1 Effects of oyster extracts on lifespan curves of C.elegans

2.3 牡蠣提取物對線蟲產卵能力的影響

線蟲產卵量反映了線蟲的生殖功能,與線蟲的衰老直接相關,可用于評價線蟲的衰老程度,因此,線蟲的產卵數目和產卵周期是反映線蟲生殖功能衰老狀況的重要指標[20]。本研究結果顯示,與空白對照組相比,低質量濃度(50 μg/mL)牡蠣提取物除了WPO以外其余2個樣品處理均能顯著增加線蟲的產卵數目(P<0.05),中高質量濃度(200、800 μg/mL)的EPO和WPO組的線蟲產卵數顯著增加(P<0.05),但彼此之間無顯著性差異,而OP隨著濃度的增加產卵數目顯著性增加(P<0.05),且呈劑量依賴性,分別提高了產卵數目52.5%、66.7%和80.2%。說明與EPO和WPO相比,中高濃度的OP作用更顯著(圖2)。與李振旺[21]的研究相比(55.7%),本研究的促生殖作用更明顯,也間接地證實了牡蠣提取物確實具有促進動物生殖能力的作用[12]。

圖2 牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲產卵能力的影響Fig.2 Effects of oyster extract on the spawning capacity of C.elegans注:組間不同字母之間表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.4 牡蠣提取物對線蟲脂褐素的影響

由于衰老會伴隨著自由基的產生,自由基使脂肪氧化和溶酶體降解,導致溶酶體消化產物和脂肪殘基增加,進而導致線蟲體內脂褐素的積累,因此脂褐素是細胞開始衰老的特征,標志著細胞內清除系統功能障礙,是一種被廣泛認可的衰老標志物[22]。 結果表明,與空白對照組相比,低中高濃度的EPO、OP和WPO均能顯著降低線蟲體內脂褐素的積累(P<0.05),且在50～800 μg/mL范圍內呈現劑量依賴性,其中50 μg/mL和200 μg/mL處理組中,3種提取物之間無顯著差異性,800 μg/mL處理組中,OP對脂褐素的降低作用顯著高于EPO和WPO, 分別為98.15%、82.79%和46.5%(圖3、圖4),說明牡蠣提取物能夠抑制衰老線蟲體內生成的自由基,從而通過減少大分子和細胞器的損傷來降低脂褐素累積。

圖3 牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲體內脂褐素 積累的熒光強度圖Fig.3 Fluorescence intensity of lipofuscin accumulation in C. elegans by oyster extract

圖4 牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲體內脂褐素 相對含量的影響Fig.4 Effect of oyster extracts on relative content of lipofuscin in C.elegans

2.5 牡蠣提取物對線蟲運動能力的影響

線蟲運動行為能夠反映神經系統衰老狀態,本研究以線蟲的身體頭尾擺動次數為生理指標觀察牡蠣提取物對線蟲運動能力的影響[23]。實驗中可觀察到,隨著培養時間的延長,線蟲的身體擺動次數顯著減少,EPO、OP和WPO處理后培養9 d,身體擺動次數與5 d時相比降低了30%、20.2%和36.2%(表3),經牡蠣提取物作用5 d時,與空白組相比,運動能力略有升高,但均無顯著變化(P>0.05),而隨著樣品處理時間的延長,在第7天和第9天時,EPO、OP和WPO均能顯著增加身體擺動次數,且OP的作用顯著高于WPO和EPO(P<0.05),后兩者之間無顯著差異性(表3),說明牡蠣提取物能夠更好地改善衰老狀態的線蟲運動能力,而對年輕線蟲作用影響不大。運動能力往往跟神經系統衰老程度密切相關,因此,牡蠣提取物可能能夠延緩線蟲神經系統的衰老。

表3 牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲身體擺動次數的影響Table 3 Effects of oyster extract on physical exercise capacity of C.elegans

