電子束輻照對藏藥唐古特鐵線蓮主要活性成分及滅菌效果的影響

王回霞 謝和兵，4，* 尼瑪次仁 白瑪旦增

（1安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3江蘇神猴醫藥研究有限公司，江蘇 南通 226133；4西藏神猴藥業有限責任公司，西藏日喀則 857000）

唐古特鐵線蓮［Clematistangutica（Maxim.）Korsh.］，又稱甘青鐵線蓮，其藏語名為“葉芒那布”，是一種毛茛科（Ranuncuia）植物，收錄于1995年版《中華人民共和國衛生部藏藥標準第一冊》，藥材標準編號為“WS3-BC-0086-95”［1］，具有祛寒、增生胃火、活血通淤和破痞瘤積聚等功效［2-3］?，F代研究表明，鐵線蓮植物中主要含有以齊墩果烷型五環三萜為主的皂苷類成分和以黃酮糖苷為主的黃酮類成分，此外，還有香豆素、木脂素、生物堿、酚類、揮發油及其他微量元素成分［4-7］。其中，皂苷類活性成分具有抗腫瘤［8］、抗菌抗炎［9-10］、心肌保護［11］、抗血栓［12-13］等藥效作用，黃酮類活性成分具有神經保護、降血壓、改善學習記憶［14］、抗血糖［15］、抗心肌缺血［16］、抗炎［17］、抗腫瘤［18］等藥理作用，因而被用于治療消化不良、黃水病、寒性腫瘤、心血管等疾病［19-21］。由于唐古特鐵線蓮藥材采用曬干的炮制工藝，其微生物水平無法得到有效控制，導致藥材在儲存過程中易發生霉變，本研究前期采用了藏藥常用的濕熱、干熱等熱滅菌工藝控制藥材的微生物水平，發現熱滅菌后藥材的性狀明顯改變、總黃酮含量顯著降低。因此，熱滅菌工藝并不適用于該藥材的微生物控制。

電子加速器輻照滅菌主要利用電子加速器產生的高能電子束照射物質以達到滅菌目的，是一種新型的滅菌技術，相比傳統的熱滅菌技術，最大的優勢在于電子束滅菌屬于冷滅菌，穿透性更高、更環保且更適用于含生藥材粉以及含熱不穩定性、揮發性成分的藥材的滅菌［22-24］，高能電子束滅菌產業是國家大力鼓勵發展的新興產業，被列入國務院2016年11月29日印發的《“十三五”國家戰略性新興產業發展規劃》［25］。電子束在輻射加工高分子材料、輻照食品、環境廢物處理、育種及消毒等方面發展迅速［26］，但目前西藏輻照加工產業仍為空白，藏藥生產企業普遍采用熱滅菌技術控制微生物，難以保證藏藥的質量、臨床療效的穩定性，關于藏藥材的電子束滅菌研究報道較少。

因此，本研究將電子束輻照應用于藏藥唐古特鐵線蓮的滅菌，以藥材的性狀、顯微特征、齊墩果酸薄層、槲皮素與總黃酮含量、指紋圖譜相似度以及微生物水平為綜合評價指標，考察不同吸收劑量的電子束輻照對藥材主要活性成分和滅菌效果的影響，同時建立輻照吸收劑量與有效成分含量、微生物水平的相關性，旨在探究電子束輻照滅菌方法對唐古特鐵線蓮藥材滅菌的適用性，為唐古特鐵線蓮藥材及其制劑的輻照滅菌提供參考依據，也為含熱不穩定性成分的藏藥的輻照滅菌提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

唐古特鐵線蓮藥材由西藏神猴藥業有限責任公司提供，經尼瑪次仁副主任藏藥師鑒定為正品；蘆丁對照品（純度為92.2%）、槲皮素對照品（純度為99.1%），中國食品藥品檢定研究院；鹽酸，上海泰坦科技股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，安徽時聯特種溶劑股份有限公司；磷酸、無水氯化鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司（上海）。

1.2 儀器與設備

UV-1900型紫外分光光度計、LC-16A型液相色譜儀，日本島津公司；色譜柱UItimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），月旭科技（上海）股份有限公司；XSR205DU/AC 梅特勒電子天平，上海微峰生物技術有限公司；UC-250DE 超聲清洗器、HH-6型恒溫水浴箱、SHZ-DC（III）循環水式多用真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司；KWF-20超微粉碎機，浙江瑞昊機械制造有限公司；CR9分光色差儀（配粉末測試盒），深圳市三恩時科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備及輻照處理 將唐古特鐵線蓮藥材粉碎過6 號篩，分別滿裝于聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）瓶中，每個吸收劑量組3瓶，共18瓶，每瓶15 g。所有樣品均由中廣核（深圳）戈瑞科技有限公司采用10 Mev 電子加速器單面輻照處理，吸收劑量分別為0、2、4、6、8、10 kGy。

