異硫氰酸芐酯通過激活p53和AMPK-FOXO1a信號通路誘導宮頸癌細胞周期阻滯和凋亡

塔瑪莎·庫爾曼江,王小靜,李欣奕,王 昊,解國軒,陳雲杰,溫 婷,程夕露,努爾阿米乃·麥麥提,李金玉

(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室,新疆特殊環境物種多樣性應用與調控重點實驗室,新疆師范大學生命科學學院,新疆 烏魯木齊 830054)

宮頸癌是全球女性癌癥相關發病率和死亡率的主要原因之一。2020年全球宮頸癌新發病例60.4萬,發病率15.6/100 000;死亡病例34.2萬,死亡率8.8/100 000[1]。盡管通過人乳頭瘤病毒 (human papilloma virus,HPV) 疫苗接種和篩查可高度預防宮頸癌。對已經感染HPV的中晚期宮頸癌患者,仍迫切需要尋找新的高效、低毒抗宮頸癌藥物。

通過飲食蔬菜和水果是有效預防癌癥的手段。異硫氰酸酯(isothiocyanates,ITCs)是廣泛存在擬南芥、油菜、旱金蓮、水芹、卷心菜、甘藍、蘿卜等十字花科蔬菜中的一種天然抗癌活性分子,是由前體硫苷在體內黑芥子酶作用下水解而來[2]。到目前為止,已經報道了幾十種天然的或半合成的異硫氰酸鹽,以萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)、苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)和異硫氰酸芐酯(benzyl isothiocyanate,BITC)報道較多。BITC在結構上帶有一個芳香環側鏈和一個高度親電的碳原子中心,水解時會產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),因此造成脫氧核糖核酸氧化損傷[3]。研究證實,BITC是一種有效的化學保護劑,它可以防止嚙齒類動物的化學致癌作用,同時也具有抗癌作用。在不同的體內外實驗中發現,BITC能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡、細胞周期阻滯、抑制細胞遷移和侵襲、抑制血管生成和誘導細胞自噬。其中,乳腺癌、胰腺癌、肺癌是報道較多的腫瘤[4-5]。此外,研究證明,BITC對正常組織無毒性,是一種安全的有潛力的抗癌活性物質[6]。然而,BITC對宮頸癌的作用及其機制未有詳盡報道。本研究初步評估了BITC對小鼠宮頸癌細胞U14的細胞毒性,通過RNA-seq分析、qRT-PCR及Western blot方法探討了BITC抑制U14細胞增殖的作用機制,為開發和利用BITC用于宮頸癌治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物BITC(98%,C7H2F3NS)購于上海源葉公司,使用前溶于DMSO中,配置成200 mmol·L-1的母液,過濾除菌后,4 ℃冰箱儲存,使用時用DMEM培養液對其進行稀釋。

1.2 細胞培養將U14細胞(新疆醫科大學生物實驗室)接種在含DMEM培養皿(含10% FBS和1%雙抗)中,37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3 試劑MTT(3(- 4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司;順鉑(Cisplatin)購自上海源葉生物有限公司;DMEM培養基、胰蛋白酶、雙抗(青霉素10 kU·mL-1和鏈霉素10 g·L-1混合液),胎牛血清(FBS)購自BI公司;BCA蛋白定量試劑盒,ECL顯色劑,β-actin、Bcl-2、CytC、Bax、p21、MDM2、Cyclin D3、CDK2、Cyclin E、AMPK、Foxo1α二抗山羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術有限公司;caspase 3/7/9、cleaved caspase-3/7/9購自Cell Signaling Technology公司。

1.4 儀器DYCZ-24DN型電泳槽(北京六一),DYCZ-40D型轉膜槽(北京六一),DYY-10C型電泳儀(北京六一),Illumina 測序平臺(上海美吉生物公司),Cytoflex流式細胞儀(美國Beckman公司)

1.5 方法

1.5.1MTT法檢測U14細胞增殖活性 將對數生長期的細胞按照2×103/孔接種于96孔板中培養,每孔100 μL,37 ℃過夜培養24 h后,棄上清,用BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)和0.1% DMSO(相當于60 μmol·L-1BITC工作液中DMSO的濃度)分別處理U14細胞24、48、72 h,以不加配合物為空白對照,Cisplatin為陽性對照。每個組別設置6個平行孔。將上清吸出,在避光的環境下,每孔內添加無血清培養基配置的MTT 100 μL,細胞培養4 h后,吸出上清,再加入200 μL DMSO,振蕩孵育10 min,使其充分溶解結晶紫。酶標儀490 nm處讀取每孔吸光度值,按照如下公式計算細胞的相對活性:

