二烯丙基二硫增強DJ-1過表達人胃癌SGC7901細胞對5-FU的敏感性

尋 藝,夏 紅,李志敏,劉 芳,蘇 琦,蘇 波,3

(1. 南華大學衡陽醫學院腫瘤研究所,湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室;2. 湖南省胃癌防治研究中心,南華大學附屬第一醫院腫瘤科;3. 南華大學衡陽醫學院藥學院藥物藥理研究所,湖南 衡陽 421001)

在我國常見腫瘤中胃癌發病率居第二位、死亡率居第三位[1]。多藥耐藥是造成傳統化療藥物對胃癌療效不佳、預后差的主要原因之一[2]。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是大蒜中主要的有機硫化合物,它通過多靶點干預影響多條信號通路、針對各種腫瘤發揮抗癌活性[3]。本實驗室最近的研究證實,DADS通過上調RORα(retinoic acid-related orphan nuclear receptor α,維甲酸相關孤核受體α)負調控Wnt1(wingless-type MMTV integration site family member 1,無翅型MMTV 整合位點家族成員1)/β-catenin(β-連環蛋白)通路、抑制胃癌細胞生長、上皮-間質轉化、遷移侵襲[4]。

DJ-1(protein/nucleic acid deglycase,蛋白/核酸去糖化酶),也稱為帕金森病相關蛋白7,最初發現它與帕金森病等中樞神經系統疾病發生有關,此后許多研究顯示,DJ-1扮演著癌基因的角色,與腫瘤發生發展、轉移、耐藥、復發等密切相關[5-6]。本實驗室證實,過表達DJ-1可通過PTEN/AKT通路促進胃癌細胞體內外增殖、上皮-間質轉化、遷移侵襲[7]。

過表達DJ-1可賦予胃癌SGC7901細胞多藥耐藥的表型,敲低DJ-1能增加腫瘤細胞對化療藥物敏感性[8]。本實驗室經蛋白質組學研究發現,DADS誘導白血病細胞分化與其下調DJ-1表達有關,表明DJ-1是DADS發揮抗腫瘤作用的潛在靶點[9]。DADS是否能拮抗DJ-1介導的胃癌細胞耐藥尚不清楚。為此,我們觀察DADS對VCR(Vincristine,長春新堿)耐藥細胞和DJ-1過表達細胞增殖和凋亡的作用,分析DADS對耐藥相關基因表達的影響,研究DADS是否能改善DJ-1過表達細胞對5-FU的敏感性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑胎牛血清(F8245)為杭州四季青生物工程公司產品;嘌呤霉素(P8230-25)購自北京索萊寶公司;DADS(317691)為Sigma公司產品;Total RNA Kit(LS1030)、熒光定量PCR試劑盒(A6001)購自Promega公司;逆轉錄試劑盒(K1622)購自Thermo公司;BCA蛋白定量試劑盒(CW0014)購自北京康為世紀生物公司;MTT購自上海碧云天生物技術公司;DJ-1抗體(ab18257)、Bcl-2抗體(ab692)、P-gp(P-glycoprotein,P-糖蛋白)抗體(ab261736)、XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein,X連鎖凋亡抑制蛋白)抗體(ab227196)、caspase-3 抗體(ab13847)、FITC偶聯的二抗購自Abcam公司;β-actin抗體(TA-09)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;ECL發光試劑盒購自Millipore公司。

1.2 細胞培養人胃癌SGC7901細胞、VCR耐藥SGC7901細胞由南華大學腫瘤研究所保存;實驗室之前已建立DJ-1過表達細胞系[7],上述細胞用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養基培養,置于37 ℃培養箱。實驗分為Control組、DADS組、VCR組、VCR+DADS組、DJ-1組、DJ-1+DADS組。

