基于功能化介孔二氧化硅的貽貝中磷脂選擇性純化研究

水若凡 代康慧 李倩云 王丹麗 袁婷蘭 李 玲 龔金炎 宋恭帥

（浙江科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023）

貝類具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，含豐富的磷脂、蛋白質(zhì)、長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）及礦物質(zhì)等，具有保肝利膽、消炎解毒及預(yù)防老年人動(dòng)脈硬化和心血管疾病等功效［1-2］。磷脂是細(xì)胞膜的主要組成成分，由甘油骨架和兩個(gè)疏水性脂肪酸組成，如二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等［3］。磷脂具有多種生理活性功能，如保持細(xì)胞膜的完整性、防止細(xì)胞膜過(guò)氧化、降低炎癥活動(dòng)和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)等［4-5］。目前，磷脂提取與純化一般采用液液萃取法與固相微萃取（solid-phase extraction，SPE）法［6］。SPE 因其高準(zhǔn)確性、強(qiáng)選擇性及易操作性而被廣泛用于磷脂純化［7-8］。例如，Liu 等［9］利用常規(guī)的商用二氧化硅（SiO2）SPE小柱富集人乳中的磷脂。

隨著技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的新型材料被用于純化磷脂。介孔二氧化硅（KCC-1）是一種新型的呈放射狀結(jié)構(gòu)的微球，具有大孔容積、高比表面積和機(jī)械強(qiáng)度等特點(diǎn)，在分離、吸附及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域均得到較好的應(yīng)用［10］。然而KCC-1 本質(zhì)為SiO2，缺乏反應(yīng)活性中心，在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性，故需要對(duì)其進(jìn)行功能化修飾來(lái)強(qiáng)化其性能進(jìn)而拓寬應(yīng)用范圍［11］。對(duì)于介孔材料的功能化修飾，通常利用化學(xué)方法負(fù)載金屬氧化物或非金屬氧化物、引入有機(jī)官能團(tuán)以及雜原子取代無(wú)機(jī)骨架等來(lái)實(shí)現(xiàn)［12-13］。二氧化鈦（TiO2）是一種常見(jiàn)的金屬氧化物，表面的路易斯酸-堿活性作用位點(diǎn)與磷酸基團(tuán)（PO43-）有很強(qiáng)的結(jié)合力，具有吸附磷脂的能力［14-15］。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是以sp2和sp3雜化結(jié)構(gòu)連接的二維碳材料，具有較好的導(dǎo)熱性能、較大比表面積及良好的機(jī)械強(qiáng)度，表面存在大量環(huán)氧基、羥基、羧基等官能團(tuán)［16］。但在范德華力作用下，GO片層間易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象從而限制其在某些領(lǐng)域的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，將GO 與生物質(zhì)硅材料結(jié)合形成復(fù)合材料可充分發(fā)揮GO的優(yōu)異特性［17-18］。

本研究采用微乳液法制備KCC-1 微球，并通過(guò)水蒸氣內(nèi)部水解法對(duì)其進(jìn)行功能化修飾，分別合成TiO2/KCC-1 和GO/KCC-1 材料，再利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）、原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）等技術(shù)表征所制備材料的形貌結(jié)構(gòu)，而后將兩種新型材料作為填料制成SPE柱。以貽貝為原料，采用改良的Bligh-Dyer（B&D）法提取脂質(zhì)。最后，通過(guò)建立的SPE 法結(jié)合親水相互作用色譜與質(zhì)譜（hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry，HILIC-MS）法制備高純度海洋源磷脂。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

