茉莉酸甲酯和酵母提取物對白鮮試管無菌苗生長和藥用成分含量的影響

杜佳霖 董 睿 李辛琲 王 威 孫藝文 馬 越 南桂仙

（延邊大學農學院，吉林 延吉 133002）

白鮮（DictamnusdasycarpusTurcz.）屬蕓香科白鮮屬多年生宿根草本植物［1］，其根部可入藥。白鮮根部經過脫水等一系列干燥措施后即得白鮮皮，白鮮皮是我國重要的中藥材之一。白鮮的主要化學成分包括生物堿、檸檬苦素類、黃酮類等［2］，常用于治療濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風疹等疾?。?］。隨著對白鮮的深入研究，白鮮皮還有抗炎、抗真菌、止血、抗癌等藥理作用［4］。由于白鮮具有重要的藥用價值，導致人們對野生白鮮的過度開采，現有野生白鮮數量已經不能滿足人們的需求，如何合理開發和保護藥用植物并提升其次生代謝產物的含量是目前面臨的一項挑戰。

誘導子處理能夠有效提升藥用植物次生代謝產物含量，利用誘導子促進次生代謝產物積累成為當前研究熱點［5］。誘導子可分為生物誘導子與非生物誘導子兩種類型［6］。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、酵母提取物（yeast extract，YE）作為常用的誘導子，已被成功應用于多種藥用植物中以促進其生長和提升自身次生代謝產物含量［5，7］。但對于白鮮而言，尚鮮有相關報道。

鑒于此，本試驗以白鮮為研究對象，初步探究不同濃度MeJA、YE 處理對白鮮生長及其次生代謝產物的影響，并采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定白鮮中的白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量，以期為藥用植物白鮮次生代謝產物的生物合成奠定理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 本試驗的植物材料為白鮮種子，采收于安圖白鮮栽培地。

1.1.2 試驗儀器、藥品 儀器：1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；SB-120D 超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺，上海新苗醫療器械制造有限公司；YXQ-LS-50 高壓滅菌鍋，上海博迅實業有限公司。藥品：乙醇、蔗糖，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）、MeJA，上海麥克林生化科技股份有限公司；蒸餾水、無菌水、超純水、MS 培養基粉，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司；1 mol·L-1氫氧化鈉、1 mol·L-1鹽酸、2%次氯酸鈉（NaClO）、15%過氧化氫（H2O2）、YE，上海賽默飛世爾科技公司；白鮮堿標準品、黃柏酮標準品、梣酮標準品，上海源葉生物科技有限公司。無特殊標記外的試劑均為分析純。

1.2 試驗設計和實施

1.2.1 試驗設計 將消毒后的白鮮種子點在MS 培養基中，待種子發芽后分別移到添加不同濃度誘導子的MS 培養基中培養，濃度分別為MeJA 0.1、0.5、1、5、10、50 μmol·L-1；YE 10、30、50、100、200、300 mg·L-1，以不加誘導子的MS 培養基為對照（CK），每個培養基點10粒種子，每個處理重復3次，培養30 d后觀察白鮮幼苗生長情況。培養溫度（24±1）℃，光照時間14 h。

1.2.2 試驗的實施 1）種子的消毒處理：參考樊憲偉［8］的方法對種子進行消毒；2）基礎培養基的選擇：參照賈曉龍［9］的試驗結果，本試驗采用MS培養基為基本培養基；3）待測樣品的制備：將植物樣品放入烘箱55 ℃烘干3～4 h，溫度提高到100 ℃烘干1～2 h，冷卻后研磨，取1.0 g 樣品，放入錐形瓶中，加入甲醇25 mL，加熱回流1 h，水浴溫度60 ℃，冷卻取混合液補充少量甲醇并通過0.22 μm 微孔過濾，即得樣品待測液。每個處理重復3次。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 根長與側根數 在同一濃度處理下選取白鮮幼苗20 個，用刻度尺測量白鮮幼苗根長并記錄白鮮幼苗的側根數量。上述每個處理重復4次。

1.3.2 鮮重凈增量與干重凈增量 利用分析天平稱量10 粒白鮮種子的重量（M1），在同一濃度處理下選取10個白鮮幼苗并稱量其總重量（M2），鮮重凈增量（mg）=M2-M1。將上述植物材料于55 ℃烘干3～4 h，溫度提高到100 ℃烘干1～2 h，烘干后白鮮種子的總重量記為M3，烘干后白鮮幼苗的總重量記為M4，干重凈增量（mg）=M4-M3。