1.3 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)檢測細胞增殖細胞接種于96孔板,每組設5個重復孔,用1.25、2.5、5、10、20 mg·L-15-FU (5-fluorouracil,5-氟尿嘧啶)細胞處理48 h;DADS濃度為30 mg·L-1;每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·L-1),孵育4 h,測定OD450值。以未處理組A值為參照,計算細胞增殖率,細胞增殖抑制率/%=1-(實驗組A值/未處理組A值)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡將3×105細胞接種6孔板,處理48 h后,用PBS洗滌收集的細胞,重懸于500 μL結合緩沖液,加入Annexin V-APC 和7-AAD,避光孵育15 min后上流式細胞儀檢測。

1.5 qRT-PCR分別按照Total RNA Kit、逆轉錄試劑盒說明書進行總RNA提取和逆轉錄,SYBR熒光檢測試劑盒用于Real-time PCR分析。MDR-1 (multidrug resistance 1): F: 5′-GACATGACCAGGTATGCCTA-3′, R: 5′-CTTGGAGACATCATCTGTAAGTC-3′; Bcl-2: F: 5′-AGATGTCCAGCCAGCTGCAC-3′, R: 5′-TGTTGCTTCACTTGTGGCC-3′; XIAP: F: 5′-GTGGTGGAAAACTGAAAAATTGG-3′; R: 5′-GAAAGTGTCGCCTGTGTTCTGA-3′; caspase-3: F: 5′-CTCGGTCTGGTACAGATGTCGATG-3′; R: 5′-CGTTAACCCCGGGTAAGAATGTGCA-3′; β-actin: F: 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′, R: 5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。相對定量分析采用ΔΔCT方法。

1.6 Western blotRIPA(radioimmunoprecipitation assay)細胞裂解液用于總蛋白提取,BCA法測定濃度后,各組等量樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜后封閉1 h,4 ℃孵育一抗過夜,洗膜后加二抗孵育1 h,洗膜后加ECL發光液,X片曝光。檢測灰度值,β-actin作為內參,計算蛋白相對表達量。

1.7 免疫熒光4%多聚甲醛固定各組細胞,0.5%Triton X-100透化細胞,山羊血清封閉30 min后,37 ℃孵育一抗1 h, 之后用FITC偶聯的二抗孵育1 h,室溫下DAPI孵育5 min,熒光顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 DADS下調DJ-1過表達細胞DJ-1表達Western blot檢測顯示,與空載體組比較,DJ-1組表達明顯增高(P<0.05)(Fig 1)。之前我們證實,30 mg·L-1DADS能抑制SGC7901細胞增殖[4],因此本實驗仍采用30 mg·L-1DADS處理細胞。與DJ-1組比較,DJ-1+DADS組DJ-1蛋白水平降低(P<0.05)(Fig 1),表明DADS能下調過表達細胞DJ-1表達。

Fig 1 DJ-1 was down-regulated by DADS in DJ-1 overexpressed cells n=3)

2.2 DADS增強5-Fu誘導的DJ-1過表達細胞、VCR耐藥細胞增殖抑制用1.25、2.5、5、10、20 mg·L-1濃度的5-Fu處理細胞48 h,結果顯示(Fig 2),Control組的增殖抑制率分別為2.2%、4.9%、16.1%、23.2%、44.6%,DADS組的抑制率分別為4.1%、10.3%、25.1%、47.4%、58.6%,高于Control組(P<0.01),表明DADS能增強5-Fu對細胞增殖的抑制作用;VCR組的增殖抑制率分別為0.2%、0.8%、1.5%、3.1%、4.4%,低于Control組(P<0.01),說明VCR耐藥細胞對5-Fu的敏感性降低;VCR+DADS組的抑制率分別為1.9%、3.5%、7.4%、20.3%與29.4%,高于VCR組(P<0.01),說明DADS能增強VCR耐藥細胞對5-Fu的敏感性;DJ-1組的增殖抑制率分別為1.1%、3.1%、12.1%、17.8%、35.8%,低于Control組(P<0.05),表明過表達DJ-1導致細胞對5-Fu的敏感性下降;DJ-1+DADS組的抑制率分別為2.3%、7.4%、17.3%、30.9%、51.0%,高于DJ-1組(P<0.01),說明DADS能提高DJ-1過表達細胞對5-Fu的敏感性。

