姜黃素抑制NF-κB信號通路緩解氧化應激對成骨分化的損害發揮抗骨質疏松作用

胥甜甜,田昊春,楊新民,羅棟華,王長根,漆啟華

( 南昌大學第一附屬醫院 1. 藥學部、2.骨科,江西 南昌 330006; 3. 江西省高安市瑞州醫院,江西 宜春 336000;4. 江西省贛州市尋烏縣人民醫院,江西 贛州 34100)

絕經后婦女的雌激素缺乏被認為是骨質疏松的病因[1],現有觀點認為,氧化應激也是參與骨質疏松發生[2]的主要因素之一,同時,雌激素的減少也會導致體內氧化應激反應的增加。許多研究者認為,絕經后骨質疏松婦女的骨質減少與超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione,GSH) 水平降低、血脂氧化水平升高有關[3]。在整個生命過程中,骨組織在不斷更新,骨的形成和吸收不斷進行,氧化還原狀態的改變通過調節破骨細胞和成骨細胞活性之間的平衡來改變骨重塑過程[4]。ROS誘導成骨細胞凋亡,降低其活性,不利于骨形成。高水平的ROS阻斷并減少成骨細胞分化,礦化和成骨減少[5]。

姜黃素是一種從姜黃科植物的根莖中提取的一種酚性色素,已被證明具有良好的抗炎和抗氧化等特性[6],其被發現能有效拮抗細胞內ROS和清除自由基[7],在氧化應激與骨形成中起著重要的作用。據報道,姜黃素可以通過減弱對Wnt/β-catenin信號的抑制來保護氧化損傷,促進成骨細胞分化[8]。線粒體氧化還原電位對細胞的影響至關重要,姜黃素不僅能降低線粒體氧化狀態,還能改善線粒體膜電位,改善氧化應激誘導的成骨細胞凋亡[9]。許多體外研究表明,姜黃素逆轉了氧化應激引發的破骨細胞的增殖和分化,并改善了去卵巢動物 (ovariectomized,OVX) 在體內的骨丟失[10]。

關于姜黃素如何調節氧化應激和骨質疏松癥的研究較少,其主要相關的信號通路也不清楚。姜黃素與骨質疏松癥之間的劑量依賴性關系也需要說明。因此,本研究將利用體外H2O2誘導的氧化應激模型和體內小鼠去卵巢模型來研究姜黃素的抗氧化應激作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物與細胞 8周齡BALB/c雌性小鼠,體質量(20.52±1.27)g(南昌大學醫學院實驗動物中心),小鼠MC3T3-E1細胞 (ATCC,Manassas,VA,USA) 。動物實驗符合3R原則,且本實驗通過南昌大學醫學院第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準(批號:CDYFY-IACUC-202305QR002)。

1.1.2藥品與試劑 姜黃素(Sigma公司,純度98.0%,分子量368.38)、RANKL、IL-6 ELISA檢測試劑盒(R&D公司,美國,貨號分別為:MTR00、SM6000B)、IκB-α,p-p65,β-actin 抗體(Cell Signaling Technology公司,美國,貨號分別為:4814、4025、3700),小鼠NTX(I型膠原交聯n-端肽)、PICP(1型前膠原羧基末端前肽)、ELISA試劑盒(伊萊瑞特公司,中國,貨號分別為:E-EL-M3022、E-EL-R0740c)、BCA蛋白檢測試劑盒(賽默飛公司,美國,貨號:23235),GSH、MDA、BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(碧云天公司,中國,貨號:C3206)、胎牛血清(Gibco Invitrogen,美國,貨號:10099)、地塞米松、β-甘油磷酸、H2O2、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、茜素紅S、甲基噻唑基四唑(MTS)、對硝基苯基磷酸(pNPP)購自Sigma公司,貨號分別為:D4902、G9422、HX0636、01042、A5533、1.11714、20-106。

1.1.3儀器 全自動流式細胞儀(美國Agilent公司,型號:NovoCyte)、全自動酶標儀(美國Molecular Devices公司,型號:SpectraMax Gemini XPS),顯微鏡(日本OLYMPUS公司,型號:CX31)、多功能顯微圖象分析系統(德國Leica公司,型號:LK-5GHD)、熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司,型號:QuantStudio 1 Plus)、核酸/蛋白凝膠圖象分析系統(中國上海嘉鵬科技有限公司,型號:Nano-600)等。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 MC3T3-E1細胞培養與成骨誘導MC3T3-E1細胞按5×103細胞/cm2的密度接種于培養瓶,加入25 mL含10%胎牛血清的完全培養基,待細胞融合至80%～90%后傳代。MC3T3-E1細胞融合達到80%～90%將基礎培養基(BM)更換為成骨分化誘導液(OM,0.1 μmol·L-1地塞米松、50 mg·L-1維生素C和10 mmol·L-1β-甘油磷酸)每隔2～3 d更換誘導液1次。

