四種類型竹種竹葉總RNA提取方法的比較研究

馬迎春 王曙光，2，3 詹 卉，2 于麗霞，2 楊德佳 高若天 李 娟，2，*

（1西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2西南林業大學云南省叢生竹重點實驗室，云南 昆明 650224；3西南林業大學竹藤科學研究院，云南 昆明 650224）

竹類植物隸屬于單子葉植物綱（Monocotyledoneae）禾本目（Graminales）禾本科（Gramineae 或Poaceae）竹亞科（Bambusoidese）［1］，自然分布于年降雨量1 200～4 000 mm、年平均溫度8～36 ℃的地區［2］。我國現有竹類植物40 屬500 余種，其中云南分布的竹類植物有29 屬220余種，且特有種在100種以上［3］。

竹亞科植物地下莖形態較特殊，是竹種分類的重要依據之一。按地下莖形態可將竹類植物分為合軸型（sympodium）、單軸型（monopodium）和復軸型（amphipodium）三大類，合軸型竹種進一步分為合軸叢生亞型和合軸散生亞型［1］。合軸叢生亞型主要有牡竹屬（Dendrocalamus）、慈竹屬（Neosinocalamus）等竹種。勃氏甜龍竹（D.brandisii）為牡竹屬喬木狀竹種，是云南省重點發展的筍用竹種；合軸散生亞型竹種的代表為箭竹屬（Fargesia）竹種［4］，云南箭竹（F.yunnanensis）為箭竹屬竹種，主要分布于云南省，具有很高的觀賞價值和食用價值。單軸型代表竹種為剛竹屬（Phyllostachys）的毛竹（Ph.edulis），毛竹是我國重要的森林資源，也是中國分布最廣的竹種［5］。復軸混生型代表竹種為巴山木竹屬（Bashania），該屬代表竹種為巴山木竹（B.fargesii），多為熊貓食用竹［6］，其竹林可作為熊貓的棲息地［7］。

我國竹類資源豐富，是森林資源及園林綠化中不可缺少的部分。前期的竹類植物研究主要集中在糖分代謝［8-9］、組織結構［10］、竹種分類［11］、生長繁殖［12］、生理生化［13-14］等方面，涉及分子生物學層面的研究較少。目前，毛竹（Ph.edulis）、麻竹（Dendrocalamuslatiflorus）等已有轉錄組測序等分子層面的研究［15-17］，其研究主要采用RNA 試劑盒提取所需的RNA，但未考慮試劑盒的普適性。多數竹子的纖維素含量高且富含酚類物質、蛋白質、多糖等代謝產物［18-19］，且多糖、酚類物質易與RNA結合［20-21］，影響核酸的提取質量。如何提取高品質的竹類植物RNA，且兼顧提取效率和成本等因素，是目前竹類植物分子生物學研究領域急需解決的難題。

竹類植物種類較多，形態差異大，不同類型竹種的代謝產物也各有不同，尋找適合所有竹種的RNA 提取方法仍較難實現。鑒于此，本研究選擇不同地下莖形態的代表竹種——勃氏甜龍竹、云南箭竹、毛竹、巴山木竹心葉為試驗材料；采用隸屬函數對自配TRIzol 試劑法、商品化TRIzon 試劑法、RNA 試劑盒法、改良十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法四種方法提取的竹葉總RNA 進行提取質量、純度、成本等方面的綜合比較，以期篩選經濟、便捷、高質量的竹葉RNA 提取方法，為后續竹類植物的分子生物學研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料 試驗所用勃氏甜龍竹、云南箭竹、毛竹、巴山木竹竹葉均于2023年3月中旬采自位于云南省昆明市的西南林業大學校內（25°06'N，102°78'E），為減少木質素和纖維素等成分的干擾，所取用的竹子幼嫩葉片均為中脈部針葉（心葉），葉片尚未發育展開，取樣后迅速置于液氮中備用。取樣部位見圖1。

圖1 不同竹種竹葉材料提取部位Fig.1 Extraction parts of bamboo leaves from different bamboo species

