化學誘變提高植物抗逆性的研究進展

吳正景 職鈐華 劉素娟 張 昊 安冰潔 武靜靜 龍 圓 李辰方

（河南科技大學園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471003）

化學誘變是通過化學誘變劑誘導植物DNA 序列隨機突變，在植物抗逆育種方面受到很多育種家的青睞。隨著組培技術的成熟，近年來利用化學誘變和植物組培技術相結合，獲得了大批抗逆突變體；結合分子育種策略，為植物品種選育提供新途徑。化學藥劑誘變植物始于20世紀初，Ochlkers 在1943年用脲烷處理月見草取得了良好的誘變效果，此后化學誘變育種得以廣泛應用［1］。通過離體培養方法篩選出抗性突變體，最早為Dix 等［2］在1976年用誘變劑甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）處理林煙草和辣椒的耐低溫研究。長期以來，利用化學誘變及逆境選擇壓篩選抗逆突變體在許多植物育種上得到了實現，如小麥［3-4］、綠豆［5］、水稻［6］、辣椒［7］、白菜［8］、馬鈴薯［9］、大豆［10］、甘薯［11］、棉花［12-13］、玉米［14-15］、擬南芥［16］、旱柳［17］等利用化學誘變，分別獲得了抗旱、抗倒伏、耐澇、耐熱、抗寒、耐鹽、抗蟲、耐密植、耐銨鹽的高抗改良植物品種。

1 化學誘變育種的優勢

常規育種在短期內難以獲得新基因和新性狀，誘變育種可拓寬遺傳變異譜，在植物創造突變體種質庫、遺傳材料以及培育新品種等方面發揮作用。在無性繁殖植物中，由于其基因雜合程度高，且為多倍體或非整倍體，通過雜交方式很難快速獲得理想性狀［18］。化學誘變成本低，技術操作可控性強，應用植物種類廣泛，通過篩選突變體后代可得到植物抗逆性品種。化學誘變適合改良綜合性狀良好品種的抗逆性狀，如抗寒、抗病、耐鹽堿等，育種周期短，后代性狀穩定快［19］。

在植物育種研究中，化學誘變能引發較高頻率的突變，與物理誘變相比，化學誘變劑可在一個基因組中作用于一個或多個位點同時引發基因突變，產生的突變頻率和突變比例高［20］。化學誘變和自發突變均是DNA 水平上發生變異，但自發突變率較低。通過化學誘變與植物組培技術相結合，在體細胞無性系變異的基礎上，化學誘變可進一步提高變異機率。利用組培技術可為化學誘變提供大量同質或基本一致的誘變基礎群體，利于進行大量重復試驗，降低常規誘變技術中產生復雜的難以鑒別突變細胞的嵌合體比例［21］。

2 化學誘變育種在植物抗逆方面的應用

植物在生存過程中，可能遭受低溫、旱澇及鹽堿等不良自然環境的影響，導致營養生長和生殖生長受到嚴重損害，用化學誘變劑處理植物可在育種早期增大選擇群體的變異頻率，獲得較多突變材料。化學誘變在越來越多的植物抗逆育種研究中被應用，即通過篩選突變材料，最終可獲得抗逆性增加的突變株。由表1可知，化學誘變能處理植物多部位的器官、組織，但是由于起源材料的不同，突變結果差別較大。愈傷組織和萌動的種子是最常用的誘變材料，隨著植物組培再生體系日趨成熟，通過誘變處理獲得完整突變植株的成功率大幅提高，能夠為今后的抗逆育種研究提供理論基礎。

表1 化學誘變在部分植物抗逆育種方面的應用Table 1 Application of chemical mutagenesis in stress resistance breeding of some plants