Fig 2 DADS augmented 5-Fu-induced proliferative inhibition of VCR-resistance and DJ-1 overexpressed cells n=3)

2.3 DADS誘導DJ-1過表達細胞和VCR耐藥細胞凋亡如Fig 3所示,VCR組、DJ-1組凋亡率分別為1.7%和3.2%,均低于Control組6.5%(P<0.01),表明VCR耐藥細胞和過表達DJ-1細胞表現凋亡抑制;DADS組、VCR+DADS組、DJ-1+DADS凋亡率為13.9%、8.1%、10.26%,分別高于Control組、VCR組、DJ-1組(P<0.01),表明DADS不僅誘導Control組細胞凋亡,而且能誘導DJ-1過表達細胞和VCR耐藥細胞凋亡。

2.4 DADS對DJ-1過表達細胞和VCR耐藥細胞耐藥相關基因表達的影響與Control組比較,VCR組和DJ-1組MDR-1、Bcl-2、XIAP的mRNA水平明顯上調,caspase-3 的mRNA水平明顯下調(P<0.01)(Fig 4);VCR組和DJ-1組P-gp、Bcl-2、XIAP蛋白水平增高,caspase-3 蛋白水平降低(P<0.01)(Fig 5),表明DJ-1影響耐藥相關基因表達;與Control組比較,DADS組MDR-1、Bcl-2、XIAP基因表達下調(P<0.05),caspase-3上調(P<0.01)(Fig 4,5);DADS降低VCR耐藥、DJ-1過表達細胞MDR-1、Bcl-2、XIAP基因表達(P<0.05)、升高caspase-3表達(P<0.01)(Fig 4,5),表明DADS能調節VCR耐藥、DJ-1過表達細胞耐藥相關基因表達。

2.5 免疫熒光檢測耐藥相關分子表達檢測結果顯示(Fig 6),與Control組比較,DADS組P-gp、Bcl-2、XIAP表達降低、caspase-3表達升高;與Control組比較,DJ-1組和VCR組P-gp、Bcl-2、XIAP表達增加、caspase-3表達減少;與VCR組比較,DADS能下調VCR耐藥細胞P-gp、Bcl-2、XIAP表達、上調caspase-3表達;與VCR+DADS組相比,DADS對DJ-1過表達細胞發揮著同樣的作用。

Fig 3 Apoptosis induced by DADS in VCR-resistance and DJ-1 overexpressed cells n=3)

Fig 4 Effect of DADS on mRNA levels of drug-resistance associated genes in VCR-resistance and DJ-1 overexpressed cells n=3)

Fig 5 Effect of DADS on protein expression of drug-resistance associated genes in VCR-resistance and DJ-1 overexpressed cells n=3)

3 討論

DADS抗乳腺癌細胞耐藥作用及機制的研究報道較多,它通過調節信號通路影響耐藥相關基因表達、改善乳腺癌細胞耐藥[10]。例如,DADS抑制紫杉醇耐藥的三陰性乳腺癌細胞增殖、誘導凋亡作用與其促進活性氧釋放、下調細胞膜CD151(侵襲轉移相關分子)表達有關[11]。目前,DADS抗胃癌細胞耐藥作用及機制有待研究。

Fig 6 Expression of drug resistance related molecules detected by immunofluorescence(×400)

本研究結果顯示,DADS能增強非耐藥SGC7901細胞對5-FU的敏感性;與非耐藥細胞比較,VCR組細胞對5-FU的敏感性明顯降低,DADS能改善5-FU 對VCR耐藥細胞增殖的抑制作用,說明DADS能增強VCR耐藥細胞對5-FU的敏感性。有研究報道,VCR耐藥SGC7901細胞DJ-1的表達顯著高于非耐藥細胞,在非耐藥細胞過表達DJ-1可導致細胞對多種化療藥物耐藥[8]。我們分析,DADS改善VCR耐藥細胞對5-FU的敏感性可能與其拮抗DJ-1介導的耐藥有關。為此,我們接下來觀察DADS是否能拮抗DJ-1過表達介導的耐藥。