1.1.2 試驗試劑 自配TRIzol 試劑：硫氰酸銨0.4 mol·L-1、異硫氰酸胍0.8 mol·L-1、三水乙酸鈉0.1 mol·L-1、甘油5%、乙酸0.73%、苯酚38%，4 ℃避光保存、2% CTAB（5 g、NaCl 20.2 g、1 mol·L-1Tris-HCl 25 mL、0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）10 mL，加超純水至250 mL。商品化TRIzon 試劑（TRIzon 總RNA 提取試劑）及全能型植物RNA 提取試劑盒（DNase I）均購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司（貨號及價格見表1）。其他試劑有無水乙醇（分析純）、氯仿（分析純）、異戊醇（分析純）、異丙醇（分析純）、70%、95%及75%酒精、雙蒸水（ddH2O）、β-疏基乙醇（2-mercaptoethanol）、10%氯化鋰（LiCl）溶液、焦碳酸二乙脂（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水、TAE（tris acetate EDTA，TAE）緩沖液、無核酸酶水（RNase-free water）等。

表1 四種提取方法主要試劑貨號及價格Table 1 Number and price of main reagents in four extraction methods

1.2 儀器與設備

CF16RXⅡ落地式高速冷凍離心機（Hitachi Koki，日本）、NanoDrop2000 超微量分光光度計（Thermo Fisher，美國）、MX-E 固定式旋轉混勻儀［大龍興創實驗儀器（北京）股份公司］、SS-325 高壓蒸汽滅菌鍋（Tomy，日本）、SQP 分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］、SW-CJ-1FD 超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、EU-K1-TJ30 實驗室超純水機（南京歐鎧環境科技有限公司）、IMS-50 制冰機（常熟市雪科電器有限公司）、DYY-4C 電泳儀（北京市六一儀器廠）、Universal Hood Ⅱ 凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）、LG100B理化干燥箱（上海市實驗儀器總廠）。

1.3 試驗方法

自配TRIzol 試劑法、商品化TRIzon 試劑法操作步驟相同，具體步驟參考孫國勝等［22］的方法；改良CTAB法相比于傳統CTAB法是在配置過程中加入β-硫基乙醇，目的是防止多酚氧化，消除在細胞裂解時釋放的核糖核酸酶，具體操作步驟參考孫國勝等［22］的方法；RNA 提取試劑盒法按照全能型植物RNA 提取試劑盒（DNase I）說明書進行操作。

RNA 提取過程中所用到的研缽、剪刀、鑷子等非一次性器材及工具，均用DEPC 水過夜浸泡處理，高壓滅菌、烘干后使用；離心管、槍頭等均為RNase-free 材料；RNA的溶解、稀釋以及乙醇的稀釋，均使用RNasefree超純水。

1.3.1 RNA純度及濃度檢測 通過使用NanoDrop2000超微量分光光度計對自配TRIzol試劑法、商品化TRIzon試劑法、RNA 提取試劑盒法以及改良CTAB 法四種方法提取得到的竹葉總RNA 濃度和純度進行檢測（檢測前用DEPC水為空白對照調零儀器），并記錄各RNA樣品的濃度及OD260/OD280、OD260/OD230的比值。

1.3.2 RNA完整性檢測 取提取的RNA樣品5 μL，與1 μL 5×RNA Loading Buffer混勻后，在100～120 V電壓條件下，經1%的瓊脂糖凝膠電泳30 min。電泳結束后，經Bio-Rad凝膠成像系統檢查RNA電泳條帶的完整性。

1.4 數據處理及分析

隸屬函數是對多種指標進行綜合評價的一種方法，目前被廣泛應用在植物領域的相關研究中［23-24］。應用隸屬函數法對RNA 的質量進行評價是一種較為科學的方法［25］。

采用SPSS 26 軟件對數據進行差異性及隸屬函數分析；采用Excel 2016 軟件對數據進行匯總、分組及隸屬函數值計算［26］處理；采用Origin 2021 對分析結果進行繪圖。

按照公式計算不同提取方法各項綜合指標的隸屬函數值：

μ(Xi)=(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)i=1，2，3，…，n

式中，Xi表示第i個綜合指標；Xmax表示第i個綜合指標中的最大值；Xmin表示第i個綜合指標中的最小值。

各綜合指標的權重：

式中，Wi表示第i個綜合指標在所有綜合指標中的權重；Pi表示不同提取方法第i個綜合指標的貢獻率。

不同提取方法的綜合優劣評價值：

式中，D值為不同提取方法由各項綜合指標評價所得的綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法提取的竹葉總RNA純度及濃度分析