3 常用化學誘變劑的誘變機制及處理方式

長期以來，研究者們發現有1 000多種化學物質對植物具有誘變作用［22］，化學誘變劑被植物吸收后，進入細胞核內發生作用，導致DNA 受損，如不能完全修復，則形成突變。化學誘變劑可使植物染色體倍性改良或在植物細胞DNA 復制、轉錄過程中滲入細胞內，替代或嵌入堿基之間，造成染色體變異［23］。化學誘變劑通常分為四類：（1）烷化劑，能直接誘導DNA 分子結構發生變異，主要有EMS、乙烯亞胺（ethyleneimine，EI）、硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）等；（2）堿基類似物，化學結構與核酸堿基類似，能充當DNA 的組成部分嵌入到DNA結構中，導致DNA復制時打破堿基互補配對原則造成堿基配對差錯，由于該類物質與正常堿基在某些取代基團上不同，從而誘發突變，主要有5-溴尿嘧啶（5-bromouracil，5-BU）、5-溴去氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，5-BUdR）等；（3）吖啶類與抗生素，為誘發移碼突變的誘變劑，能結合到DNA 雙鏈上并插入堿基引起單個堿基對結構發生變化從而導致突變，主要包括吖啶橙（acridine orange，AO）、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）、平陽霉素（pingyangmycin，PYM）等；（4）疊氮化物，能與堿基替換從而影響DNA的正常合成，導致點突變的產生，如疊氮化鈉（sodium azide，SA，NaN3）［24］。

烷化劑和疊氮化物廣泛應用于各種植物誘變育種中，效果突出，烷化劑中的EMS 和疊氮化物中的NaN3是目前最具代表性的誘變劑［25］，除此之外，常用的誘變劑還有DES［26］、EI、PYM［27］、甲基亞硝基脲（Nmethyl-N-nitrosourea，MNU），乙基亞硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）等。

3.1 誘變劑作用機理

EMS 極易誘發高頻率等位基因點突變，將烷基加到DNA 的核苷酸鳥嘌呤上，鳥嘌呤和糖之間的結合鍵斷裂，從DNA 鏈上脫落造成DNA 鏈上堿基缺失，在復制時進一步轉化或顛倒，最終導致突變［24］。EMS 誘變具有非定向性，能誘發任意一個基因位點發生突變，引起植物的葉、花、果實等發生明顯變異，突變類型豐富，可建立新的植物突變體庫［28］。EMS 誘變后一般到M3代即可得到穩定遺傳的突變體［29］。

Spence 等［30］研究大麥時發現NaN3具有致突變性，可被用于誘變育種。NaN3是一種呼吸抑制劑，本身不具有誘變效應，不與DNA 直接相互作用，但被植物吸收后，在細胞中產生具有誘變活性的L-疊氮丙氨酸，進入細胞核后，在DNA 復制時導致堿基錯配，從而產生點突變。NaN3在pH 值為3.0 的酸性環境下生成中性HN3，更容易進入細胞膜發生作用［31］。

DES 誘變處理植物愈傷組織時，在DNA 分子的復制和轉錄過程中滲入細胞，與核酸、核苷酸的中心位置鳥嘌呤N-7作用，誘發染色體變異，最終導致愈傷組織表現出突變類型［32］。

PYM抑制胸腺嘧啶核苷參與DNA復制，產生3'-磷酸末端引起DNA斷裂，導致植物染色體畸變［23］。

3.2 單一處理誘變

在植物化學誘變中，單純用一種誘變劑對植物材料進行誘變處理，做法相對簡單，能深入研究該誘變劑對該材料的誘變規律，對于所使用的誘變劑種類而言，單一誘變能引發部分性狀突變，但誘變譜較單一［33］。

3.3 復合處理誘變

與單一處理方法相比，復合處理可擴大突變譜，獲得更豐富的突變材料，利用一種化學誘變劑與物理輻射或其他化學誘變劑復合使用，兩種方法對于不同植物的處理效果不同。孫榕［33］用甘薯莖段為材料，采用60Coγ 輻射誘變、EMS 誘變以及二者復合誘變的方法，物理輻射破壞細胞膜，促進化學誘變劑滲透吸收，綜合考慮存活率、變異率、損傷效應，確定30 Gy60Coγ射線與0.2% EMS 誘變2～3 h 的復合處理為最佳誘變處理，最終獲得了甘薯耐1.2% NaCl 的突變體。付鳳玲等［34］發現復合處理比單一使用60Coγ 射線效果好，用60Coγ 射線和NaN3復合誘變玉米的愈傷組織，最終篩選得到了耐旱株系和雄性不育株。相反，任學良等［35］發現單一使用60Coγ 射線對煙草M1代各性狀的誘變效應更好，優于NaN3處理和兩者的復合處理；但是，復合處理大大提高了M2代的突變頻率。綜上，不同誘變處理方式的結果各異，復合誘變對不同植物產生的誘變影響不同。