1.2.2造模與分組 MC3T3-E1細胞種板于24孔板,每孔2.5×105個細胞,次日,待細胞完全貼壁后,分別與0、0.1、0.2、0.3、0.5、1 mmol·L-1H2O2共培養24 h后,換成骨誘導液,分別誘導7、14、21 d。同法,細胞分別與0、1、5、10、20、50、100 μmol·L-1濃度姜黃素共培養24 h后,換成骨誘導液,誘導7、14、21 d。根據上述細胞分別被過氧化氫,姜黃素處理后成骨誘導分化的實驗結果分為6組:①對照組;②H2O2組;③H2O2+姜黃素組(1 μmol·L-1);④H2O2+姜黃素組(10 μmol·L-1);⑤H2O2+姜黃素組(20 μmol·L-1);⑥ H2O2+NAC (2 mmol·L-1)。

1.2.3細胞內ROS水平及細胞活力測定 細胞種板培養后,不同濃度的H2O2(0.1、0.2、0.3、0.5、1、2 mmol·L-1) 作用于MC3T3-E1細胞24 h,然后將細胞在含20 μmol·L-1DCFH-DA的37 ℃下培養30 min,洗滌,倒置顯微鏡觀察熒光。消化后,上流式細胞儀在488 nm激發波長,525 nm發射波長條件下檢測熒光強度。同樣,在細胞中加入不同濃度的姜黃素(1、5、10、20、50、100和200 μmol·L-1溶解在蒸餾水中)作用24 h后檢測細胞活力。0.1% DMSO作為對照組。細胞用姜黃素(1、5、10、20、50、100或200 μmol·L-1)全培養基培養24 h后,加入0.3 mmol·L-1H2O2培養24 h,檢測細胞活力。

1.2.4堿性磷酸酶(ALP)染色及活性測定 根據試劑盒使用方法分別檢測ALP活性以及ALP染色。用0.3 mmol·L-1H2O2處理MC3T3-E1細胞24 h,并加入含有不同濃度姜黃素的成骨誘導液誘導分化7 d,4%多聚甲醛固定細胞后,每孔加入BCIP/NBT染色工作液,用蒸餾水洗滌1～2次即可終止顯色反應,并在405 nm處測定吸光度。

1.2.5鈣含量測定和茜素紅染色 根據試劑盒要求,在成骨誘導分化的第21天使用鈣測定試劑盒測定鈣含量。在6孔培養板中誘導后的細胞加入1 mol·L-1醋酸,在4 ℃下渦旋過夜提取鈣。將50 μL提取物與150 μL鈣測定試劑混合,在37 ℃下孵育30 s。用酶標儀測定575 nm處的吸光度。細胞用4%多聚甲醛固定15 min,室溫下用40 mmol·L-1茜素紅染色15 min,蒸餾水去除未結合染色,使用光學顯微鏡和數碼相機對其細胞進行可視化和成像。

1.2.6RANKL和IL-6測定 暴露于H2O224 h后,小鼠MC3T3-E1細胞用含有3種不同濃度 (1、10、20 μmol·L-1) 姜黃素的成骨分化誘導液誘導7 d,定期換液。按照試劑盒要求,收集上清液,分別檢測各組上清液中的IL-6及RANKL的表達。

1.2.7蛋白印跡試驗 姜黃素預處理細胞24 h,H2O2處理細胞1 h,收集細胞,加入 200 μL RIPA 裂解液,冰上裂解細胞 30 min,將裂解后的樣品4 ℃離心 10 min(12 000 r·min-1),取上清。以 BCA 試劑盒測定蛋白濃度。加入適量的上樣液,并在100 ℃×10 min條件下使蛋白變性,取20 μg 樣品進行電泳、轉膜和封閉。按說明書分別加入抗體p-p65、p-IκBα和β-actin過夜,加入ECL顯色液,避光反應 1 min,顯影并定影。以β-actin為內參對照,各條帶灰度值采用 ImageJ 軟件進行分析。

