關帝山不同海拔和季節對沙棘黃酮含量的影響

代永欣 薛靜茹 楊 楠 李澤淇 侯 銳 杭宇杰 呂英忠 王 林，*

（1山西農業大學林學院，山西 太谷 030801；2山西農業大學果樹研究所，山西 太谷 030815）

沙棘（HippophaerhamnoidesL.）是一種重要的經濟樹種，兼有生態、食用、藥用等多種用途，是天然藥食兩用原料，被收載于《中華人民共和國藥典（2020版）》［1］。黃酮類化合物是沙棘中主要的生物活性成分和特征成分，屬于一大類酚類次生代謝產物，具有抗氧化活性，對植物起防御保護作用［2］。目前已從沙棘中鑒定出95種以上黃酮類化合物，主要是楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等黃酮苷元及其苷類化合物［3-4］。研究發現沙棘果和葉片中均富含黃酮類化合物，國內外研究大多集中于沙棘果或葉片化學成分分析，及其抗氧化活性評價和比較［5-10］，而對于植物中生物量較高的莖（枝）器官的研究相對較少，這限制了對沙棘的全面利用。

次生代謝物質是植物適應生態環境的產物，植物體內黃酮類化合物含量與環境條件密切相關。有研究發現，大多數植物體內的黃酮類化合物含量隨著光照強度的增強而升高［11］；短期、輕度干旱脅迫可促進植物次生代謝物質的積累［12］；低溫可促進銀杏（Ginkgo biloba）葉片類黃酮的積累［13-14］，可見黃酮類化合物含量在環境脅迫條件下呈升高趨勢。海拔高度綜合了溫度、水分、光照等環境因子，同樣會影響植物體內黃酮類化合物含量，Ma 等［15］發現隨著海拔（210～3 000 m）的升高，不同地區的野生沙棘果實中黃酮醇苷含量呈上升趨勢。沙棘常生長于海拔800～3 600 m 的溫帶地區，目前有關同一地區不同海拔高度對沙棘黃酮類化合物含量影響的研究鮮有報道，限制了對沙棘黃酮類化合物含量響應環境變化的全面了解，在實踐上不能為沙棘黃酮高含量強化栽培模式提供理論依據和技術支持。

我國是世界上沙棘資源最豐富的國家，沙棘資源面積占全球沙棘總面積的90%以上［16］，境內分布最廣的是中國沙棘（HippophaerhamnoidesL.subsp.sinensisRousi）亞種，在改良生態環境和發展當地經濟方面發揮重要作用。近年來，沙棘的保健功能日益受到關注，植物化學成分含量高常被作為沙棘功能化利用的理想性狀［17］。本研究以山西省關帝山區野生中國沙棘為研究對象，通過測定不同海拔、不同季節中國沙棘不同部位的總黃酮及其主要成分含量，分析沙棘一年生枝、葉、果實中黃酮類化合物含量對季節和海拔的響應，旨在揭示中國沙棘不同部位黃酮類化合物含量隨生長季節、海拔高度的變化規律，為沙棘功能化利用及沙棘黃酮高含量強化栽培模式提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

本研究在山西省西部呂梁山脈，關帝山龐泉溝自然保護區（111°18'～112°18'E，37°20'～38°20'N，海拔2 831 m）進行。該區屬溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫4.3 ℃，1月份平均氣溫最低，為-10.2 ℃，7月份平均氣溫最高，為17.5 ℃。年均降水量為600～822 mm，降水主要集中在7、8月份。于2021年5月在1 150、1 400、1 650、1 800和2 100 m 海拔高度的天然沙棘灌木純林各設置3個10 m×10 m樣地，樣地為陽坡或半陽坡，設置在坡中下部，樣地的生長季平均氣溫和平均降水量［18］見表1。試驗材料為所選定樣地中的野生中國沙棘植株。

表1 關帝山季均溫和季均降水量Table 1 Seasonal mean temperature and precipitation of Guandi mountain

1.2 試驗方法

于2021年5月（春季）、7月（夏季）、9月（秋季）沿海拔梯度在每個樣地中隨機選擇3 株野生中國沙棘平均木采集樣品，5月尚無當年生枝條，只采集新生葉片，7月采集葉片和一年生枝，9月采集葉片、一年生枝和果實。葉片、枝條、果實均選擇向陽面樹冠中上部位置采集，將采集的樣品在烘箱中105 ℃殺青，之后于85 ℃烘干至恒重，用粉碎機粉碎至粉末狀，過100 目篩，用于總黃酮及黃酮主要成分和非結構性碳含量測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 沙棘總黃酮含量的測定 采用粉碎過篩后的樣品，參考任園宇等［19］的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法對總黃酮含量進行測定。