4 影響化學誘變育種的因素

4.1 遺傳因素

化學誘變的起始材料直接關系到誘變的效率和結果，要考慮其整齊性，以及獲得再生突變植株的難易程度。理想的誘變起始材料是原生質體和懸浮細胞，誘變上述單細胞或少數細胞產生不定芽，誘變率高，同質突變體易篩選，但是多數植物難獲得再生植株，培養技術相對較難［36］。化學誘變處理的材料取決于植物本身，有性繁殖植物（如水稻）的首選材料是種子，易進行大量誘變處理，利于運輸和儲存；對于無性繁殖植物（馬鈴薯、木薯等），隨著組培技術進步和經驗積累，誘變植物的材料已發展到包括塊莖、根莖、鱗莖、莖段、花粉、不定芽、枝條、愈傷組織以及細胞培養物［33］。

相比而言，愈傷組織是化學誘變的首選材料，利于誘變劑高效進入到細胞團內部發揮作用［34］，例如EMS誘變草莓愈傷和葉片，經對比發現愈傷獲得突變再生植株更耐鹽［37］。也有研究建議愈傷組織的繼代次數不宜過多，超過3代會影響誘變效果和植株分化［38］。

不同作物品種對誘變劑的敏感性不同，NaN3誘變處理兩個燕麥品種，M1代各指標除旗葉寬和有效分蘗數外，青永久709 品種的指標變幅均大于愛沃品種，說明青永久709 品種對NaN3反應更敏感［39］。崔燕［40］用EMS誘變莧菜種子發現，0.8% EMS處理4 h，紅葉莧菜種子的發芽率為46%；綠葉莧菜種子在0.6% EMS 處理8 h 時，發芽率為55%。對于誘變劑的敏感性，不同的品種間會表現出明顯的差異。

誘變育種前需要對起源材料的遺傳背景和次級代謝途徑了解清楚，結合植物組織培養的環境條件，根據組培植物的細胞倍性、染色體大小、基因位點的雜合程度、細胞活性的生理狀態以及誘變環境條件設計出有效的處理方案，提高突變體的誘變效率［41］。

4.2 誘變劑的處理方式

用誘變劑處理植物的方法主要有：液體浸泡法［42］、離體共培養法［43］、涂抹法［44］、滴苗法［45］、注射法［46］等，讓誘變劑與植物材料充分接觸。低劑量NaN3加入固體培養基共培養的處理方式，操作簡便，可獲得較多突變［43］。孫榕［33］將EMS 加入固體培養基和利用EMS 浸泡處理甘薯莖段，對比發現浸泡效果最好。相反，用EMS 溶液處理冰燈玉露胚性愈傷，分別采取浸泡法和混培法（共培養），結果發現浸泡法未能得出最佳誘變劑量，而混培法得到了理想的半致死劑量［47］。誘變劑加入培養基的方法相對簡單，容易觀察外植體在誘變劑不同濃度下的生長反應。究其未被廣泛應用的原因，可能是由于EMS 不易溶于水，加入固體培養基的EMS 會分解形成有機酸，對處理材料作用時間較長，增強毒害作用，降低誘變效果，或無法控制長期接觸造成的DNA損傷，后代無法獲得生長植株。

根據不同育種目標，有針對性地選用誘變劑處理方式，液體浸泡法適合萌動的種子、愈傷等，涂抹法、滴苗法和注射法更適合在活體植株的幼苗或成熟花器官上進行誘變處理。EMS 對西瓜會產生誘變效應，分別采用浸種法和滴苗法構建了表型豐富的西瓜突變體庫［45］。王傳堂等［48］在花生盛花期將EMS 溶液注射到已開放花朵的龍骨瓣內，篩選獲得了具有較強耐旱特性的優良突變系。NaN3處理種子最好在DNA 活躍狀態，需要提前浸種，使種子處于萌動狀態［31］。

4.3 誘變劑的處理濃度和時間

最佳劑量取決于植物物種和基因型，誘變劑濃度和處理時間影響誘變頻率。經過多年研究發現，半致死劑量（median lethal dose，LD50）是用于誘變育種的最佳劑量，指經誘變處理后材料存活率為50%的劑量［49］，半致死劑量一方面是為了保證材料有較高的突變率，另一方面保證材料不會因為過度誘變導致死亡，為后續篩選得到突變體做準備。