2.1.1 總RNA 純度分析 RNA 的OD 值是衡量RNA純度高低的一個重要指標，較為理想的總RNA 的OD260/OD280 比值應為1.8～2.1［27］，當OD260/OD280的值小于1.8時，說明RNA中存在較多的污染，這種污染可能是蛋白質或者其他雜質。當OD260/OD280的值大于2.2時，說明RNA已部分降解［28］。OD260/OD230的值作為參考，一般大于2.0 較好。若OD260/OD230 的值低于2.0，則說明提取的RNA有污染［29］，這種污染一般來自蛋白質、鹽類或次生代謝物。

由表2 可知，使用自配TRIzol 試劑法提取的四種樣品總RNA中，除毛竹竹葉的RNA存在少量雜質的污染外，其他三種竹葉的OD260/OD280、OD260/OD230都為1.8～2.1，且RNA 濃度均高于220 ng·μL-1。商品化TRIzon 試劑法提取的總RNA 的OD260/OD280 同樣為1.8～2.1，濃度高于200 ng·μL-1，但OD260/OD230較低，說明該方法提取的總RNA 存在著較多的鹽類、蛋白質等雜質的污染。RNA 提取試劑盒提取的總RNA的OD260/OD280 和OD260/OD230 均較低，濃度偏低，表明RNA存在嚴重的污染，且降解嚴重。改良CTAB法提取的總RNA 的OD260/OD280 和OD260/OD230 略高于RNA提取試劑盒，但濃度低于RNA提取試劑盒。

表2 四種方法提取的竹葉總RNA純度和濃度對比Table 2 Comparison of purity and concentration of total RNA extracted from bamboo leaves by four different methods

綜上，在RNA 的純度上，四種提取方法高低排序依次為：自配TRIzol 試劑法＞商品化TRIzon 試劑法＞改良CTAB法＞RNA提取試劑盒法。

2.1.2 總RNA 濃度分析 RNA 的濃度是衡量所提取的RNA 質量高低的重要標準，若RNA 的濃度較低，則影響后續分子生物學試驗。對不同提取方法得到的RNA濃度進行差異性分析并繪圖，結果如圖2所示，自配TRIzol 試劑法、商品化TRIzon 試劑法得到的總RNA濃度均大于200 ng·μL-1，且顯著高于試劑盒法、改良CTAB 法。除毛竹葉片采用商品化TRIzon 試劑法提取得到的總RNA 濃度高于自配TRIzol 試劑提取法外，自配TRIzol 試劑提取法提取的總RNA 濃度最高，與其他三種方法所得到的總RNA 濃度均有極顯著性差異，說明該方法及商品化TRIzon 試劑法提取的總RNA 濃度較高，提取效果好。而改良CTAB 法及RNA 提取試劑盒法提取的總RNA 濃度均低于150 ng·μL-1，且顯著低于自配TRIzol 試劑法、商品化TRIzon 試劑法，表明改良CTAB 法及RNA 提取試劑盒法不適合用于竹葉RNA的提取。

圖2 四種提取方法提取的RNA濃度差異比較Fig.2 Comparison of RNA concentrations extracted by four extraction methods

綜合四種方法提取的總RNA 的質量及濃度，自配TRIzol試劑法、商品化TRIzon試劑法所提取的總RNA，在質量和濃度上，均優于RNA 提取試劑盒法及改良CTAB 法，并且自配TRIzol 試劑法優于商品化TRIzon試劑法。綜上，自配TRIzol 試劑法為提取不同類型竹葉RNA的最優方法。

2.2 不同提取方法提取的竹葉總RNA完整性分析

瓊脂糖凝膠電泳條帶的質量是評估提取的總RNA完整性最快捷的方法，一般電泳條帶的亮度與提取的RNA 濃度成正比。對于真核生物樣品，完整的總RNA 在進行變性凝膠電泳時會產生清晰的28S 和18S rRNA 條帶，兩條帶的亮度比約為2∶1，并且可以觀察到5S rRNA條帶。