1.3.3 藥用成分的檢測 本試驗采用加熱回流裝置和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測白鮮中的白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量。檢測方法與色譜條件參考賈曉龍［9］的試驗方法并計算回歸方程，白鮮堿、梣酮、黃柏酮的標準品質量濃度對峰面積的回歸方程分別為：

y=134.69x-23.259 (R2=0.999 8)

y=24.331x+74.98 (R2=0.999 1)

y=21.91x+11.139 (R2=0.999 5)。

1.3.4 精密度試驗 分別取0.1 mg·mL-1的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標準品母液，在1.3.3的色譜條件下，連續進樣5 次進行檢測，白鮮、梣酮、黃柏酮的峰面積平均值分別為1 348 416.667、1 001 977.560、1 999 289.333，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.67%、1.59%、1.38%，均小于2%，說明精密度好，符合分析要求。

1.3.5 重復性試驗 稱取同一濃度處理的白鮮幼苗，按照1.2.2節流程制作供試樣品溶液，在1.3.3節色譜條件下，連續進樣5 次，結果表明供試樣品中白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量的RSD 分別為0.50%、0.70%、0.70%，均小于2%，表明重復性很穩定，符合分析的要求。

1.4 數據處理

首先使用Microsoft Excel 2007 進行數據匯總，然后利用SPSS 26 統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析（one way ANOVA）和主成分分析，最后用GraphPad 9軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度MeJA 對白鮮生長及藥用成分含量的影響

2.1.1 不同濃度MeJA 對白鮮生長的影響 由圖1可知，隨著MeJA 濃度的增加，白鮮幼苗根長和側根數呈現先上升后下降的趨勢，均在1 μmol·L-1達到最大值，最大根長為3.18 cm，最大側根數為1.55 條，從10 μmol·L-1濃度開始顯著抑制了根部的生長。

圖1 不同濃度茉莉酸甲酯處理的白鮮幼苗根長和側根數Fig.1 Root length and lateral root number of Dictamnus seedlings treated with different concentrations of methyl jasmonate

由表1可知，不同濃度MeJA處理白鮮幼苗鮮重凈增量和干重凈增量有所差異，均隨MeJA濃度的增加呈現先上升后下降趨勢。MeJA濃度在1 μmol·L-1時，鮮重凈增量達到最大值，為1 060.96 mg，當濃度為10 μmol·L-1時，幼苗鮮重凈增量開始顯著低于CK。MeJA 濃度為1 μmol·L-1時幼苗干重凈增量最大，為164.60 mg，在濃度達到50 μmol·L-1時幼苗干重凈增量顯著低于CK。

表1 不同濃度茉莉酸甲酯處理后的白鮮幼苗鮮重凈增量和干重凈增量Table 1 Net fresh weight increment and net dry weight increment of Dictamnus seedlings treated with different concentrations of methyl jasmonate/mg

2.1.2 不同濃度MeJA對白鮮藥用成分含量的影響 由圖2 可知，不同濃度MeJA 處理白鮮幼苗中的3 種藥用成分含量整體差異顯著。3種藥用成分含量均隨MeJA濃度的增加呈現先上升后下降趨勢。除50 μmol·L-1外，其他濃度處理白鮮堿含量均顯著高于CK。5 μmol·L-1時白鮮堿含量達到最大值，為316.81 μg·g-1。梣酮含量在0.1 μmol·L-1MeJA處理后達到最大值，為518.38 μg·g-1，其次是0.5 μmol·L-1，含量為344.62 μg·g-1。黃柏酮含量在MeJA 濃度為5 μmol·L-1時達到最大值，為246.81 μg·g-1，MeJA 各處理中黃柏酮的含量都顯著高于CK。

圖2 不同濃度茉莉酸甲酯處理的白鮮三種藥用成分含量Fig.2 Contents of three medicinal components of Dictamnus treated with different concentrations of methyl jasmonate