對于某些材料，為保證得到一定數量的突變體植株，也有觀點認為LD20劑量適合自交系植物或綜合性狀良好的突變品種，用80%的存活率作為誘變劑適宜劑量的選擇指標［18］。草莓愈傷組織經EMS 半致死濃度誘變后，不定芽再生率很低，會降低突變株選擇的機會［37］。香蕉莖尖經半致死劑量EMS 處理，植株后續無法生根［25］。

不同材料對化學誘變劑的敏感性不同，不管是高濃度短時間處理或者低濃度長時間處理，都可以使誘變劑充分滲入到細胞中發揮作用，為了避免高濃度誘變劑對細胞生理毒性過強，實際操作中一般按照低濃度、長時間處理的原則［50］。但是，獼猴桃海沃德葉片在2% EMS處理6 h和6% EMS處理2 h的條件下，存活率接近50%，但其存活葉片的胚性愈傷組織分化率以6% EMS 處理2 h為最高，確定6% EMS 處理2 h為半致死濃度［51］。

同一種誘變劑，根據材料不同，采用不同的處理濃度和時間，以種子為誘變材料時要考慮到種子的種皮厚度、密度和硬度，向日葵種子需要較高濃度EMS 和長時間處理才能起到誘變效果，而種皮較薄的種子（小麥、水稻、芝麻等）需要低濃度短時間處理，由于向日葵類型不同，種皮也具有差異，油用向日葵適宜劑量為EMS 濃度1.0%～1.5%處理12～14 h，食用向日葵適宜劑量為同等濃度處理6～12 h［52］。

4.4 溫度

化學誘變劑的水解速度受溫度影響較大，誘變劑在低溫條件下能較長時間保持穩定性，與被處理材料發生緩和作用，誘變過程中溫度升高會加速誘變劑在培養材料內的作用能力，化學誘變溫度通常選擇在20～25 ℃范圍內［21］。如化學誘變劑處理種子，可先將種子與誘變劑在低溫下中浸泡足夠時間，使誘變劑能進入胚細胞，再將種子移入稍高溫度處理，以提高誘變劑在種子內部的反應速度［53］。在誘變劑濃度和處理時間相同的條件下，不同浸種溫度對芝麻種子的萌發有明顯影響，4 ℃浸種過夜的芝麻品種對EMS 和NaN3的敏感性比25 ℃浸種高，低溫浸種能夠更好發揮EMS和NaN3的作用［50］。王小華等［26］研究發現，在10、15、20、25 ℃不同溫度下，DES 在10 ℃處理效果最佳，得到更多抗寒苗，誘變除了在室溫下進行，其他溫度對誘變效果的影響也不容忽視。

4.5 pH值影響

溶解化學誘變劑溶液的pH 值應選擇中性或微酸性（pH 值為6.0～7.0），以減少誘變劑本身的分解。總體而言，化學誘變劑濃度和處理時間、溫度、pH 值等條件，都要根據實際的植物材料進行調整。大部分烷化劑受水溶性限制，在水中不易溶解，需搭配一定酸堿度的磷酸緩沖液使用，一般現配現用，EMS在水中溶解度較低（8%），通常用pH 值7.0 的中性磷酸緩沖液作為EMS 的溶解劑，DES 用pH 值8.0 的磷酸緩沖液作為溶解劑。誘變劑受pH 的影響大，如NaN3在pH 值3.0 的酸性介質中誘變效果更好［34］。研究發現，pH 值3.0 的磷酸緩沖液對西瓜種子萌發和幼苗生長基本沒有影響，和對照之間沒有顯著差異；但是NaN3加入pH 值3.0 的磷酸緩沖液后，抑制種子胚根和子葉開展，影響不定芽分化、再生、伸長和生根［41］。

4.6 組培環境

常規育種技術存在自然突變率低、育種周期長、不利于大規模育種等問題，利用快速、便捷的途徑培育出新種質一直是育種中的熱點問題，化學誘變可提高細胞有益突變率10～100 倍［22］。組培環境是外植體組培成功的關鍵，培養基成分及溫度、光照、相對濕度等條件都會影響組培的效率，需在環境控制、人工操作等方面采取相應措施［54］。理論上認為，組培細胞通過有絲分裂產生基因型一樣的細胞，但是無誘變劑情況下，組培環境本身就可導致后代植株出現大量變異，火龍果組培苗在擴繁到第4代已發生突變，突變率為9.1%［55］。若在培養過程添加輻射或化學誘變試劑，變異率會更高。