1.2.8去卵巢小鼠模型及姜黃素處理 采用雙側性腺(卵巢)摘除法制備氧化應激小鼠模型。假手術組小鼠只需做一長約1.5 cm背部切口后立即縫合。采用數字隨機法將40只小鼠隨機分為4組:①假手術組;②去卵巢組;③去卵巢+姜黃素低劑量組 (5 μmol·kg-1·d-1);④去卵巢+姜黃素低劑量組 (15 μmol·kg-1·d-1),第一次給藥為術后1周,而后每24 h給藥1次,連續8周。假手術組及去卵巢組給予等量含DMSO的生理鹽水,所有給藥方式均為腹腔注射。動物麻醉成功后,顯露右心室,注射器徹底抽血處死,EP管收集血漿,試劑盒檢測MDA、GSH、NTX、PICP。

1.2.9采用Van Gieson (VG) 染色及顯微CT掃描進行組織學檢查 獲取各組雙側的股骨組織,標本用生理鹽水沖洗后,用生理鹽水浸潤的紗布包裹,并用錫箔紙封存,置于-80 ℃冰箱中凍存,右側股骨標本用作micro-CT檢測骨顯微結構特征后,將標本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,并行脫鈣處理,行VG染色,觀察骨小梁結構變化。

2 結果

2.1 細胞氧化應激模型的建立及姜黃素干預的影響體外將細胞暴露于H2O2中,建立了氧化應激細胞模型,并通過流式細胞術評估不同H2O2濃度下的氧化應激水平。在24 h內,細胞內ROS水平隨著H2O2濃度的增加而升高(Fig 1A)。在濃度為0.3 mmol·L-1H2O2條件下,暴露于H2O224 h后,細胞活力明顯下降(Fig 1B)。姜黃素20 μmol·L-1或較低濃度下培養24 h并不影響細胞活力(Fig 1C)。但是,暴露于0.3 mmol·L-1H2O2中,10 μmol·L-1或較低濃度的姜黃素預處理改善了細胞活力,而在20 μmol·L-1姜黃素中不存在這種作用(Fig 1D)。這表明姜黃素在10 μmol·L-1及以下濃度可部分抑制H2O2誘導的細胞毒性。

2.2 姜黃素逆轉了H2O2對成骨分化的抑制作用在第7天檢測ALP染色和活性,并在第21天評估鈣水平。本實驗選擇了0.3 mmol·L-1H2O2,姜黃素濃度分別為1、10、20 μmol·L-1。細胞暴露于H2O224 h后,加入含姜黃素的成骨培養基。1、10 μmol·L-1姜黃素共培養逆轉了H2O2誘導的成骨功能障礙,ALP活性和鈣水平升高,而20 μmol·L-1并沒有逆轉功能障礙(Fig 2A-2D)。10 μmol·L-1姜黃素顯著改變了H2O2誘導的鈣沉積功能障礙,1 μmol·L-1處理顯著逆轉了ALP活性。

Fig 1 Intracellular ROS after exposed to H2O2 and cell viability of different concentrations of H2O2 or

Fig 2 Curcumin protected cell osteogenesis from H2O2 exposure

2.3 姜黃素抑制IL-6和RANKL的表達IL-6和RANKL被認為是成骨細胞分泌的兩種重要的細胞因子。0.3 mmol·L-1H2O2作用24 h后,IL-6和RANKL水平在成骨誘導后7 d顯著升高。然而當與姜黃素共培養時,RANKL和IL-6的表達水平受到部分抑制,特別是在1 μmol·L-1和10 μmol·L-1時抑制明顯(Fig 3A、3B)。

2.4 NF-κB信號通路參與抗氧化應激作用NF-κB作為炎癥反應中常見的核轉錄因子,在調節成骨過程中也起著重要作用。當暴露于H2O2時,磷酸化的p65亞基的表達增加,在細胞質中與p65亞基結合的IκB-α減少。而姜黃素 (1 μmol·L-1) 則明顯降低了p-p65的表達,但10、20 μmol·L-1的無顯著性差異。IκB-α的表達水平與p-p65一致。因此,姜黃素可能通過NF-κB信號通路發揮抗氧化保護作用(Fig 4A-C)。

2.5 姜黃素降低體內的氧化應激給OVX小鼠腹腔注射不同劑量的姜黃素后,體內氧化還原狀態有不同的變化。結果發現,去卵巢組血清中MDA的活性升高,而GSH的活性降低,姜黃素處理后血清中MDA水平下降,GSH活性部分保留(Fig 5A、5B)。