貽貝，浙江省嵊泗縣華利水產(chǎn)有限公司；正硅酸四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、溴化十六烷基（cetylpyridinium bromide，CPB）、鈦酸四丁酯（C16H36O4Ti），上海阿拉丁試劑有限公司；硫酸（H2SO4）、磷酸（H3PO4）、高錳酸鉀（KMnO4）、雙氧水（H2O2）、鹽酸（HCl）、乙醚（C4H10O）、石墨、尿素（CH4N2O）、氨水、環(huán)己烷（C6H12）、異丙醇（C3H8O）、丙酮（CH3COCH3）、無(wú)水乙醇（C?H?O）、氯仿（CHCl3，分析純）、甲酸（CH2O2，分析純）、甲酸銨（NH4HCO2分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）；甲醇（CH4O，色譜純）、乙腈（C2H3N色譜純），德國(guó)Merck公司；磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC 14∶0/14∶0）（純度≥99.9%）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE 15∶0/15∶0）（純度≥99.9%）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI 16∶0/16∶0）（純度≥99.9%），美國(guó)Avanti公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；4000 QTRAP串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀、電噴霧離子源，美國(guó)Applied Biosystems公司；BSAl24S-CW電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；ROTINA 420R離心機(jī)，德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Milli-Q 超純水儀，法國(guó)Milli-Q 公司；JB-3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器，上海雷磁新涇儀器有限公司；Fresco 21 型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；氮吹儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；SEM、TEM、Digital Multimode V 掃描探針顯微鏡（20 萬(wàn)倍），日本電子株式會(huì)社；電子馬弗爐、鼓風(fēng)干燥箱、水浴鍋，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 KCC-1 微球制備 參照Moon 等［19］報(bào)道的微乳液法合成KCC-1 微球。將1.10 g CPB 和0.60 g 尿素置于250 mL 圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入30 mL 超純水后超聲處理5 min，使其均勻分散。之后繼續(xù)添加0.94 mL 異丙醇和30 mL 環(huán)己烷，超聲混勻。在磁力攪拌的作用下，使用注射器將3 mL TEOS 滴加到上述混合物中。在室溫條件下，將均勻的混合物攪拌30 min后，加熱到70 ℃，冷凝回流20 h。待反應(yīng)結(jié)束后，將溶液于8 000×g下離心10 min，棄上清。剩余固形物依次用丙酮、水和無(wú)水乙醇以8 000×g離心10 min，得到的微球于60 ℃條件下干燥12 h 后，置于馬弗爐中在500 ℃條件下煅燒4 h，除去表面活性劑，最終得到KCC-1微球。

稱取1 g煅燒好的KCC-1微球放入250 mL圓底燒瓶中，加入40 mL HCl（1 mol·L-1），超聲處理2 min 后，于80 ℃條件下反應(yīng)24 h。待反應(yīng)結(jié)束，加入超純水洗滌至中性，最后用無(wú)水乙醇洗滌，所得樣品置于60 ℃下真空干燥12 h，備用。

1.3.2 GO制備 采用改良的Hummer方法制備GO［20］。首先，將400 mL H2SO4和H3PO4混合液（9∶1，V/V）緩慢加入到含有3 g 石墨粉和18 g KMnO4的燒杯中。冰水浴條件下攪拌至均勻后，置于40 ℃水浴條件下，快速攪拌2 h后形成漿糊狀膏體。然后，用注射器滴加一定量的水并持續(xù)攪拌30 min 后，加入5 mL 30% H2O2，此時(shí)反應(yīng)液顏色由深棕色變成亮黃色。最后，用1 mol·L-1HCl 除去Mn2+，并將溶液水洗至中性后，以8 000×g離心30 min，棄上清液。將合成的GO置于室溫下真空干燥過(guò)夜，備用。

1.3.3 TiO2/KCC-1 微球制備 采用水蒸氣內(nèi)部水解法制備TiO2/KCC-1 微球［21］。量取6 mL 鈦酸四丁酯溶于4 mL 無(wú)水乙醇中，振蕩混勻后，將該混合液緩慢滴加至含有1 g 活化好的KCC-1 粉末的燒杯中，邊滴加邊攪拌。待反應(yīng)液攪拌至干燥后，置于100 ℃條件下干燥6 h。然后，將上述干燥物放入水蒸氣密閉環(huán)境中，在60 ℃條件下恒溫反應(yīng)5 h。最后，將反應(yīng)后的樣品在室溫下干燥后放入馬弗爐中于600 ℃條件下煅燒5 h，最終得到TiO2/KCC-1微球。