2.6 牡蠣提取物對線蟲百草枯急性氧化應激損傷試驗

百草枯毒害機制主要包括氧化應激、凋亡等,其中氧化應激是百草枯的主要中毒損傷機制,百草枯作為電子受體可誘導機體產生活性氧,造成細胞膜脂質過氧化,產生氧化損傷,進而導致壽命縮短[24]。本研究結果顯示,與空白對照組相比,3種牡蠣提取物(800 μg/mL)的處理均顯著提高了百草枯損傷線蟲的存活率(P<0.05),其中又以OP的效果最為顯著,提高了線蟲存活率53.34%(圖5),說明WPO、OP和EPO均能緩解百草枯導致的急性氧化應激損傷,但其作用強度不同,該現象與上述抗衰老作用的結果比較一致,說明OP可能含較多的活性成分或者組分的活性強度高。

圖5 牡蠣提取物對百草枯損傷的秀麗隱桿 線蟲存活率的影響Fig.5 Effect of oyster extracts on survival of paraquat-damaged C.elegans

2.7 牡蠣提取物對線蟲抗氧化酶活力的影響

機體內抗氧化酶活性水平可以反應其生長發育狀態,衰老過程中或受到抗氧化應激時,細胞內抗氧化酶活性降低,導致氧自由基過度積累引發氧化應激從而加速衰老。SOD和GSH-Px是線蟲體內主要的抗氧化酶系統,酶活性的調節可能會提高秀麗隱桿線蟲在氧化應激下的存活率,MDA水平代表了機體的膜脂質過氧化水平[25]。本研究結果顯示,與空白對照組相比,800 μg/mL的EPO和OP均能顯著增加線蟲體內GSH-Px和SOD水平(P<0.05),WPO對SOD水平無影響,其中OP的作用效果最好;EPO、OP和WPO處理均顯著降低線蟲體內氧化產物MDA含量,分別降低了97%、98.2%和89.2%(表4),其中,EPO、OP之間無顯著差異,OP效果最為顯著。由此說明,牡蠣提取物能夠緩解急性氧化應激損傷與線蟲體內抗氧化能力增強有關,從而提高其存活率。

表4 牡蠣提取物對秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶活力的影響Table 4 Effects of oyster extracts on physical exercise capacity of C.elegans

3 結論與展望

本研究對3種牡蠣提取物(EPO、OP和WPO)進行了基本成分的測定,結果表明,其基本成分存在一定的差異,但其主要成分均為蛋白多肽,其次為總糖和灰分,脂肪含量很低。以秀麗隱桿線蟲為模型,觀察了3種牡蠣提取物的抗衰老作用,通過觀察其對線蟲壽命、生殖能力、運動狀態以及體內脂褐素累積情況的影響,結果表明,EPO、OP和WPO均能不同程度地延長線蟲的平均壽命,增加產卵數量,降低脂褐素積累,但作用效果不但與提取物本身有關,且與濃度有關,800 μg/mL處理組的效果最好,三者中OP的作用最強。通過百草枯急性氧化應激損傷實驗,結果顯示,3種牡蠣提取物均能提高氧化損傷的線蟲存活率,說明EPO、OP和WPO均具有緩解氧化應激損傷的作用。為了證實其作用可能與機體內相關的氧化還原水平有關,進行了GSH-Px、SOD和MDA的分析,結果表明,EPO和OP能夠顯著增加線蟲體內GSH-Px和SOD水平,顯著降低MDA含量,WPO對SOD無影響,同樣以OP的作用最為顯著,尤其是高濃度的OP處理組,提高 GSH-Px水平299.7%、SOD水平70.65%,降低MDA水平98.2%。綜上所述,不同的牡蠣提取物具有不同程度的抗衰老作用,其中OP的效果最好,但其具體的功能因子及其相關的作用機制還需進行深入的研究。本研究為牡蠣在抗衰老領域的應用提供了理論依據,為相關產品的開發提供基礎,具有積極的社會效益和經濟效益。