4.7 突變體篩選方式

對于誘變后的突變材料，進行定向篩選是必要環節，根據研究目的，合理設計篩選條件，比如在培養基加入病毒或其他化合物，淘汰正常細胞，留下突變細胞［33］。將誘變材料接種在加入高鹽的培養基中，可篩選耐鹽突變體［40］，或改變溫度條件，篩選耐低溫突變體［32］。在耐旱植物的研究中，篩選劑有NaCl、PEG、HYP等。為避免突變材料全部死亡，篩選力度應逐步增加。多數研究者參考兩步篩選法，如抗寒突變體先在0和7 ℃條件下篩選，再在-7 ℃條件下篩選［38］。為了得到DES 誘變后的抗L-Hyp 變異愈傷，先在較低劑量0.4 g·L-1L-Hyp下初篩，再在較高致死劑量0.5 g·L-1LHyp條件下復篩［26］。

為了防止生理適應性的假陽性植株，將誘變材料用不含鹽和含鹽的培養基交替2 次培養，最后在含1.0% NaCl的生根培養基上獲得突變株［51］。為消除百合耐鹽堿的生理適應性變異，EMS誘變處理后，將百合小鱗莖轉接到含NaHCO3的培養基，1～2 個月后轉接到MS 培養基，培養1～2 個月后再將其轉接到含NaHCO3培養基，反復繼代3～5次，對存活的材料進行耐鹽堿比較［56］。通過篩選獲得的突變植株，測定生理指標作為脅迫條件下再生植株的抗逆指標，建立生理指標與抗逆性狀的相關性，能夠在早期篩選出具有有利突變性狀的再生苗，從而大幅度減少突變體篩選的工作量，為植物的抗逆育種提供基礎研究數據［36］。

4.8 其他

由于化學誘變本身的不定向性，結果可能是有益突變、有害突變或者中性突變。突變后代群體也可能會出現有益突變和有害突變伴生的情況，例如玉米誘變后代的雄性不育株系，其抗紋枯病能力下降［34］。理論上誘變群體規模越大越利于篩出目標性狀突變體，為了增加有利突變的頻率，又能定向獲得理想的突變體，可增加單一誘變處理次數，結合復合誘變增寬突變譜，與其他好的育種技術結合，取長補短擴大誘變群體，提升篩選概率［36］。利用基因編輯等技術誘發基因在指定位點發生特定突變，可以做到定向誘變［57］。

化學誘變劑可能具有不等同性，例如，利用EMS和NaN3分別處理大豆種子，對M4代進行鑒定，NaN3誘變獲得了具有抗草甘膦的突變株系，EMS 處理沒有篩出抗性植株［58］，是否因為EMS濃度低且誘變時間短導致誘變率低，進而沒有抗性突變體產生，值得進一步研究。

植物化學誘變可能會出現效應遲發現象，即誘變當代不表現而后代表現出目標性狀，像誘變林木植物至少需要兩代篩選才能獲得性狀穩定的新突變品種［59］。相反，武銀玉等［60］用EMS 處理晉麥90 號小麥種子，對選擇出的突變體M3代進行抗寒性鑒定，結果顯示抗寒性強的突變體數目明顯少于M2代，推測這是一種效應衰退現象。

5 展望

化學誘變技術被廣泛應用于植物的性狀改良，增加種質資源突變體庫，是培育抗旱、抗寒、耐鹽堿、廣適、高產等優良抗逆新品種的有效手段。化學誘變產生突變的無方向性以及化學誘發的細微點突變，一般的檢測方法難以快速識別，增加了后代篩選的難度，限制了化學誘變育種發展。關于植物在逆境環境下的生理變化及抗逆反應的研究已較成熟，但鮮有將所有生理生化變化的分子機制研究透徹。在化學誘變育種過程中，應當注意分子測序與分子標記選擇技術相結合，在分子水平上檢測突變的發生，通過轉錄組測序與分析，篩選和得到控制植物目標性狀的關鍵基因。對植物在逆境下產生的許多與逆境反應相關的功能蛋白質進行定位，測序獲得基因序列，利用基因工程的手段將其轉化到植物中。通過分子手段將這些關鍵基因對植物進行遺傳改良，加速植物改良進程，拓寬誘變技術在植物抗逆性狀改良方面的應用，是提髙植物抗逆育種的有效途徑之一。