1.3.2 沙棘黃酮類化合物含量的測定 對黃酮類化合物中含量較多的楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素四種黃酮苷含量進行測定，參照衛罡等［20］的方法并稍作修改，具體如下：首先確定色譜分析條件，流動相為甲醇+0.4%磷酸水溶液（1∶1），色譜柱為WondaSilTM C18 Superb（4.6 mm×150 mm），柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為360 nm。然后配制標準溶液，按色譜條件加樣，以質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸分析（表2）。

表2 色譜分析線性回歸方程Table 2 Linear regression equation for chromatographic analysis

稱取粉碎過篩后的樣品0.2 g置于100 mL燒杯中，加入30 mL甲醇，混勻，超聲提取1 h，重復提取3次，合并提取液后用RE52 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）進行濃縮至25 mL。加入25 mL 甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1），75 ℃水浴1 h，自然冷卻后轉入50 mL 量瓶中定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液即為樣品待測液。采用LC-20AT/SPD-M20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）進行測定。

1.3.3 沙棘生長指標的測定 于2021年5月在設置的樣地中選取6株沙棘平均木，測量株高、冠幅。9月，在向陽面樹冠中上部選擇10個一年生枝條上的第3個成熟葉片，用YMJ-C 型葉面積掃描儀（浙江托普儀器有限公司）測定葉面積。

1.3.4 光合生理指標的測定 于2021年7月天氣晴朗的上午9∶00—11∶30，在設定的樣地中采用Li-6400光合儀（美國LI-COR 公司）隨機測定沙棘植株中上部成熟葉片凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）和氣孔導度（stomatal conductance，Gs）。其中，光合有效輻射（photosynthetically active radiation，PAR）設定為1 500 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1。

1.3.5 非結構性碳含量的測定 采用硫酸蒽酮法［21］測定粉碎過篩后的樣品可溶性糖和淀粉含量，非結構性碳（nonstructural carbohydrates，NSC）含量為可溶性糖與淀粉含量之和。

1.4 數據處理

采用Excel 2019 軟件進行數據統計和處理，結果以“平均值±標準差”表示；用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析、差異顯著性比較（α=0.05）和相關性分析；利用Sigmaplot 10.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同海拔和季節條件下中國沙棘葉片黃酮類化合物含量

由圖1 可知，不同海拔高度下，葉片總黃酮含量均為9月份最高，5月份最低（因5月高海拔植株尚未萌發葉片，故未采集到1 800 和2 100 m 處葉片），且隨海拔升高整體呈先升高后降低趨勢，在1 650 m處的9月份達到最大值，為17.32 mg·g-1。各黃酮類化合物含量變化并無統一規律，與總黃酮含量的變化趨勢并不一致。隨著海拔的升高，楊梅素含量先下降后上升，最大值出現在1 150 m 處的7月份，為1.12 mg·g-1；槲皮素含量整體先升高后降低，在1 800 m 處的9月份達到最大值，為2.21 mg·g-1；而9月份異鼠李素含量除在1 400 m 處略有下降外，基本呈上升趨勢，在2 100 m 處達到最大值，為2.48 mg·g-1。說明除上述幾種主要的黃酮類化合物外，其他類黃酮成分含量也會發生變化，從而導致總黃酮含量發生變化。

圖1 不同季節沙棘葉片黃酮類化合物含量沿海拔的變化Fig.1 Changes of flavonoids contents of leaves in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.2 不同海拔和季節條件下中國沙棘一年生枝黃酮類化合物含量

由圖2 可知，與葉片相反，不同海拔高度一年生枝總黃酮含量均表現為7月高于9月，除海拔1 800 m外，隨海拔的升高呈略上升趨勢，最大值為4.90 mg·g-1。黃酮類化合物楊梅素、山奈酚、槲皮素、異鼠李素基本呈相似的變化趨勢，均在7月份隨海拔升高整體呈下降趨勢，9月份沿海拔升高呈略升高趨勢，幾種黃酮類化合物7月份含量最高值均在1 150 m 處，9月份含量最高值均在2 100 m處。

圖2 不同季節沙棘一年生枝黃酮類化合物含量沿海拔的變化Fig.2 Changes of flavonoids contents of one-year-old branches in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.3 不同海拔中國沙棘果實黃酮類化合物含量