細胞的相對活性=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%

1.5.2Hoechst staining 33258染色法檢測細胞核形變化 將對數生長期的U14細胞按照1×105/孔接種于24孔板中于37 ℃細胞培養箱中培養過夜,加入不同終濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)處理細胞24 h后,每孔添加預冷的4%多聚甲醛500 μL,4 ℃冰箱固定10 min,固定后,每組細胞用PBS洗滌,滴加用PBS溶液稀釋的Hoechst 33258染色溶液以1 ∶100,孵育5 min,用PBS洗滌3次(5 min/次),然后直接使用熒光顯微鏡觀察染色。

1.5.3流式細胞術檢測細胞凋亡和周期 對數生長期的U14細胞按照8×105/皿接種到60 mm的細胞培養皿中,用不同終濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)處理12 h后,1 200 r·min-1離心5 min收集細胞,收集的細胞沉淀用30 μL PBS重懸后,每個樣品分別加入膜聯蛋白V-FITC染液5 μL和PI染液5 μL,冰上避光孵育30 min;對于細胞周期,細胞沉淀先用70%乙醇固定過夜,去除乙醇后,用30 μL PBS重懸細胞,然后每個樣品加入PI染液5 μL冰上避光染色30 min,充分混勻后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期分布。

1.5.4轉錄組樣品和數據處理 將對數生長期的細胞按照5×106/皿接種于100 mm細胞培養皿中培養24 h后,用不同終濃度的BITC(0、20 μmol·L-1)分別處理U14細胞6 h 和18 h 后取樣。每個處理做3個生物學平行組。以不加BITC作為空白對照,培養6 h的3個空白對照組分別標記為K6-1、K6-2、K6-3。BITC處理6 h的3個實驗組分別標記為B6-1、B6-2、B6-3,培養18 h的空白對照組分別標記為K18-1、K18-2、K18-3。 BITC處理18 h的實驗組分別標記為B18-1、B18-2、B18-3。共計12個樣品用錫箔紙包裹后立即置于液氮中速凍。

采用TRIzol試劑盒提取樣品RNA,利用瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度,質量合格后,進一步富集純化mRNA,片段化逆轉錄得到雙鏈cDNA。然后依次末端修復,拼接,PCR擴增構建cDNA文庫。使用Illumina Novaseq 6000進行轉錄組測序得原始數據(raw data),采用Fastp分析軟件對raw data進行過濾,去除接頭和低質量的reads后得到Clean data。使用Hisat軟件,將Clean data和參考基因組進行比對,獲得后續分析的有效數據(mapped reads)。

1.5.5表達量分析及差異基因篩選 利用RSEM軟件對基因的表達水平進行定量分析,使用轉錄組條目(TPM)為表達量指標,進行樣本間基因差異的表達分析。使用DESeq2軟件并以P<0.05、Fold Change(FC)≥2和FC≤0.5為篩選條件獲得比較組間差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。

1.5.6GO功能和KEGG富集分析 利用Blast2GO軟件將DEGs在GO(Gene Ontology)數據庫進行比對獲得GO功能注釋,利用Goatools軟件對DEGs進行GO富集分析;將DEGs在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫進行比對獲得KEGG通路注釋信息。采用Fisher精確檢驗,以P<0.05時表示GO功能和KEGG通路出現了顯著富集。

1.5.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析 BITC(0、20 μmol·L-1處理細胞6 h后采用TRIzol試劑盒提取樣品總RNA,利用Primer Premier 5.0設計qRT-PCR引物 (Tab 1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按SuperReal熒光定量預混試劑盒說明書,以β-actin為內參基因,采用相對比較2-ΔΔCt法對部分差異基因的表達水平進行定量檢測,應用GraphPad Prism 9軟件作圖分析。