經過電泳，自配TRIzol 試劑法與商品化TRIzon 試劑法提取的總RNA 條帶如圖3所示，自配TRIzol 試劑法提取的總RNA 電泳條帶清晰（圖3-A），28S 和18S rRNA 條帶亮度比接近2∶1，勃氏甜龍竹（D.brandisii）的兩條5S rRNA 條帶較亮（圖3-A、C），表明存在一定的蛋白質污染，其他竹種RNA 條帶無拖尾、彌散，表明自配TRIzol 試劑法提取的竹子葉片的總RNA 質量較高；商品化TRIzon試劑法提取的總RNA 電泳條帶較清晰（圖3-B），可以觀察到28S、18S和5S rRNA條帶，其條帶亮度稍弱于自配TRIzol 試劑法，表明商品化TRIzon試劑法提取的總RNA 濃度低于自配TRIzol 試劑法，該方法提取的總RNA條帶僅一條云南箭竹（F.yunnanensis）出現拖尾現象（圖3-B），說明該方法提取的竹葉的RNA質量總體較高。

圖3 四種提取法提取的竹葉總RNA電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of total RNA extracted from bamboo leaves by four extraction methods

RNA試劑盒法提取的總RNA電泳條帶（圖3-C）較清晰，其中勃氏甜龍竹（D.brandisii）及云南箭竹（F.yunnanensis）葉片提取的總RNA 電泳條帶較亮表明提取濃度較高，但5S rRNA 條帶亮度較高（圖3-C），表明存在蛋白質污染，其他兩種竹葉總RNA 電泳條帶較淺，且毛竹（Ph.edulis）的RNA 電泳條帶存在彌散現象（圖3-C），表明RNA 試劑盒法提取的這兩種竹葉總RNA濃度較低且有降解。

改良CTAB 法提取的竹葉總RNA 電泳條帶中（圖3-D），勃氏甜龍竹（D.brandisii）葉片的 RNA 電泳條帶存在嚴重的拖尾、彌散現象，說明該RNA樣品存在大量的降解、污染，云南箭竹（F.yunnanensis）、巴山木竹（B.fargesii）竹葉RNA 電泳條帶較清晰但有少量拖尾，而毛竹（Ph.edulis）葉片的總RNA 電泳條帶亮度很淺幾乎不可見，表明該方法基本沒有提取出毛竹的RNA。

綜上，四種方法大部分都可以提取出RNA，但濃度差異較大，提取的純度也各有不同。綜合不同提取方法提取的總RNA 的質量、濃度及電泳條帶的完整性，四種方法的優劣性從高到低依次是：自配TRIzol試劑法＞商品化TRIzon試劑法＞RNA提取試劑盒法＞改良CTAB提取法。

2.3 不同提取方法的成本及優缺點分析

綜合比較四種提取方法操作的難易程度、耗時長短、成本及RNA的完整性和濃度，結果如表3所示。自配的TRIzol試劑、商品化TRIzon 試劑以及RNA 提取試劑盒，三種方法提取步驟簡便，操作簡單，耗時較短均在2 h 內；而改良的CTAB 法的耗時15 h，提取時間長，效率低。價格上（表1）自配TRIzol 試劑成本約為0.2 元/樣，遠低于TRIzon 試劑（約4.03 元/樣）和植物RNA 提取試劑盒的提取成本的成本（約16元/樣），改良CTAB法雖成本較低（約0.26元/樣）。四種提取方法中，自配的TRIzol試劑、商品化TRIzon 試劑提取的總RNA 質量顯著優于RNA 提取試劑盒法及改良的CTAB 法（表3），并且自配的TRIzol試劑法提取的總RNA質量要優于商品化TRIzon試劑法（圖2）。綜上，實驗室自配的TRIzol試劑最佳。

表3 不同提取方法綜合比較分析Table 3 Comprehensive comparative analysis of different extraction methods