1.3.4 GO/KCC-1 復(fù)合物制備 參照Agnello 等［22］報(bào)道的方法制備GO/KCC-1材料。稱取1 g制備的GO 粉末溶于50 mL 超純水中，超聲處理1 h 使其均勻分散。然后，將1 g 活化好的KCC-1 粉末緩慢加入到GO 水溶液中，在磁力攪拌的條件下，于120 ℃下反應(yīng)2 h。待反應(yīng)結(jié)束后，以8 000×g離心10 min，棄上清。最后，用50%乙醇水溶液充分洗滌固形物以除去未結(jié)合的KCC-1 微球，再次離心后置于60 ℃條件下干燥12 h，最終得到GO/KCC-1微球。

1.3.5 材料表征 TiO2/KCC-1 微球和GO/KCC-1 復(fù)合物的形態(tài)通過(guò)SEM 和TEM 進(jìn)行表征，加速電壓為25 kV；使用Digital Multimode V 掃描探針顯微鏡獲得GO/KCC-1的AFM圖像。

1.3.6 樣品制備 將貽貝去殼后收集組織，用攪拌器制成漿狀，并置于真空冷凍干燥機(jī)中脫除水分。稱取一定量的貽貝粉末，按1∶40（g·mL-1）的比例將其溶于氯仿/甲醇（2∶1，V/V）溶液中，超聲輔助提取20 min 后，加入超純水以除去親水性雜質(zhì)。然后，將混合物以8 000×g離心10 min。收集下層有機(jī)相，同時(shí)用氯仿將固體殘?jiān)俅翁崛　Ｗ詈螅喜⑹占降乃杏袡C(jī)相，并在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干燥。在進(jìn)行SPE 處理前，需將粗脂質(zhì)用冷丙酮（-20 ℃）洗滌。

1.3.7 SPE 柱純化磷脂 分別將120 mg TiO2/KCC-1

微球和GO/KCC-1 復(fù)合物裝填在1 mL SPE 小柱內(nèi)，其底部和頂部分別裝有兩個(gè)聚丙烯篩片，可以很好地控制固定的吸附劑。

TiO2/KCC-1 SPE小柱：首先，用酸化的水（pH值5）活化SPE 小柱。然后，將樣品（60 mg）裝于SPE 小柱上，先用10%的甲醇水溶液洗滌，再用氯仿/甲醇溶液（1∶2，V/V）以1.5 mL·min-1的流速洗脫，并將該洗脫液在氮?dú)饬飨赂稍铩?/p>

GO/KCC-1 SPE 小柱：首先，用正己烷和氯仿/異丙醇溶液（2∶1，V/V）活化SPE小柱。然后，將樣品（60 mg）裝于SPE 柱上，依次用氯仿/異丙醇混合液（2∶1，V/V）和含0.1%甲酸的乙醚溶液洗滌色譜柱。最后，用氯仿/甲醇（1∶2，V/V）混合液以1.5 mL·min-1的流速?zèng)_洗小柱，獲得含目標(biāo)化合物的餾分，并將該餾分在氮?dú)饬飨赂稍铩?/p>

1.3.8 HILIC-MS 分析 HILIC 分析：采用HPLC 儀和三唑基鍵合硅膠親水作用色譜柱實(shí)現(xiàn)磷脂的有效分離。流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 由60 mmoL·L-1甲酸銨和0.1%甲酸水溶液（pH 值4.5）組成。采用梯度洗脫模式。程序如下：0～3 min，B含量保持在5%；3～18 min，B 含量升至30%；18～23 min，B 含量持續(xù)上升至50%并保持5 min 后，降至5%。流速設(shè)定為0.6 mL·min-1，進(jìn)樣體積為2 μL，柱溫設(shè)定為30 ℃。在每次進(jìn)樣前，將色譜柱洗滌以調(diào)節(jié)至初始狀態(tài)，并重新平衡10 min 以實(shí)現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。

MS 分析：采用配備電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）接口的4000 QTRAP 四級(jí)桿系統(tǒng)進(jìn)行分析。Analyst 1.6.3 軟件用于儀器控制、數(shù)據(jù)收集及處理。采用負(fù)離子模式，氣簾氣、氣源氣1 和氣源氣2 分別設(shè)定為1.8、2.1和2.1 bar。質(zhì)譜掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）600～1 000。