2.6 姜黃素在體內逆轉骨代謝NTX和PICP值是絕經后婦女常見的骨代謝指標。為了評價姜黃素對骨代謝的影響,評價OVX小鼠中NTX和PICP的變化。NTX與破骨細胞活性相關,被認為是骨吸收的重要生化指標。OVX組的血清NTX(Fig 6A)明顯高于其他組,姜黃素組(5和15 mg·kg-1)低于對照組。姜黃素各組(5和15 mg·kg-1)之間無差異。PICP與成骨細胞活性相關,被認為是骨形成的重要生化指標。OVX組血清PICP(Fig 6B)明顯低于對照組,而姜黃素組血清PICP(5和15 mg·kg-1)均高于OVX組。姜黃素各組間存在顯著差異(5mg和15 mg·kg-1)。這些結果表明,姜黃素抑制了破骨細胞的功能,但其抑制作用與劑量無關,姜黃素促進了骨形成,并與其劑量有關。

Fig 3 Curcumindown-regulated level of IL-6 and RANKL

2.7 姜黃素改善了OVX小鼠的骨量和骨結構采用VG染色和顯微計算機斷層掃描 (micro-CT) 檢查檢測骨量和顯微結構。如Fig 7A所示,對照組小鼠股骨髁骨小梁結構正常。而VG染色的OVX小鼠骨小梁稀疏、稀薄,姜黃素處理改善了骨小梁的厚度、密度和數量。通過micro-CT掃描定量骨密度和骨量(Fig 7B)。通過姜黃素的處理,BMD、Tb.N、Tb.Th數值相對OVX組改善,且高劑量改善更為明顯(Fig 7C-F)。可見姜黃素治療以劑量依賴性的方式改善了骨密度及微結構。這些結果表明,姜黃素逆轉了體內的骨丟失。

Fig 4 NF-κB pathways involved in curcumin-mediated anti-oxidation

3 討論

氧化應激被認為是目前導致骨質疏松癥的主要原因,為此我們采用氧化應激細胞模型來研究骨質疏松癥。在本實驗中,研究者發現細胞的活力受H2O2濃度的影響,H2O2濃度越高,細胞的活力越低。該研究使用流式細胞儀檢測細胞內ROS的變化,發現細胞內ROS隨著H2O2濃度的增加而增加。在24 h內,它在0.3 mmol·L-1濃度下最高,因此本研究認為H2O2與細胞共培養24 h可以產生大量ROS。在Leichnitz的研究中使用流式細胞儀測量了ROS[11],結果與我們的是一致的。此外,本研究還評價了H2O2和姜黃素的毒性,0.3 mmol·L-1H2O2對細胞活力影響非常顯著,20 μmol·L-1姜黃素對細胞活性沒有影響,不能改善0.3 mmol·L-1H2O2共培養的細胞活力,所以研究中使用0.3 mmol·L-1H2O2和20 μmol·L-1及以下濃度的姜黃素。Wang等[12]報道的實驗中使用0.2 mmol·L-1H2O2,與人成體干細胞 (ASC) 共培養,Huang的實驗中使用MC3T3-E1,也選擇了0.3 mmol·L-1H2O2[13],本研究也證實了低濃度的姜黃素挽救了H2O2引起的損傷。雖然20 μmol·L-1姜黃素對細胞沒有毒性,但20 μmol·L-1姜黃素未能挽救其前成骨細胞的活力。其作用機制尚不清楚,可能是20 μmol·L-1姜黃素在H2O2作用下具有毒性。許多研究表明,姜黃素逆轉了阿爾茨海默病 (AD) 動物模型中的神經毒性和行為損傷,這是由于大量ROS的產生,似乎是一種很有前途的預防AD的分子[14]。細胞內ROS的產生可以消耗細胞內還原劑的水平達到對細胞損傷的效果[15]。

Fig 5 Curcumin attenuated expression of MDA and GSH in vivo

Fig 6 Curcumin reversed bone turnover in vivo

ALP活性和鈣含量是影響成骨的主要指標。ALP是一種成骨的早期生物標志物,而鈣則是一種晚期的生物標志物。在此項研究中,測量了鈣含量、ALP活性和染色的結果。結果發現,低濃度的姜黃素在氧化應激下保護成骨。Kim等[16]發現,姜黃素與BMP-2聯合使用可促進骨組織再生,ALP和鈣含量上調。因此,研究者推測1 μmol·L-1姜黃素在早期保護成骨,而10 μmol·L-1姜黃素在晚期保護成骨。也研究發現,姜黃素增加了大鼠間充質干細胞向成骨細胞的分化,ALP活性增強,礦化結節形成。人骨髓來源單個核細胞經H2O2培養時,破骨細胞的數量和活性顯著增加[17]。NF-κB受體激活因子 (RANKL) 和骨保護素 (OPG) 的配體是破骨細胞和成骨細胞活性的重要調節因子。RANKL/OPG比值對氧化應激敏感,導致骨重塑過程中大量骨吸收。氧化應激還可以通過釋放細胞因子和前列腺素來上調RANKL以增加破骨細胞的生成[18]。成骨細胞和破骨細胞共同決定是否存在骨質疏松癥。