2.1.3 不同濃度MeJA 對白鮮生長和藥用成分含量的主成分分析 以不同濃度MeJA 處理后白鮮幼苗根長、側根數、生物量和三種藥用成分含量共7個指標進行主成分分析，通過綜合評價篩選出MeJA 的最佳濃度。將數據進行標準化處理，計算相關矩陣的特征值和所對應的特征向量。結果表明（表2），前兩項綜合指數的特征值＞1，累積貢獻率為85.923%，可代表原來所有指標的絕大部分信息。主成分1主要綜合了根長（載荷0.947，下同）、側根數（0.979）、鮮重凈增量（0.919）、干重凈增量（0.925）和梣酮含量（0.509），代表原始數據信息量的54.776%，主成分2 主要綜合了白鮮堿含量（0.945）和黃柏酮含量（0.971），代表原始數據信息量的31.147%。

表2 相關矩陣特征值和特征向量Table 2 Eigenvalues and eigenvectors of correlation matrix

用各指標變量的主成分載荷除以特征值的算術平方根，可得到2 個主成分中每個指標對應的特征向量。以每個指標的特征向量為權重構建函數表達式并計算2 個主成分的得分F1、F2。再將2 個主成分的方差貢獻率分別作為權重，計算不同濃度MeJA 處理下白鮮幼苗的綜合得分F。

F=54.776% F1+31.147% F2

由MeJA 所有濃度處理后的綜合得分排名可知（表3），MeJA 最佳處理濃度為1 μmol·L-1，其次是0.5、5 μmol·L-1。

表3 茉莉酸甲酯各濃度主成分得分及綜合排名Table 3 Principal component scores and comprehensive ranking of methyl jasmonate concentration

2.2 不同濃度YE對白鮮生長及藥用成分含量的影響

2.2.1 不同濃度YE 對白鮮生長的影響 由圖3 可知，不同濃度YE 處理后的白鮮幼苗根長和側根數整體差異顯著，YE 30 mg·L-1處理明顯促進了白鮮幼苗根的生長，長度為5.12 cm，YE 300 mg·L-1處理顯著抑制了白鮮幼苗根的生長（圖3-A）。YE 濃度達到30 mg·L-1時，側根數最多，為3.29 條。除YE 濃度300 mg·L-1時的白鮮幼苗側根數（0.93 條）少于CK 外，其他濃度處理下的側根數均多于CK（圖3-B）。

圖3 不同濃度酵母提取物處理后白鮮幼苗的根長和側根數Fig.3 Root length and lateral root number of Dictamnus seedlings treated with different concentrations of yeast extract

由表4可知，不同濃度YE 處理白鮮幼苗鮮重和干重凈增量有所差異。白鮮幼苗的鮮重凈增量和干重凈增量均隨YE 濃度的增加呈現先增加后減少的趨勢，兩者均在YE 濃度為30 mg·L-1時達到最高值，之后開始緩慢減少，到300 mg·L-1時最低，但較CK 無顯著差異。幼苗鮮重凈增量最大值為1 832.63 mg。YE 濃度在10 和30 mg·L-1時的幼苗干重凈增量顯著高于CK，分別為154.60和162.77 mg，300 mg·L-1時的干重凈增量低于CK，為111.90 mg，但無顯著差異。

表4 不同濃度酵母提取物處理后的白鮮幼苗鮮重凈增量和干重凈增量Table 4 Net increment of fresh weight and net increment of dry weight of Dictamnus seedlings treated with different concentrations of yeast extract/mg

2.2.2 不同濃度酵母提取物對白鮮藥用成分含量的影響 由圖4 可知，不同濃度YE 處理整體顯著提高了白鮮中三種藥用成分含量，均隨著YE 濃度的增加整體呈現先上升后下降的趨勢。

圖4 不同濃度酵母提取物處理的白鮮藥用成分含量Fig.4 Content of medicinal components of Dictamnus treated with different concentrations of yeast extract

白鮮堿含量在YE 濃度為10 mg·L-1時最高，為301.58 μg·g-1，其次是30、50 mg·L-1，分別為280.77、264.12 μg·g-1。YE 濃度10～100 mg·L-1范圍內，梣酮含量隨濃度的增加呈顯著上升趨勢，在100 mg·L-1時達到最大值，為301.63 μg·g-1，200 mg·L-1時開始下降。在YE 30 mg·L-1濃度處理時黃柏酮含量最高，為218.49 μg·g-1，300 mg·L-1時的黃柏酮含量較低，為178.89 μg·g-1。