1.3.9 SPE 方法性能評(píng)價(jià) 為了進(jìn)一步比較TiO2/KCC-1 SPE 和GO/KCC-1 SPE 這兩種方法的性能，采用富集因子（enrichment factor，EF）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。EF是指兩種方法中最后洗脫液中目標(biāo)物的濃度與原溶液中該目標(biāo)物濃度的比值。TiO2/KCC-1 SPE 法、GO/KCC-1 SPE 法、KCC-1 SPE 法的方法參數(shù)均為貽貝粉末1 g、上樣量1 mL、填料120 mg、沖洗液4 mL［氯仿/甲醇溶液（1∶2，V/V）］。

1.3.10 高純度磷脂制備 首先，稱取100 g 填料與200 mL超純水混合，并加入濃HCl，調(diào)節(jié)溶液pH值至5左右并保持10 min，再用超純水洗滌至中性。然后，置于105 ℃條件下脫水活化24 h。采用干法裝柱，待填料界面不再下降后，用氯仿洗脫除去層析柱中的雜質(zhì)并平衡2 h，待固定相自然沉降緊實(shí)，靜置待用。稱取一定量經(jīng)冷丙酮沉降后的磷脂樣品，溶解于少量氯仿中。為了防止樣品中的少量不溶雜質(zhì)堵塞層析柱，先用0.22 μm濾膜抽濾后再將脂質(zhì)溶液沿柱壁緩慢倒入層析柱中，然后打開(kāi)恒流泵注入流動(dòng)相，并同時(shí)收集洗脫液。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)LIPID MAPS工具包和LIPID MAPS 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（LMSD）分析磷脂的結(jié)構(gòu)組成。所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 KCC-1微球表征

采用微乳液法制備KCC-1 微球。在制備過(guò)程中，環(huán)己烷和超純水分別作為油相和水相形成微乳液環(huán)境，尿素提供堿性反應(yīng)環(huán)境，表面活性劑CPB為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑，TEOS 作為硅源分散于CPB 周圍并發(fā)生水解、聚合、縮合等一系列反應(yīng)，最后通過(guò)高溫煅燒除去CPB，即得到呈放射狀中心徑向結(jié)構(gòu)的KCC-1 微球。由KCC-1 微球的SEM 圖（圖1-A）可知，微球表面孔隙結(jié)構(gòu)明顯。由KCC-1 的TEM 圖（圖1-B）可知，KCC-1 為中心徑向孔道結(jié)構(gòu)，樹(shù)枝狀纖維從中心向四周發(fā)散，微球直徑為250～400 nm，且大小均一、分散性良好，該結(jié)果與田華君［11］的研究結(jié)果一致。

圖1 KCC-1微球的SEM（A）和TEM（B）Fig.1 SEM（A）and TEM（B）of KCC-1

2.1.1 TiO2/KCC-1 微球表征 TiO2修飾KCC-1 微球前，需要對(duì)KCC-1 表面進(jìn)行活化處理。本研究采用HCl活化以增加KCC-1微球表面的羥基個(gè)數(shù)。鈦酸四丁酯具有極強(qiáng)的水解性，可與無(wú)水乙醇形成穩(wěn)定的溶膠。在攪拌的條件下，該溶膠均勻包覆在KCC-1 表面并形成薄膜。在密閉環(huán)境中，水蒸氣能使微球表面的鈦醇鹽發(fā)生水解反應(yīng)，生成水合氧化鈦沉淀，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，最終生成鈦酸。最后，通過(guò)高溫煅燒使TiO2成功負(fù)載于KCC-1 表面。圖2 是TiO2/KCC-1 微球的SEM（圖2-A）和TEM（圖2-B）。通過(guò)對(duì)比圖1中KCC-1的SEM 和TEM 圖發(fā)現(xiàn)，負(fù)載了TiO2后，KCC-1 表面的孔隙結(jié)構(gòu)被凸起的顆粒填滿，初步證明TiO2已負(fù)載于KCC-1 微球表面。但KCC-1 微球的形貌未發(fā)生明顯變化，這可能是由于TiO2僅負(fù)載于微球表面，對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)幾乎無(wú)影響。