由圖3可知，果實總黃酮含量沿海拔梯度呈先升高后下降變化趨勢（海拔2 100 m 處植株未結實，故未采集到），1 650 m處顯著高于其他海拔，為10.31 mg·g-1。楊梅素含量隨海拔升高而逐漸升高，最大值在1 800 m處，為0.52 mg·g-1。山奈酚含量在各海拔間無顯著差異，維持在0.35 mg·g-1左右。槲皮素和異鼠李素含量隨海拔升高而逐漸降低，最大值在1 150 m 處，分別為0.53和0.78 mg·g-1。

圖3 沙棘果實黃酮類化合物含量沿海拔的變化Fig.3 Changes of flavonoids contents of berries along altitude in sea buckthorn

2.4 不同海拔中國沙棘的生長情況和光合指標

由表3可知，中國沙棘的株高和冠幅整體均隨海拔高度的增加呈先升高后降低趨勢。其中株高在1 400 m處達到最大值，為3.6 m；冠幅在1 650 m處達到最大值，為2.3 m，顯著高于其他海拔。葉面積在1 650 m處達到最大值，為326.55 mm2，除略高于2 100 m處外，顯著高于其他海拔。凈光合速率和氣孔導度整體均隨海拔高度的增加呈升高趨勢，均在2 100 m處達到最大值，分別為18.34 μmol CO2·m-2·g-1和1.65 mmol H2O·m-2·g-1。

表3 不同海拔沙棘的株高、冠幅、葉面積、凈光合速率和氣孔導度Table 3 Plant height，crown width，leaf area，net photosynthetic rate and stomatal conductance of sea buckthorn at different altitudes

2.5 不同海拔和季節條件下中國沙棘的非結構性碳含量

由圖4 可知，葉片、一年生枝、果實中不同季節淀粉和可溶性糖含量隨海拔升高整體均呈先升高后降低趨勢，均在1 650 m 處達到最大值。對于同一部位，各海拔一年生枝可溶性糖和NSC 含量均表現為7月＞9月，各海拔葉片可溶性糖和NSC含量表現為5月＞7月＞9月；對于同一海拔，7月一年生枝可溶性糖和NSC 含量均大于葉片，9月為果實＞一年生枝＞葉片，果實NSC含量最大為17%左右，一年生枝和葉片NSC 含量最大接近14%。

圖4 不同季節沙棘不同部位NSC含量沿海拔的變化Fig.4 Changes of NSC content of different parts in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.6 不同海拔中國沙棘黃酮類化合物含量與生長和生理指標的關系

通過對9月中國沙棘果實和葉片總黃酮及其成分含量與氣候因子、海拔、生長和生理指標進行相關性分析，發現果實總黃酮含量與果實可溶性糖、果實NSC、葉片可溶性糖、葉片NSC 含量呈極顯著正相關，葉總黃酮含量與果實可溶性糖和果實NSC 含量呈顯著正相關。果實楊梅素和葉槲皮素含量與海拔極顯著正相關，而果實槲皮素和果實異鼠李素含量與海拔極顯著負相關；果實楊梅素含量與季均溫呈極顯著負相關，與季均降水量呈顯著或極顯著正相關；果實槲皮素含量則與季均溫呈極顯著正相關，與季均降水量呈極顯著負相關。果實槲皮素和果實異鼠李素含量還與凈光合速率、葉面積等指標呈顯著或極顯著負相關（表4）。

表4 沙棘黃酮類化合物與生長指標、氣候指標、碳代謝之間的相關性Table 4 Results of correlation analysis between flavonoids and growth indexes，climate indexes and carbon metabolism in sea buckthorn

3 討論

3.1 海拔高度和季節對中國沙棘黃酮類化合物含量的影響

海拔變化可引起復雜的環境變化，從而引起黃酮類化合物含量的變化。前人研究發現，黃芩、軟棗獼猴桃、長白山篤斯越桔、祁連圓柏、杜松、紅豆杉等植物的酚類物質或總黃酮含量均隨海拔升高而升高［22-27］。而本研究中，野生中國沙棘葉片、一年生枝、果實中總黃酮含量均隨海拔梯度（1 150～2 100 m）呈先升高后下降趨勢，整體以1 650 m 處的含量最高。一般來說，隨著海拔升高，紫外線輻射增強，黃酮類化合物可增強植物應對紫外線輻射的能力，紫外光調控了黃酮類化合物合成過程中的酶活性，從而促進黃酮類化合物的合成［11］。也有研究表明，低溫（4或5 ℃）處理有利于黃酮類化合物的積累［28-29］。本研究海拔1 650 m處春、秋季均溫分別為5.6 和4.7 ℃，與文獻［28-29］中可促進黃酮類化合物積累的溫度接近，說明適度低溫有利于黃酮類化合物的積累，海拔過高導致溫度過低，可能對植物生長不利。本研究還發現，四種主要類黃酮成分含量隨海拔的變化趨勢并不一致，原因可能是不同黃酮成分的作用機制和調控機制不同，具體有待進一步深入研究。