DJ-1在腫瘤中表達異常增高可導致許多信號通路(PI3K/AKT、ERK1/2、MEKK1/SEK1/JNK1、Wnt/β-catenin、雄激素受體等)過度激活,它是調節各種類型癌癥細胞惡性表型的關鍵因子,也是腫瘤細胞建立多藥耐藥機制的重要調節分子,它作為潛在的抗腫瘤治療靶點已引起廣泛的關注[5-6]。

DJ-1高表達與胃癌臨床進展、轉移、預后差呈正相關[12]。過表達DJ-1誘導多藥耐藥的胃癌細胞表型[8]。siRNA下調DJ-1表達可提高阿霉素耐藥乳腺癌MCF-7細胞對阿霉素的敏感性[13];DJ-1在多藥耐藥小細胞肺癌細胞的表達明顯高于非耐藥細胞,DJ-1-siRNA能恢復耐藥細胞對阿霉素、順鉑、依托泊苷的敏感性,增強藥物抑制增殖和誘導凋亡作用[14]。本研究結果顯示,DJ-1過表達細胞對5-FU的敏感性降低,且細胞凋亡率低于非耐藥細胞,與VCR耐藥細胞相似,說明細胞對5-FU的敏感性降低與DJ-1過表達有關;DADS下調DJ-1表達的同時,增強5-FU對DJ-1過表達細胞的增殖抑制作用,并且DADS誘導DJ-1過表達細胞凋亡與其誘導VCR耐藥細胞凋亡作用相似,表明DADS抗DJ-1介導的胃癌細胞耐藥與其下調DJ-1表達有關。

P-gp是MDR-1基因表達的藥物轉運蛋白,通過泵出藥物分子導致多藥耐藥;Bcl-2具有抗凋亡作用;過表達DJ-1可使胃癌細胞P-gp、Bcl-2表達上調,敲低DJ-1表達可增加細胞對阿霉素、順鉑、VCR、5-FU的敏感性[8]。我們用DADS處理VCR耐藥、DJ-1過表達細胞,觀察耐藥相關基因表達的變化。結果顯示,DJ-1過表達細胞的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白水平以及Bcl-2表達均高于Control組,與VCR耐藥細胞相似;DADS能降低這兩種細胞P-gp、Bcl-2表達。文獻報道,DJ-1通過PTEN/PI3K/Akt/Nrf2 通路上調P-gp、Bcl-2表達、誘導胃癌細胞耐藥[15]。我們分析,DADS抑制P-gp、Bcl-2表達與其下調DJ-1有關;DADS下調DJ-1是否影響PTEN/PI3K/Akt/Nrf2及其他信號通路、發揮抗耐藥作用還有待證實。

XIAP是凋亡抑制蛋白家族成員之一,它不僅通過失活caspases抑制凋亡、還通過調節信號通路介導腫瘤細胞耐藥[16]。我們之前證實,DADS通過MicroRNA-7下調XIAP、抑制胃癌細胞增殖[17]。DJ-1通過PTEN/AKT通路增強黑色素瘤細胞增殖、侵襲能力,敲低DJ-1可降低survivin,升高caspase-3、Bax、p53、Daxx表達,說明DJ-1調節凋亡相關基因表達[18]。本實驗結果顯示,過表達DJ-1細胞中XIAP表達增高、caspase-3表達減少,與VCR耐藥細胞相似;DADS能降低XIAP、增加caspase-3表達,說明DADS增強DJ-1過表達細胞對5-FU的敏感性與其拮抗DJ-1對XIAP、caspase-3表達的影響有關。

綜上,DADS能抑制DJ-1過表達細胞P-gp、Bcl-2、XIAP表達、誘導caspase-3表達,增強細胞對5-FU的敏感性,DADS的增敏作用與其下調DJ-1表達有關。DADS是多靶點活性藥物,其抗腫瘤耐藥機制可能涉及多個方面[10]。因此,DADS抗胃癌細胞耐藥機制還需進一步研究。