Tab 1 Ire1a,Aft4,β- actin and other gene primers design

1.5.8Western blot檢測凋亡相關蛋白表達 將對數生長期的細胞按照5×106/皿接種于100 mm細胞培養皿中,于37 ℃細胞培養箱中培養 24 h后,加入不同濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)處理12 h,離心收集細胞,加入RIPA裂解液冰上裂解20 min,離心保留上清,使用BCA法對細胞上清中的總蛋白含量進行定量。總蛋白采用12% SDS-PAGE電泳分離后,轉至硝酸纖維素(PVDF)膜。使用5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h后,TBST洗滌3次,15 min/次,加入一抗(β-actin、Bcl-2、Bax、CytC、caspase-3/7/9、cleaved caspase-3/7/9)37 ℃ 孵育2 h,TBST洗滌3次,然后加入二抗(HRP 標記的山羊抗兔 IgG )37 ℃ 孵育1 h,TBST 洗滌3次,按1 ∶1比例加入發光A液和B液,暗室顯色,用凝膠成像儀觀察顯影蛋白條帶。

1.5.9 統計學分析所有數據用Graphpad prism 9軟件進行統計分析,數據均顯示為mean±SD,n=3。采用單因素方差分析。與Control相比,P<0.05具有差異顯著性。

2 結果

2.1 BITC對U14細胞活力的影響用不同濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)處理細胞 24、48、72 h后,BITC顯著抑制了U14細胞的增殖作用 (P<0.001) (Fig 1A),72 h的抑制率分別為62.63%、92.56%、95.42% (Fig 1B),3個時間段的IC50值分別是22.54 μmol·L-1、15.39 μmol·L-1、12.43 μmol·L-1。與Control組相比,隨著BITC處理濃度的增加,細胞形態逐漸變圓,貼壁能力減弱,細胞數量顯著下降(Fig 1C)。

2.2 BITC誘導了U14細胞核DNA凝聚不同濃度的BITC (0、20、40、60 μmol·L-1)作用HeLa細胞24 h后,采用Hoechst 33258染色,倒置熒光顯微鏡觀察,如Fig 2所示,Control組可見細胞形態完整,細胞染色均勻,但BITC組染色質濃縮,藍白熒光強,且隨著濃度增加,細胞熒光比例增加,核碎片現象加重,表明BITC 作用于細胞DNA,可能誘導U14細胞凋亡。

2.3 BITC誘導U14細胞阻滯如Fig 3所示,BITC 處理U14細胞12 h后,顯著增加了G0/G1期細胞比例(P<0.05),降低了S期細胞分布(P<0.01)。同時,也觀察到G2/M期細胞隨著濃度增加先上升后降低。揭示BITC主要誘導細胞周期阻滯在G0/G1期。

2.4 BITC誘導U14細胞凋亡誘導腫瘤細胞凋亡是治療癌癥的手段之一。細胞凋亡途徑主要有外源性死亡受體途徑、內源性內質網途徑、內源性線粒體途徑[7]。為了進一步確認BITC是否誘導了U14 細胞凋亡,不同濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)作用U14細胞12 h 后,通過Annexin V-PI雙染,流式細胞儀檢測分析顯示,與Control相比,隨著 BITC濃度的增加,BITC劑量依賴性地誘導了細胞凋亡(P<0.05,P<0.01),細胞凋亡率從最初的7.81%上升到86.4%(Fig 4A)。Western blot進一步分析顯示(Fig 4B),與Control相比,促凋亡蛋白Bax、CytC、cleaved caspase-3/9表達顯著增加(P<0.05和P<0.01),抑制凋亡蛋白Bcl-2、caspase-3/7/9、cleaved caspase-7蛋白表達顯著下降(P<0.01)。這些結果表明,BITC可通過線粒體途徑誘導U14細胞凋亡。

Fig 1 Effect of BITC on proliferation of U14

Fig 2 The morphological changes of U14 cells after BITC treatment detected by Hochest 33258 stainingThe arrows indicate the chromosomal condensation.

Fig 3 Cell cycle distrubution in U14 cells upon BITC *P<0.05,**P<0.01 vs Control group.