圖2 TiO2/KCC-1微球的SEM（A）和TEM（B）Fig.2 SEM（A）and TEM（B）of TiO2/KCC-1

2.1.2 GO/KCC-1 微球表征 活化的KCC-1 微球表面存在大量不同鍵合狀態(tài)的羥基和不飽和氫鍵［23］，而GO表面含有大量的羧基、環(huán)氧基、羥基等官能團(tuán)，故活化的KCC-1 極易與GO 發(fā)生反應(yīng)，生成大量的C-O-Si鍵。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，C-O-Si 鍵繼續(xù)縮合，最終形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將KCC-1固定于GO表面。

圖3-A 和B 分別為GO 和GO/KCC-1 復(fù)合物的SEM圖。結(jié)果表明，GO呈光滑的片狀結(jié)構(gòu)，其表面的些許褶皺與大量含氧官能團(tuán)的存在有關(guān)［24］。與KCC-1反應(yīng)后，GO 表面覆蓋了大量的球狀顆粒，且片層間的空隙明顯減少，更多結(jié)合位點(diǎn)暴露，可提升其吸附能力。該結(jié)果初步證明KCC-1已負(fù)載于GO表面。圖3-C和D顯示了GO和GO/KCC-1復(fù)合物的片層厚度和表面粗糙程度。GO 表面較為光滑，厚度約為0.85 nm。而GO/KCC-1 復(fù)合物表面粗糙，呈現(xiàn)明顯的折疊狀，厚度約為4.57 nm。AFM 結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明在GO 表面包覆了KCC-1微球。

圖3 GO和GO/KCC-1復(fù)合物的SEM（A、B）和AFM（C、D）Fig.3 SEM（A and B）and AFM（C and D）of GO and GO/KCC-1

2.2 基于TiO2/KCC-1 和GO/KCC-1 SPE 選擇性吸附磷脂

2.2.1 TiO2/KCC-1 SPE選擇性吸附磷脂 基于HILICMS 方法和磷脂標(biāo)品PC 14∶0/14∶0、PE 15∶0/15∶0 和PI 16∶0/16∶0 建立的外部校準(zhǔn)模型，對(duì)樣品中每種磷脂進(jìn)行量化分析，結(jié)果見(jiàn)表1。這些模型的線性范圍為0.31～200 μg·mL-1，且R2≥0.994 9，證明了這些模型的可行性。磷脂經(jīng)TiO2/KCC-1 SPE 純化后，貽貝中PC 含量（4.79 μg·mg-1）最豐富，占磷脂總量的一半以上（53.18%）。PE含量為3.83 μg·mg-1，而PI含量?jī)H為0.21 μg·mg-1。

表1 基于HILIC/MS方法建立磷脂標(biāo)品的校準(zhǔn)曲線Table 1 Calibration curves of phospholipid standards using HILIC-MS

如表2所示，總共鑒定出35種磷脂分子，包括18種PC、10種PE和7種PI。通過(guò)MS/MS分析確定了信號(hào)較強(qiáng)的主要離子的脂肪酸鏈（sn-1/sn-2）組成，而低豐度離子則基于前期的分析經(jīng)驗(yàn)和報(bào)道的文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定［15］。粗脂質(zhì)經(jīng)冷丙酮沉降和TiO2/KCC-1 SPE 純化后，不同種類的磷脂分子含量有了顯著變化（P＜0.05）。其中，TiO2/KCC-1 SPE 純化后m/z804.6 的含量最高，為19.45 μg·mg-1，其次是m/z850.6（18.63 μg·mg-1）和m/z824.6（12.77 μg·mg-1）。上述3個(gè)離子分別鑒定為［PC 16∶0/20∶5+HCOO］-、［PC 16∶0/22∶6+HCOO］-和［PC 16∶0/18∶1+HCOO］-。在m/z700～800中，最重要的離子是m/z716.4和m/z764.4，鑒定為［PE 16∶0/18∶1-H］-和［PE 18∶0/20∶5-H］-。通常，PC 和PE 是海洋動(dòng)物中主要的磷脂類型。據(jù)報(bào)道，海洋磷脂富含不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFA），尤其是n-3 脂肪酸（EPA 和DHA），具有顯著的營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)［25］。PC 在加速脂溶性分子吸收、改善大腦記憶功能以及減緩老化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［10］。PE 可促進(jìn)人體血液和粘性脂質(zhì)膜的形成［15］。經(jīng)結(jié)果鑒定發(fā)現(xiàn)，PC 和PE 的sn-2 位置幾乎均由單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）或多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）組成，例如油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）、EPA和DHA 等。據(jù)報(bào)道，UFA 的生理活性功能要明顯優(yōu)于SFA［1］。而PI 的含量是總磷脂中最少的，其中，m/z863.6 和m/z835.6 為主要的PI，可分別表征為［PI 18∶0/18∶1-H］-和［PI 18∶0/16∶1-H］-。上述結(jié)果表明，TiO2/KCC-1 SPE法能選擇性吸附磷脂以達(dá)到純化的目的。該結(jié)果也證實(shí)了貽貝中含有大量UFA型磷脂。