2.4 采用隸屬函數對不同提取方法進行綜合評價

隸屬函數分析中，D值越接近于1，表明該方法綜合評分越高，其提取效果越好［30］。通過分析比較，自配TRIzol試劑法的D值為0.846，最接近于1；其次是商品化TRIzon試劑法，D值為0.754；RNA提取試劑盒法和改良CTAB法的D值均較低，分別為0.343和0.145（表4）。因此，四種提取方法優劣順序為自配Trizol 試劑法＞商品化TRIzon試劑法＞RNA提取試劑盒法＞改良CTAB法。

表4 不同提取方法隸屬函數分析Table 4 Membership function analysis of different extraction methods

3 討論

3.1 不同提取方法的適用性

不同的植物因其組織成分、內含代謝物質等的不同，適用的RNA提取方法也有很大的差別。RNA試劑盒法在RNA提取中較為常用，適用于鳶尾屬植物［31］、葡萄［32］等植物的RNA提取。本研究采用RNA試劑盒提取四種竹葉的RNA，提取的RNA 降解嚴重，并且濃度較低，且該方法提取成本較高，因此不適用于竹葉RNA提取。

CTAB 法最初被應用在松樹組織的RNA 提取試驗中［33］，目前較為廣泛地被用于多糖和多酚類植物組織的RNA提取［34-36］。改良的CTAB法是在原有的CTAB法基礎上加入適量的β-疏基乙醇和LiCl，用來抑制RNase 活性和沉淀RNA，有助于提高RNA 的提取效率。在其他竹類植物［37-38］的RNA 提取試驗中，同樣采用CTAB 法進行RNA 提取，但提取效果較差。在本研究中，該方法提取的RNA 完整性和濃度都較差，且提取RNA時步驟繁瑣，耗時較長，容易導致RNA降解，證實了改良CTAB法不適宜于竹葉RNA提取。

TRIzol 與三氯甲烷、水飽和酚（酸性）、異丙醇等試劑搭配使用，在植物RNA 提取過程中也較為常用［39］。在毛竹不同組織的RNA 提取中［40］，TRIzol 法提取效果較好。本研究中使用的商品化TRIzon 試劑和自配TRIzol 試劑法兩種方法對不同竹種竹葉進行RNA 提取，結果發現，兩種方法均可以從竹葉中提取到濃度較高的RNA，且完整性較好、電泳條帶清晰明亮；兩種方法耗時均較短，在一定程度上降低了RNA 的降解程度，從而保證RNA 的完整性，進一步說明TRIzol 法在不同竹種竹葉的RNA提取中，適用性高。

在上述結果基礎上，本研究發現相比傳統的TRIzol試劑，商品化TRIzon節約了前期配置試劑的時間，但成本相對較高，平均4.03元/樣；自配的TRIzol試劑保留了TRIzol試劑基本成分，但提取成本降低（平均0.2元/樣），且自配TRIzol試劑的RNA提取效果稍優于商品化的TRIzol試劑，更適用于大規模的植物葉片的RNA提取試驗。

3.2 RNA提取過程中的注意事項

RNA 提取的質量容易受多種因素影響。本研究中為避免樣品反復凍融，試驗材料研磨后分裝保存于超低溫冰箱。為防止核酸酶的影響，研磨樣品所用研缽、研杵均于0.1%的DEPC水中浸泡過夜、高壓滅菌后烘干；使用的離心管、槍頭等一次性耗材均為RNA 提取試驗專用耗材；RNA 的溶解、稀釋及75%乙醇的配制均使用RNase-free 水。為減少RNA 降解，本試驗全程在冰上操作，保持低溫。為減少人為因素的影響，操作人員全程嚴格按照RNA 提取的相關要求進行，樣品的采集、處理、RNA 提取等步驟，均佩戴無菌手套及口罩，保證了該試驗結果的嚴謹性及適用性。

4 結論

綜合提取方法操作的簡便程度、成本高低、提取效率以及總RNA 的純度、濃度等因素，自配TRIzol 試劑法是四種竹葉總RNA 提取的最優方法。此外，商品化TRIzon 法取效果與自配TRIzol 法相比差別不大，但成本較高，可在少量的RNA 提取試驗中使用。RNA 試劑盒法及改良CTAB法在本試驗中提取的RNA純度和濃度較差，且RNA試劑盒法成本高，改良CTAB法耗時較長，兩種方法都不適用于竹葉的總RNA提取。