Fig 4 Effect of BITC on apoptosis of U14

2.5 差異基因篩選采用RSEM軟件和DESeq2軟件進行差異篩選分析,如圖Fig 5所示,經BITC 6 h處理后,以空白組作為對照,在BITC處理組細胞中共獲得2 447個DEGs,其中下調基因1 308個,上調基因1 139個。經BITC 18 h 處理后,共獲得1 824個DEGs,其中下調DEGs有883個,上調DEGs有941個。由于BITC作用6 h的差異基因較多,以下通路富集分析主要呈現6 h轉錄組數據。

Fig 5 Number of DEGs in U14 cells after treatment of BITC for 6 h or 18 h in comparison to control

2.6 GO功能注釋和分類分析對DEGs進行功能分類,主要包括三個類別:生物過程(biological process,BP)、 細胞組分(cellular composition,CC)和分子功能(molecular function,MF)。經 BITC處理U14細胞6 h后,統計富集DEGs數量排名前20的功能分類(Fig 6)。DEGs富集于BP的主要有:細胞進程(cellular process)(1 475個基因)、生物調節(biological regulation)(1 253個基因);富集于CC的有:細胞成分(cell part)(1 766個基因),細胞器(organelle)(1 233個基因),細胞器成分(organelle part)(1 027個基因);富集于MF的主要有:結合(binding)(1 569個基因)。

Fig 6 TOP 20 GO function annotation and classification

2.7 KEGG通路富集分析對DEGs進行KEGG通路富集統計,柱狀圖(Fig 7)展現前20個顯著的富集途徑。如Fig 7顯示,BITC作用U14 6 h后,DEGs主要富集在細胞周期(Cell cycle)、MicroRNAs in cancer、 FOXO信號通路、Fanconi anemia patlravay 信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路和細胞凋亡等途徑(P<0.05)。

Fig 7 TOP 20 KEGG enrichment of DEGs in U14

2.8 細胞通路分析及驗證

2.8.1BITC通過p53信號通路誘導U14細胞周期阻滯 p53參與各種生物反應的激活,主要包括調控細胞周期停滯、DNA修復和細胞凋亡。KEGG pathway分析表明,在BITC處理U14 6 h 后,參與p53信號通路的差異基因有18個(Fig 8),其中有9個基因表達上調,如鼠雙微體(murine double minute 2,Mdm2)基因,細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,P21)基因;下調基因9個,如細胞周期基因CyclinD3、CyclinE,細胞周期蛋白依賴性激酶2基因(cyclin-dependent kinase2,CDK2)。

根據流式細胞周期與轉錄組數據分析結果,為了驗證 BITC是否通過調控p53細胞通路將U14細胞阻滯在G0/G1期,我們采用qRT-PCR和Western blot驗證上述基因及相關蛋白,如Fig 9A、9B所示,P21基因,MDM2基因及蛋白均表達上調,G0/G1期相關調控基因CyclinD3基因,CyclinE基因,Cdk2基因及蛋白均下調。p53基因雖在轉錄水平無明顯變化(與轉錄組數據一致),但在蛋白水平顯著上升,這可能與轉錄后調控有關。綜上所述,BITC可通過調控p53信號通路將細胞阻滯在G0/G1期。

2.8.2BITC也可通過內源性凋亡途徑誘導U14細胞凋亡 對BITC作用U14細胞6 h富集在細胞凋亡途徑中的DEGs分析發現(Fig 10),盡管沒有看到caspase的變化,但下游信號的切割作用底物,如促進細胞皺縮和膜泡發生的Actin基因表達上調,而與有絲分裂相關的微管蛋白α-tubulin以及與DNA周期,復制,分化,凋亡相關的核纖層蛋白Lamin基因下調,表明BITC引發了凋亡。此外,轉錄組數據分析發現內質網應激凋亡途徑中內質網應激激活肌醇酶1a (inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease-1,Ire1a)基因,轉錄激活因子4(activating transcription factor 4,Atf4)基因,C/EBP轉錄因子(C/EBP homologous protein,CHOP)基因表達上調。我們又進一步通過qRT-PCR和Western blot驗證了BITC是否通過另一內源性途徑誘導細胞凋亡。如Fig 11所示,內質網應激Ire1a基因、Atf 4基因、CHOP基因及蛋白表達均顯著升高(P<0.05),表明BITC也可通過內源性內質網應激途徑( endoplasmic reticulum stress,ERS)誘導U14細胞凋亡。