1.3.2 性狀比較 輻照前后的唐古特鐵線蓮粉末顏色測定參考武艷雪等［27］的方法，采用分光色差儀，對儀器黑白板校正后進行測定，并記錄樣品粉末的L、a、b值，根據公式計算總色差ΔE。比較輻照前后樣品色澤的變化，并通過雙盲多人次鼻嗅的方式判斷輻照前后氣味的變化。

式中，ΔL、Δa、Δb分別為輻照后唐古特鐵線蓮粉末L、a、b與未輻照的差值。

1.3.3 顯微鑒別 取唐古特鐵線蓮粉末少許，置于載玻片上，滴加少量水合氯醛，于酒精燈上進行透化，再滴加入少量甘油醋酸試液，蓋上蓋玻片，置生物光學顯微鏡下操作觀察。

1.3.4 薄層鑒別 取不同吸收劑量（0、2、4、6、8、10 kGy）的唐古特鐵線蓮藥材粉末各1 g，置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷10 mL，密塞，超聲（250 W，40 kHz，40 ℃）提取30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加入甲醇-三氯甲烷（1∶3）2 mL 溶解即得供試品溶液。另取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg齊墩果酸溶液，即得齊墩果酸對照品溶液。吸取上述齊墩果酸對照品溶液與各供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠（含黏合劑）薄層板上，隨即浸入1%碘-二氯甲烷溶液中至剛過起始線，迅速取出，立即用玻璃板覆蓋30 min后取下玻璃板，揮去薄層板上殘留的溶液，以環己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于日光下檢視。

1.3.5 槲皮素含量的測定

1.3.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品10.02 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得槲皮素對照品母液。精密吸取2 mL 對照品母液于20 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成質量濃度為0.019 9 mg·mL-1槲皮素對照品溶液，0.45 μm有機微孔濾膜濾過，即得槲皮素對照品溶液。

1.3.5.2 供試品溶液的制備 稱取唐古特鐵線蓮粉末約3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇60 mL，超聲提取1 h，取出冷至室溫，搖勻，濾過，濾液濃縮至干，殘渣加甲醇-25%HCl 溶液（4∶1）混合液25 mL，加熱回流30 min，冷卻；定容至25 mL容量瓶中，搖勻，經0.45 μm有機微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.3.5.3 色譜條件 色譜柱為UItimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶乙腈∶0.2%磷酸（40∶10∶50）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長360 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

1.3.5.4 樣品測定 取不同吸收劑量下的唐古特鐵線蓮粉末，按“1.3.5.2”制備供試品溶液，將上述對照品溶液與制備的供試品溶液按“1.3.5.3”進行測定。采用外標法計算輻照前后唐古特鐵線蓮藥材粉末中槲皮素的含量。

1.3.6 總黃酮含量的測定

1.3.6.1 蘆丁標準曲線 精密稱取蘆丁對照品10.03 mg，加入40%乙醇定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，即得0.200 6 mg·mL-1的對照品儲備液。精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL 分別置于25 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加10%氯化鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入氫氧化鈉試液10 mL，搖勻靜置15 min，于波長509 nm 處測定吸光度，以質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標、吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.6.2 供試品溶液制備 精密稱取唐古特鐵線蓮粉末（過6號篩）2 g，加入40%乙醇25 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，殘渣再分別加40%乙醇25 mL，回流2 次，每次1 h，濾過，合并濾液置100 mL 量瓶中，用40%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.6.3 精密度試驗 精密吸取按“1.3.6.2”制備的供試品溶液1.5 mL 于25 mL 量瓶中，按“1.3.6.1”顯色方法操作，連續測定6次，記錄吸光度。

1.3.6.4 穩定性試驗 精密吸取“1.3.6.2”制備的供試品溶液1.5 mL 于25 mL 量瓶中，按“1.3.6.1”顯色方法操作，于15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min時進行測定，記錄吸光度值。

1.3.6.5 重復性試驗 按“1.3.6.2”制備6 份供試品溶液，分別吸取1.5 mL 于25 mL 量瓶，按“1.3.6.1”顯色方法操作，記錄吸光度值。

1.3.6.6 加樣回收率試驗 精密吸取“1.3.6.1”下蘆丁對照儲備液2 mL、“1.3.6.2”制備的供試品溶液0.5 mL，置同一25 mL 量瓶中，平行配制6 份，按“1.3.6.1”顯色方法操作，記錄吸光度值，計算回收率。

1.3.6.7 樣品總黃酮含量測定 取不同吸收劑量的唐古特鐵線蓮粉末，按“1.3.6.2”制備供試品溶液，再按“1.3.6.1”顯色方法操作，測定吸光度值，根據回歸方程計算總黃酮含量。