破骨細胞的分化在一定程度上依賴于成骨細胞,RANKL是促進破骨細胞成熟的重要因素[19]。成骨細胞還分泌炎癥因子IL-6來調節骨重塑。研究證實,骨質疏松患者骨髓中IL-6和RANKL濃度較高[20]。該研究過程中,在培養上清液中也發現了大量RANKL和IL-6產生,并證實了姜黃素可以降低這兩個細胞因子的水平。姜黃素也被認為是一種抗炎劑。苦參堿和楊梅樹皮甙等抗氧化劑可以通過降低IL-6和RANKL的表達來抑制破骨細胞的生成,從而防止骨丟失[21- 22]。結果表明,姜黃素在10 μmol·L-1濃度下具有保護作用,這與減弱H2O2對成骨的抑制作用的濃度相似。

Fig 7 Curcumin reversed bone harms in OVX animal model

NF-κB信號通路是炎癥和氧化應激中的經典信號通路[23]。大量研究表明,姜黃素通過降低轉錄因子NF-κB的活性來逆轉炎癥和氧化過程中的生物學過程[24]。研究表明,姜黃素還降低了p-p65的表達和磷酸化因子的轉錄。1 μmol·L-1濃度的抑制作用顯著,但高濃度的無抑制作用,這與對IL-6和RANKL的影響相一致。因此,NF-κB信號通路可能是調控IL-6和RANKL表達的潛在途徑,同時也影響成骨前細胞的成骨過程。研究發現,甘草酸可以抑制NF-κB信號通路,減少炎癥細胞因子IL-6和RANKL的分泌[25]。在本研究中,姜黃素共同具有抗氧化和抗炎作用,氧化會通過炎癥因子的產生影響骨形成。姜黃素通過抑制P65的磷酸化來促進骨形成。

此外,為了驗證姜黃素是否能減輕體內的氧化應激,本研究采用了小鼠OVX模型,該模型被認為是典型的模擬骨質疏松癥。MDA是ROS脂質過氧化的產物;GSH是一種去除自由基,被認為是細胞內的抗氧化劑。這兩個指標的數量通常代表了身體的氧化還原狀態。一些研究發現,絕經后婦女的血清中MDA和GSH的產生發生了變化[26]。OVX組中MDA的產量增加,可能是對照組的1.6倍。相比之下,OVX組中GSH的數量減少到對照組的50%。姜黃素以劑量依賴性的方式逆轉了治療組的MDA/GSH的比值。姜黃素能有效地改變機體整體的氧化還原狀態。有研究表明,絕經后婦女的NTX、PICP存在差異,上述兩個指標被認為是骨轉換的生化指標[27]。血清NTX顯示姜黃素對破骨細胞有抑制作用,抑制骨吸收,且其作用與劑量無關,其潛在的機制尚不清楚,可能與微環境的氧化還原有關。姜黃素劑量可降低了血清PICP,表明姜黃素可能直接作用于成骨細胞,促進骨形成,這與姜黃素對P65表達的影響相一致。然而,未來還需要更多的證據來說明這一點。該試驗使用VG染色和micro-CT掃描觀察骨的結構,發現OVX患者的骨小梁骨的微結構顯著惡化。在姜黃素作用下,小梁骨相對對照組,小梁網狀骨結構得到改善。為了定量測定骨結構變化,研究中測量了股骨髁的骨密度、Tb.N、Tb.h等指標,與OVX組相比,治療組的上述指標均有劑量改善。15 μmol·L-1組的骨結構似乎更致密,這可能是由于姜黃素抑制氧化應激以促進成骨前體細胞骨形成。

綜上,氧化應激抑制了成骨細胞的骨形成,低濃度姜黃素 (1～10 μmol·L-1) 可逆轉抑制作用,但高濃度(20 μmol·L-1) 卻不能。此外,NF-κB信號可能是其主要作用機制。姜黃素逆轉了氧化劑和抗氧化劑的比例,抑制了高水平骨代謝,改善了OVX的骨微結構,它可能是骨質疏松治療的理想藥物之一。