Fig 8 p53 signaling pathway diagram of BITC on U14 cells

Fig 9 Effect of BITC on expression of p53 and cell cycle related molecules

2.8.3腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)-叉頭轉錄因子O亞家族S(forkhead box O,FOXO)通路在BITC誘導的細胞周期阻滯和細胞凋亡中發揮重要作用 AMPK是細胞發育重要的調控因子。FOXO作為AMPK調控的下游轉錄因子,通過調控靶基因參與細胞死亡、存活以及多種信號轉導途徑,這些途徑對細胞增殖、凋亡、周期阻滯、分化等功能至關重要[8]。KEGG pathway分析表明,在BITC處理6 h 后,U14細胞參與FOXO通路的差異基因有31個(Fig 12),其中有20個基因表達上調,如AMPK基因,生長阻滯與DNA損傷基因(growth arrest and DNA damage inducible alpha,Gaadd45a),生長阻滯和DNA損傷誘導蛋白45 g(growth arrest and DNA damage inducible protein 45g,Gadd45g)基因。11個基因表達下調,如細胞信號轉導分子Smad3、p38,細胞周期蛋白B (Cyclin B)基因、細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase2,CDK2)基因。

我們進一步通過Western blot法檢測了FOXO通路相關基因的表達,發現AMPK,FOXO1a蛋白表達上調(Fig 13),推測AMPK-FOXO通路可能參與BITC誘導的細胞周期阻滯和細胞凋亡。

3 討論

ITCs是十字花科主要的次生代謝產物,定位于細胞質中,是由前體硫苷在體內黑芥子酶作用下水解而來,在植物受損時釋放,可阻止多環芳香烴、偶氮染料、亞硝胺等多種致癌物在嚙齒類動物中誘發的腫瘤生成。BITC不僅已證實是具有化學預防癌癥活性的ITC,且是一種在多種細胞模型中能夠降低細胞活性并誘導癌細胞凋亡的藥物[9]。然而,盡管該化合物的抗癌活性已在許多癌癥中驗證,但在宮頸癌中的作用及機制尚未闡明。

Fig 10 Apoptosis pathway of U14 cells induced by BITC

Fig 11 Effect of BITC on expression of endoplasmic reticulum stress related molecules

Fig 12 FOXO1a pathway of BITC on U14 cells

Fig 13 Western blot analysis of expression

**P<0.01vsControl group

本研究發現,BITC呈濃度和時間依賴性地抑制了小鼠宮頸癌U14細胞的增殖,其72 h作用的半致死劑量IC50已達到12.43 μmol·L-1。倒置顯微鏡觀察,隨著BITC藥物濃度的增加,U14細胞形態發生明顯變化,細胞數量急劇下降,表明BITC體外對U14具有較強的細胞毒性。

癌癥一大特征是癌細胞失控性增殖,其分子機制往往是細胞周期的紊亂引起癌細胞過度增殖[10]。當DNA發生損傷后,細胞周期會停滯在兩個關鍵的檢查點(G1/S和G2/M期),抑癌基因p53主要在G1期檢查點起作用。p53可以作為轉錄因子,誘導下游蛋白(p21、GADD45、Bax)產生,從而調控細胞周期或細胞凋亡[11],這取決于DNA損傷的程度以及細胞類型[12]。Xie等[13]發現,BITC能夠增加乳腺癌細胞中的p53磷酸化,而另一研究中相反,p53已被證明是人結腸細胞CCD-18Co中BITC抑制細胞增殖的負調節因子[14]。本研究中,采用PI單染流式分析發現BITC主要將U14細胞阻滯在G0/G1期;轉錄組數據及qRT-PCR和Western blot分析共同揭示p53信號通路參與細胞周期調控。

誘導癌細胞凋亡是許多抗癌藥物抑制癌細胞的主要機制[15]。細胞凋亡時細胞形態皺縮,細胞核染色質發生凝聚,晚凋時細胞核還會發生碎片化,并形成凋亡小體。Hochest 33258染色結果表明,BITC可誘導U14細胞核DNA凝聚,與BITC對卵巢癌OVCAR-3細胞相同的是[16],它們都能觀察到細胞核可見的顆粒狀熒光,初步推測其為凋亡小體。進一步通過流式細胞術檢測細胞凋亡率,分析發現BITC劑量依賴性地增加了細胞凋亡率,表明BITC誘導了細胞凋亡。這與轉錄組KEGG分析的結果相一致。