2.2.3 不同濃度YE對白鮮生長和藥用成分含量的主成分分析 以不同濃度YE 處理后的白鮮幼苗根長、側根數、生物量和三種藥用成分含量共7個指標進行主成分分析，通過綜合評價篩選出YE的最佳濃度。將上述各項指標的數據經標準化處理后，計算相關矩陣的特征值和所對應的特征向量。結果表明（表5），前兩項綜合指數的特征值＞1，累積方差貢獻率為91.428%，可代表原來所有指標的絕大部分信息。主成分1 主要綜合了根長（0.919）、側根數（0.910）、鮮重凈增量（0.936）、干重凈增量（0.900）、白鮮堿含量（0.881）和黃柏酮含量（0.786），代表原始數據信息量的71.299%，主成分2為梣酮含量（0.821），代表原始數據信息量的20.129%。

表5 相關矩陣特征值和特征向量Table 5 Eigenvalues and eigenvectors of correlation matrix

用各指標變量的主成分載荷除以特征值的算術平方根，可得到2 個主成分中每個指標對應的特征向量。以每個指標的特征向量為權重構建函數表達式并計算2個主成分的得分F1、F2。再將2個主成分的方差貢獻率分別作為權重，計算不同濃度YE 處理下的白鮮幼苗綜合得分F：

F=71.299% F1+20.129% F2

由YE所有濃度處理后的綜合得分排名可知（表6），YE最佳處理濃度為30 mg·L-1，其次是10、50 mg·L-1。

表6 酵母提取物各濃度主成分得分及綜合排名Table 6 Principal component scores and comprehensive ranking of yeast extract concentration

2.3 不同誘導子處理對白鮮幼苗生長和藥用成分的主成分分析

以兩種不同濃度誘導子處理后的白鮮幼苗根長、側根數、生物量和三種藥用成分含量共7 個指標進行主成分分析，通過綜合評價篩選出最佳誘導子。將上述各項指標的數據經標準化處理后，計算相關矩陣的特征值和所對應的特征向量。結果表明（表7），前兩項綜合指數的特征值＞1，累積方差貢獻率為83.866%，可代表原來所有指標的絕大部分信息。主成分1 主要綜合了根長（0.943）、側根數（0.930）、鮮重凈增量（0.949）、干重凈增量（0.883）、白鮮堿含量（0.684）和梣酮含量（0.234），代表原始數據信息量的59.625%，主成分2主要為黃柏酮含量（0.822），代表原始數據信息量的24.241%。

表7 相關矩陣特征值和特征向量Table 7 Eigenvalues and eigenvectors of correlation matrix

用各指標變量的主成分載荷除以特征值的算術平方根，可得到2 個主成分中每個指標對應的特征向量。以每個指標的特征向量為權重構建函數表達式并計算2 個主成分的得分F1、F2。再將2 個主成分的方差貢獻率分別作為權重，計算不同濃度誘導子處理下的白鮮幼苗綜合得分F：

F=59.625% F1+24.241% F2

由兩種誘導子所有濃度處理后的綜合得分排名可知（表8），兩種誘導子處理白鮮幼苗的最佳處理誘導子以及最佳濃度為YE 30 mg·L-1，其次是YE 10 mg·L-1。

表8 兩種誘導子各濃度主成分得分及綜合排名Table 8 Principal component scores and comprehensive ranking of two elicitors at each concentration

3 討論

MeJA是一種普遍存在于植物界的信號調控物質［10］，是天然存在于植物內的內源性生長調節劑［11］，可以參與調控植物生長發育中的各個過程［12］。MeJA 能誘導植物的種子萌發，根、莖的生長，細胞分裂、形態發育等反應［13］；增加過氧化物酶、殼聚糖酶和脂氧合酶等蛋白活性，對生物堿等次生代謝產物有促進作用［14］；增強并改變揮發性信號化合物的釋放，乃至產生防御結構。利用MeJA 誘導藥用植物中活性成分受到廣泛關注，研究表明，MeJA 可提高寧夏枸杞的抗氧化酶活性、抗病性，提高總酚和類黃酮的積累［15］，促進牛膝、膜莢黃芪、高山紅景天等藥用植物藥用成分［16-19］及黃連幼苗和鉤藤中生物堿含量的增加［20-21］。本研究結果與上述研究結果相似。即MeJA 對白鮮生長和藥用成分含量有顯著影響，初步證明了適宜濃度的MeJA 可促進藥用植物白鮮生長并提高其主要藥用成分含量。濃度為1 μmol·L-1時，白鮮幼苗的根長、側根數、鮮重凈增量和干重凈增量較CK 提升最為明顯，當MeJA 濃度在5 μmol·L-1時，白鮮中白鮮堿和黃柏酮含量達到最大值，0.1 μmol·L-1時的梣酮含量最高。