1.3.7 微生物限度測定 參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部［28］1105 微生物計數法、1106 控制菌檢查法和1107 非無菌藥品微生物限度標準，對輻照前后唐古特鐵線蓮粉末細菌菌落總數、霉菌和酵母菌總數及大腸菌群進行檢查。

1.4 數據處理

運用SPSS 26.0 分析軟件進行數據處理，以0 kGy樣本作為對照組，采用配對樣本t檢驗進行比較，P＜0.05 為差異有統計學意義；運用國家藥典委員會發布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）［29］”對所得色譜圖進行處理，對輻照前后唐古特鐵線蓮粉末色譜圖進行相似度分析，以0 kGy 供試品色譜圖為參照，計算相似度。

2 結果與分析

2.1 輻照前后性狀觀察

輻照前后唐古特鐵線蓮粉末均有濃郁的香草氣味，無明顯變化，輻照前后粉末色澤（圖1）及其L、a、b值（表1）均未見明顯差異，說明電子束輻照對唐古特鐵線蓮粉末外觀色澤、氣味無影響。

2.2 輻照前后顯微鑒別

唐古特鐵線蓮粉末在顯微鏡下可見淡黃色，表面具細小顆粒狀雕紋的花粉粒，淡黃色，類多角形，壁連珠狀增的表皮細胞，成束或離散的長條形木纖維，導管多為梯紋導管。輻照后唐古特鐵線蓮的顯微特征圖無明顯變化，說明電子束輻照對唐古特鐵線蓮粉末顯微特征無明顯影響（圖2）。

圖2 輻照前后唐古特鐵線蓮粉末顯微圖Fig.2 Microscopic view of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh powder before and after irradiation

2.3 薄層鑒別

在供試品色譜中，經0、2、4、6、8、10 kGy 吸收劑量輻照的唐古特鐵線蓮粉末在與齊墩果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點（圖3）。

圖3 唐古特鐵線蓮粉末輻照前后薄層色譜圖Fig.3 Thin layer chromatogram of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh powder before and after irradiation

2.4 輻照前后槲皮素含量及高效液相色譜圖相似度

不同吸收劑量輻照下唐古特鐵線蓮粉末中槲皮素的含量見表2，輻照前后唐古特鐵線蓮粉末中的槲皮素含量無顯著差異（P＞0.05）；不同吸收劑量輻照下唐古特鐵線蓮粉末中槲皮素含量測定色譜圖及圖譜相似度分別見圖4和表3。結果顯示，不同吸收劑量滅菌下的唐古特鐵線蓮粉末圖譜相似度高達0.997 以上，表明2～10 kGy 輻照未對唐古特鐵線蓮粉末的化學成分一致性產生影響。

表2 不同吸收劑量下唐古特鐵線蓮粉末中槲皮素的含量（n=2，±S）Table 2 Quercetin content in Clematis tangutica（Maxim.）Korsh powder under different absorption dose（n=2，±S）

表2 不同吸收劑量下唐古特鐵線蓮粉末中槲皮素的含量（n=2，±S）Table 2 Quercetin content in Clematis tangutica（Maxim.）Korsh powder under different absorption dose（n=2，±S）

吸收劑量Absorbed dose/kGy P值P value 0 2 4 6 8 1 0槲皮素Quercetin/（mg·g-1）0.330 4±0.020 7 0.336 0±0.020 6 0.328 4±0.008 5 0.340 8±0.001 2 0.310 2±0.005 1 0.321 3±0.001 4 0.711 0.867 0.390 0.145 0.444

表3 不同吸收劑量對唐古特鐵線蓮粉末色譜圖相似度的影響Table 3 Effect of different absorption dose on the similarity of the Chromatogram of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh powder

圖4 不同吸收劑量的唐古特鐵線蓮粉末指紋圖譜共有峰及共有模式圖Fig.4 Common peaks and patterns of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh powder fingerprint at different absorption dose

2.5 總黃酮測定方法學考察及輻照前后總黃酮含量

2.5.1 蘆丁標準曲線 線性擬合方程為：Y=0.013 1X+0.001 8，r=0.999 8，表明蘆丁在7.398 1～44.388 8 μg·mL-1范圍線性關系良好。

2.5.2 精密度試驗 計算得相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.19%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 計算得RSD 為1.56%，表明供試品溶液在60 min內穩定性良好。

2.5.4 重復性試驗 計算得RSD 為1.15%，表明該方法的重復性良好。2.5.5 加樣回收率試驗 由表4 可知，計算測得平均回收率為102.7%，RSD 為0.45%，表明該方法具有良好的回收率，準確度高，可行性較好。

表4 總黃酮加樣回收率試驗結果（n=6）Table 4 Test results of total flavonoids sample recovery rate（n=6）