表2 不同方法處理后樣品中磷脂種類的結(jié)構(gòu)鑒定和含量Table 2 Identity and content of phospholipid in samples processed by different methods

2.2.2 GO/KCC-1 SPE 選擇性吸附磷脂 將經(jīng)冷丙酮沉降后的樣品進(jìn)行GO/KCC-1 SPE 柱處理，結(jié)果見(jiàn)表2。與B&D 法和TiO2/KCC-1 SPE 法相比，樣品經(jīng)GO/KCC-1 SPE法處理后，PC 16∶0/20∶5（m/z804.6）的變化最為顯著（P＜0.05），其次是PC 16∶0/18∶1（m/z850.6）和PC 16∶0/22∶6（m/z824.6）。該結(jié)果與上述TiO2/KCC-1 SPE法的結(jié)果相一致。在m/z700～800范圍，PE 16∶0/18∶1（m/z716.4）和PE 18∶0/22∶6（m/z790.5）是含量變化較大的兩個(gè)離子。根據(jù)鑒定結(jié)果可知，EPA/DHA 型PE分子占51.37%。據(jù)報(bào)道，EPA/DHA 型PE 分子具有調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道菌群組成和緩解慢性應(yīng)激功能［17］。本研究共鑒定了7 種PI 分子，其中，PI 18∶0/18∶1（m/z863.6）和PI 18∶0/16∶1（m/z835.6）是兩種最豐富的PI 分子，含量分別為2.98 和2.54 μg·mg-1。B&D 法是提取脂質(zhì)最常用的方法之一，為本研究磷脂純化的起點(diǎn)。采用B&D 法從貽貝中提取的脂質(zhì)往往含有大量的雜質(zhì)，如甘油酯、游離脂肪酸等，故磷脂含量較低。根據(jù)相似相溶原理，利用預(yù)冷的丙酮充分洗滌粗脂質(zhì)可將部分中性脂質(zhì)除去，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷脂的初步純化［25-26］。對(duì)于SPE 法，將經(jīng)冷丙酮沉降后的磷脂樣品添加到GO/KCC-1柱中，并用有機(jī)溶劑洗滌該柱。在洗滌過(guò)程中，大部分雜質(zhì)被除去，磷脂的純度顯著提高。該結(jié)果說(shuō)明GO/KCC-1 SPE法可高效地富集磷脂。

僅從純化前后磷脂含量的變化而言，TiO2/KCC-1 SPE 和GO/KCC-1 SPE 法均能實(shí)現(xiàn)純化磷脂的目的。根據(jù)EF 結(jié)果可知，TiO2/KCC-1 SPE 法測(cè)定PC 和PE 的EF 最高，分別為2.76和2.95。而GO/KCC-1 SPE 法測(cè)得的EFPC和EFPE分別為2.61 和2.84。KCC-1 SPE 法中的EF 最低，EFPC和EFPE分別僅為0.76 和0.86，這主要是由于KCC-1 作為填料容易塌陷且吸附能力較弱。而GO/KCC-1 SPE 法的EF 值略低于TiO2/KCC-1 SPE法的原因，可能是由于GO/KCC-1 填料表面存在部分未與GO 表面含氧官能團(tuán)結(jié)合的KCC-1 顆粒而降低了其吸附能力。因此，TiO2/KCC-1 SPE 法是一種更為理想的選擇性吸附磷脂的方法。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證及高純度磷脂制備