YE是以酵母為原材料，采用現代分離提純技術得到的純天然制品［22］。YE 是一種生物誘導子，已被國內外研究廣泛運用［23］。本試驗結果表明，YE 對白鮮生長和藥用成分含量有明顯影響，初步證明了適宜濃度的YE 可促進白鮮生長并提高其主要藥用成分含量。在30 mg·L-1時，白鮮幼苗的根長、側根數、鮮重凈增量和干重凈增量均達到最大值，白鮮堿、黃柏酮、梣酮含量分別在10、30、100 mg·L-1時達到最大值。YE在植物體內的作用表現在調控次生代謝過程，究其原因，YE 可促進生物酶合成或調節酶活性，使得次級代謝產物合成加速，積累量有顯著增加［22，24］。YE 也可以緩解生物和非生物脅迫，促進植物生長［25］。前人研究表明，適宜濃度YE 能促進蜀葵不定根［26］、羽扇豆苗的長度和幼葉鮮重［7］、人參和西洋參愈傷組織的生長［27］；YE 還可以提高絞股藍毛狀根生長量和顛茄毛狀根中的生物堿含量［22，28］。本試驗結果與上述研究結果相似。

主成分分析是將多個指標或變量近似的轉化為少數幾個不相關的綜合指標的多元統計分析方法，其優點在于可消除評價指標之間的相關影響和減少選擇指標的工作量。主成分分析中各主成分是按方差大小依次排序的，在分析問題時舍棄一部分方差小的主成分，只取前幾個方差大的主成分來代表原變量。本試驗通過主成分分析篩選出綜合白鮮幼苗根長、側根數、生物量以及三種藥用成分的MeJA 和YE 最適濃度。在MeJA 處理中共提取出的2 個主成分的累積方差貢獻率為85.923%（特征值＞1），主成分1和主成分2分別代表原始數據信息量的54.776%和31.147%，可代表原來所有指標的絕大部分信息。根據綜合得分排名可知，1 μmol·L-1MeJA 排名第一，這說明在MeJA 所設濃度中，綜合7 項指標，以1 μmol·L-1處理下白鮮幼苗生長和三種藥用成分含量提升效果最佳。在YE 處理中共提取出的2 個主成分的累積方差貢獻率為91.428%（特征值＞1），主成分1 和主成分2 分別代表原始數據信息量的71.299%和20.129%，可代表原來所有指標的絕大部分信息。根據綜合得分排名可知，30 mg·L-1YE 排名第一，這說明在所設濃度中，結合7 項指標，30 mg·L-1YE 處理對白鮮幼苗的生長和三種藥用成分含量提升效果最佳。通過對MeJA和YE的橫向比較的排名順序發現，30 mg·L-1YE 綜合排名第一，從而得出結論，兩種誘導子處理后的最佳誘導子及其濃度為30 mg·L-1YE。

4 結論

本試驗初步證明了MeJA 和YE 對白鮮幼苗生長和提升藥用成分含量有較為明顯的影響，不同濃度誘導子處理下的白鮮幼苗生長情況和三種藥用成分含量均有所差異。其中白鮮幼苗在MeJA 1 μmol·L-1處理下的根長、側根數、鮮重凈增量和干重凈增量達到最大值，分別為3.18 cm、1.02 條、1 660.96 和164.60 mg；5 μmol·L-1時白鮮中白鮮堿和黃柏酮含量達到最大值，分別為316.81和246.81 μg·g-1；0.1 μmol·L-1時梣酮含量最多，為518.38 μg·g-1。對YE而言，30 mg·L-1處理下根長、側根數、鮮重凈增量和干重凈增量達到最大值，分別為5.12 cm、3.29條、1 832.63和162.77 mg；10 mg·L-1時白鮮堿含量最高，為301.58 μg·g-1，100 mg·L-1時梣酮含量達到最大值，為301.63 μg·g-1，30 mg·L-1黃柏酮含量最高，為218.49 μg·g-1。因此生產者可根據實際需要選擇適合的誘導子濃度。主成分分析結果表明，MeJA 處理的最佳濃度為1 μmol·L-1，YE 處理的最佳濃度為30 mg·L-1，以YE 濃度30 mg·L-1效果最佳。