外源性死亡受體途徑和內源性途徑(包含線粒體途徑和內質網途徑)是細胞發生凋亡的主要途徑,這兩條途徑匯聚最終激活下游凋亡蛋白酶caspase從而引發凋亡。線粒體途徑主要受控于Bcl-2家族蛋白,通過促凋亡蛋白(Bax、Bak等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL等)的相互作用,從而對線粒體膜的通透性產生影響,繼而觸發凋亡釋放因子的釋放,由此激活上游凋亡起始子caspase-9,造成下游效應分子caspase-3、7被激活,通過切割相應的底物(lamin、actin、α-tublin、PARP等),最后引發細胞凋亡[17]。Western blot結果分析發現,BITC使促凋亡蛋白 Bax上調,而下調了抗凋亡蛋白Bcl-2表達的水平,引起了線粒體促凋亡信號CytC的釋放,將caspase-9激活之后,繼而激活了下游效應分子caspase-3。研究發現caspase-3和-7在細胞凋亡中具有重疊但不同的作用,二者具有細胞類型和刺激依賴性[15]。本研究中,BITC沒有激活caspase-7,表明caspase-3是BITC主要的線粒體凋亡依賴途徑。這一研究結果與另一異硫氰酸酯SFN在抗宮頸癌的作用機制類似[18]。此外,本研究中未檢測到經典凋亡通路下游切割底物cleave-PARP的表達,這可能與轉錄后翻譯、調控有關。

細胞在應對內質網錯誤折疊蛋白和鈣離子平衡紊亂時,會通過Ire1、PERK、ATF6通路啟動另一內源性凋亡途徑[19]。許多中草藥及其有效成分通過ERS通路發揮抗宮頸癌作用[20-22]。本研究中,對細胞凋亡通路富集的DEGs分析發現:內質網應激途徑Ire1α、ATF4、CHOP基因表達升高。進一步通過qRT-PCR和western blot驗證這些分子的表達,與預期結果相一致,提示ERS在BITC誘導的宮頸癌細胞凋亡中扮演者重要的角色。有趣的是SFN預處理經H2O2誘導的軟骨細胞,下調了GRP78、CHOP、Bax 和capase-3、Bcl-2水平,減少了ERS依賴性細胞凋亡[23]。BITC是否也在非癌細胞具有相同的保護作用,值得進一步研究。

AMPK是細胞全身能量穩態的中樞能量傳感器和調節器[24],一旦激活,AMPK可以促進分解代謝產生ATP,從而幫助細胞逃避死亡并導致耐藥性和轉移。然而,AMPK也與p53和LKB1等腫瘤抑制基因呈正相關[25],最新的研究證明AMPK的藥理激活能夠抑制各種癌細胞生長[26-27],但AMPK在癌癥中的雙重作用機制仍未闡明。FOXO1蛋白家族是一大類轉錄因子,參與或協同其他轉錄因子對靶基因進行轉錄調控,在哺乳動物中主要有四個亞型,其中FOXO1a轉錄因子被認為是一種腫瘤抑制因子,在抑制癌細胞增殖和誘導細胞凋亡方面發揮作用[28]。有研究表明,二甲雙胍通過激活AMPK-FOXO1a信號通路抑制雌激素依賴性的子宮內膜癌細胞生長[29]。用AICAR(5-氨基咪唑-4-甲酰胺1-β-D-呋喃核糖苷)和氨甲蝶呤聯合處理乳腺癌MCF-7細胞,發現二者通過激活AMPK和FOXO1a而阻滯MCF-7細胞周期并逆轉其Warburg代謝[30]。本研究中,KEGG分析發現FOXO1a通路是DEGs主要富集的通路,進一步通過Western blot 法檢測到AMPK及FOXO1a蛋白表達顯著增高,表明BITC可能通過調控AMPK-FOXO1a通路來誘導細胞凋亡或阻滯細胞周期,下一步尚需通過細胞模型和動物模型實驗驗證。

綜上,體外和轉錄組數據分析表明,BITC誘導了U14細胞周期阻滯,通過線粒體途徑和內質網途徑誘導細胞凋亡,這與p53信號通路、AMPK-FOXO1a通路密切相關。這些研究為BITC預防或治療宮頸癌提供了新的靶點。