2.5.6 輻照前后總黃酮含量 不同吸收劑量下唐古特鐵線蓮粉末中總黃酮含量測定結果見表5，輻照前后的唐古特鐵線蓮粉末中總黃酮含量無顯著差異（P＞0.05）。

表5 不同吸收劑量對唐古特鐵線蓮粉末中總黃酮含量的影響（n=2，±S）Table 5 Effect of different absorption dose on total flavonoids content in Clematis tangutica（Maxim.）Korsh powder（n=2，±S）

表5 不同吸收劑量對唐古特鐵線蓮粉末中總黃酮含量的影響（n=2，±S）Table 5 Effect of different absorption dose on total flavonoids content in Clematis tangutica（Maxim.）Korsh powder（n=2，±S）

吸收劑量Absorbed dose/kGy P值P value 0 2 4 6 8 1 0總黃酮Total flavonoids/（mg·g-1）30.643 1±2.035 1 28.221 6±0.916 2 28.664 0±0.443 7 28.921 4±1.119 5 28.664 9±1.068 0 27.693 0±0.110 9 0.093 0.146 0.202 0.152 0.062

2.6 微生物限度變化

輻照前唐古特鐵線蓮粉末的微生物限度均不符合《中華人民共和國藥典》2020年版四部［28］中非無菌藥品微生物限度標準（需氧菌總數≤2×103g-1，霉菌、酵母菌總數≤200 CFU·g-1，控制菌大腸埃希菌不得檢出）。經過電子束輻照后，細菌菌落數、霉菌、酵母菌菌落總數均顯著下降（P＜0.05），當吸收劑量為6 kGy 時，唐古特鐵線蓮粉末的微生物限度符合《中華人民共和國藥典》2020年版四部［28］規定（表6）。

表6 不同吸收劑量對唐古特鐵線蓮微生物限度的影響（n=3）Table 6 Effect of different absorption dose on the microbial limit of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh（n=3）

3 討論

3.1 電子束輻照對氣味的影響

輻照在食品工業領域的應用最為廣泛，輻照食品不但能夠保留食品的營養成分，還能夠殺滅致病菌，提高食品的安全性并延長保質期，具有明顯優勢。但也有一定局限性，如輻照會使食品特有的香氣損失，同時，也產生令人不愉快的“輻照臭味”。研究表明，輻照味主要與輻照劑量過大、包裝材料選擇不當以及食品中含硫蛋白質、油脂分子經輻照會發生分解、氧化等變性產生甲硫醇、硫化氫、含氧酸、酮酸和內酯等異味物質有關［30-35］。

本研究結果表明，唐古特鐵線蓮藥材經輻照后并未產生明顯的“輻照臭味”，主要的原因是本研究所用唐古特鐵線蓮藥材中的油脂、蛋白質成分含量較低，經輻照后油脂、蛋白質分解較少。此外，也有可能是本研究輻照處理的樣本采用性質穩定的聚對苯二甲酸乙二醇酯瓶裝，且樣本量較少，“輻照臭味”未能通過鼻嗅的方式辨別出來。

3.2 電子束輻照對黃酮成分的影響

黃酮類化合物結構中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團，并常與糖結合成苷。輻照時，一方面使藥材中的黃酮與糖結合而成的黃酮苷分解，導致黃酮含量增加［36］，另一方面黃酮類成分的分子結構中存在的酚羥基具有強還原性，電子束輻照使藥材中含有的水發生電離產生具有強氧化性的氧離子，導致黃酮A 環與B 環脫離，降低黃酮含量［37］，因此，電子束輻照后藥材中黃酮成分含量變化是輻照效應評價的重要指標［38-41］。

本研究結果表明，經2～10 kGy 吸收劑量輻照后，唐古特鐵線蓮粉末中槲皮素、總黃酮含量隨輻照劑量的增加呈波動變化，總體呈下降趨勢，但差異均不顯著，這可能與所選用的研究樣品為曬干炮制品，水分含量較低，電離產生的氧離子較少，黃酮分解速度較慢有關。此外，本研究也提示了唐古特鐵線蓮藥材采用電子束輻照滅菌時，應采用干燥品，并嚴格控制藥材中水分，水分含量過高可能會導致黃酮含量降低，可根據不同水分含量樣品經輻照后的總黃酮含量變化確定藥材中水分控制的限度。本研究結果為以黃酮類成分作為有效成分的藥材、成藥的電子束滅菌提供了參考。

4 結論

2～10 kGy 吸收劑量的電子束輻照后，唐古特鐵線蓮藥材性狀、顯微、齊墩果酸薄層、總黃酮和槲皮素含量未見明顯變化，指紋圖譜相似度達0.997 及以上，且當吸收劑量達6 kGy 時微生物水平符合《中華人民共和國藥典》2020年四部規定。綜上，電子加速器輻照適用于唐古特鐵線蓮藥材滅菌。