在比較沙棘葉片和果實黃酮含量的研究中，都一致報道了同一沙棘株系葉片總黃酮含量高于果實［2，30-33］，對枝的研究相對較少，有研究發現沙棘枝中總黃酮含量遠低于葉片［34-35］。本研究發現，中國沙棘總黃酮含量表現為葉片＞果實＞一年生枝，與前人研究結果基本一致［34-35］。同時，葉片總黃酮含量也存在季節變化，表現為9月＞7月＞5月，說明隨著葉齡的增加，黃酮類化合物在葉中的積累也增加。一年生枝的總黃酮含量在同一海拔表現為7月高于9月，與葉片呈現不一致的規律，但一年生枝中最大總黃酮含量遠低于葉片和果實，利用價值不大。胡建忠等［8］研究發現，人工種植的中國沙棘葉片總黃酮含量在5—7月高于8—9月，與本研究結果相反，可能是因為總黃酮含量受季節和環境因素的共同影響，本研究所在地為關帝山區，海拔是主要影響因素。

3.2 生長和碳代謝對不同海拔中國沙棘黃酮類化合物含量的影響

本研究發現，中國沙棘在海拔1 650 m處于良好的生長狀態。前期研究也發現低海拔和高海拔均對中國沙棘生長產生抑制，低海拔主要受干旱脅迫影響，高海拔的低溫、生長季縮短同樣不利于中國沙棘生長［36］。雖然有研究發現干旱脅迫可促進次生代謝物的積累，但長期、重度干旱脅迫則不利于次生代謝物積累［12］。較多研究觀察到短期、輕度干旱條件下，植物體內會有一個碳積累的過程［37］，該時期植物可能會產生更多的次生代謝物質用于防御。但在重度或長期干旱條件下，植物體內水分輸導嚴重受阻，儲存碳逐漸被消耗導致碳供需失衡，植物不可能將儲存碳用于合成次生代謝物［38］。因此，黃酮的積累也是植物生長和碳代謝權衡的結果，在不影響植物正常生長的情況下，適度脅迫有利于黃酮積累。

關帝山區中國沙棘的凈光合速率隨海拔升高呈現升高趨勢，在2 100 m處達到最大值。眾多研究提出植物存在水-碳耦合機制，其中之一體現在光合作用對水分狀況的依賴上［39］。隨著海拔的升高，關帝山區降水增多，凈光合速率也隨之增大。但是較高的凈光合速率并未轉化為高水平的非結構性碳（NSC），中國沙棘各個部位NSC含量在2 100 m處反而下降，可能是由于高海拔處葉面積降低、日光合有效時間及生長季縮短導致光合產物含量降低。中國沙棘葉片、一年生枝、果實NSC和可溶性糖含量均在1 650 m處達到最大值，樹木生長狀況也優于其他海拔，表明此處樹木光合產物供應充足。NSC主要為各種生理過程提供能量和代謝中間產物，為結構物質和功能分子提供配基，很多黃酮類成分即是與糖基結合形成黃酮醇苷類化合物［4］。因此，NSC不足不僅會影響植物的生理代謝過程，也會影響黃酮類化合物的合成，而光合產物供應充足有利于黃酮類化合物的積累。

4 結論

關帝山野生中國沙棘總黃酮含量表現為葉片＞果實＞一年生枝，均隨海拔高度（1 150～2 100 m）的增加呈先升高后降低趨勢，在中海拔（1 650 m）處達到最大值。葉片總黃酮含量在9月最高。1 650 m 處植株綜合生長狀況最好，葉片、一年生枝和果實非結構性碳（NSC）含量最高。果實總黃酮含量與果實可溶性糖、果實NSC、葉片可溶性糖、葉片NSC 含量呈極顯著正相關。葉片總黃酮含量與果實可溶性糖和果實NSC 含量呈顯著正相關。果實楊梅素和葉槲皮素含量與海拔呈極顯著正相關，而果槲皮素和果異鼠李素含量與海拔呈極顯著負相關。表明中海拔（1 650 m）中國沙棘的葉片和果實是黃酮含量較高的部位，生長季后期黃酮在葉片積累較多，沙棘體內總黃酮含量除受環境條件影響外，還與植物生長狀況和碳代謝密切相關。