基于R2、線性范圍、檢測(cè)限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）及日間和日內(nèi)精密度驗(yàn)證了TiO2/KCC-1 SPE HILIC-MS 方法測(cè)定貽貝中磷脂含量的可行性。LOD和LOQ分別為0.18～0.53和0.45～1.46 μg·mL-1。日內(nèi)精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于7.12%，日間精密度的RSD 為5.74%～7.27%。通過(guò)將磷脂標(biāo)準(zhǔn)品溶液（50、100 和150 μg·mL-1）加標(biāo)到貽貝樣品中分別進(jìn)行回收率試驗(yàn)。通過(guò)計(jì)算可知，其相對(duì)回收率均高于88.25%。結(jié)果表明，TiO2/KCC-1 SPE HILIC-MS 方法具有較高的靈敏度、良好的精密度及回收率。基于上述試驗(yàn)結(jié)果，采用TiO2/KCC-1 SPE 法制備高純度磷脂。經(jīng)液相分析所制備磷脂的純度高達(dá)93.57%。

3 討論

SPE 法是純化磷脂最常用的方法之一，但傳統(tǒng)的吸附劑對(duì)磷脂純化效率不高。提高磷脂純化效率的關(guān)鍵在于吸附劑的選擇。金屬氧化物（如TiO2）具有路易斯酸-堿特性，在酸性環(huán)境中可與磷脂結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)與其他物質(zhì)分離的效果，而在堿性環(huán)境中則可直接達(dá)到純化富集的目的。研究表明，金屬氧化物選擇性純化磷脂具有良好的應(yīng)用前景；但TiO2顆粒粒徑較小，且比表面積不大，不適合直接做SPE 填料［8，15］。通常需要將TiO2負(fù)載于硅膠顆粒之上［11］。Shen 等［27］成功制備了TiO2負(fù)載SiO2核殼式（TiO2/SiO2）納米材料并用于純化蝦加工副產(chǎn)物中的磷脂，其相對(duì)回收率僅為74.80%。而本研究成功制備了TiO2/KCC-1 新型介孔核殼式納米復(fù)合填料，相較于TiO2/SiO2具有更高的純化效率（88.25%），其主要原因是TiO2/KCC-1 填料的比表面積較TiO2/SiO2更大，這表明填料中可用于吸附磷脂的TiO2分子含量更高。

由于GO 結(jié)構(gòu)中存在大量的褶皺孔穴和孔道且比表面積大，故常將其作為新型的碳納米吸附材料。Shen 等［28］制備了GO/TiO2納米復(fù)合材料并將其作為吸附劑富集磷脂，結(jié)果表明該復(fù)合材料具有良好的吸附磷脂的特性。為擴(kuò)大GO 的應(yīng)用范圍，本研究通過(guò)化學(xué)合成法成功制備了GO/KCC-1，并有效地純化了磷脂。然而，根據(jù)EF的測(cè)定結(jié)果可知，本研究建立的GO/KCC-1 SPE 法的EFPC和EFPE（2.61 和2.84）相較已報(bào)道的GO/TiO2SPE 法（2.97 和3.03）低［28］，其主要原因可能是GO/TiO2填料中路易斯酸-堿特性更強(qiáng)，能特異性結(jié)合更多的磷脂。由于時(shí)間和試驗(yàn)條件的限制，本研究直接參考現(xiàn)有的化學(xué)合成方法并未進(jìn)行方法優(yōu)化，后續(xù)可分析不同TiO2和GO 添加量對(duì)TiO2/KCC-1和GO/KCC-1復(fù)合材料作用效果的影響。

4 結(jié)論

本研究首先合成了KCC-1 微球，并對(duì)其進(jìn)行功能化修飾，制備了TiO2/KCC-1 和GO/KCC-1 材料。然后將兩種新型材料作為填料制成SPE 柱，對(duì)貽貝中的磷脂進(jìn)行選擇性吸附。根據(jù)HILIC-MS 分析結(jié)果可知，相較于GO/KCC-1 SPE 法，TiO2/KCC-1 SPE 法是一種更為理想的選擇性吸附磷脂的方法。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，表明TiO2/KCC-1 SPE HILIC-MS 方法具有良好的精密度、較高的靈敏度及回收率。最后，采用TiO2/KCC-1 SPE法制備了高純度磷脂（93.57%）。