外源性硫化氫對腎小球系膜細胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響及其機制

林真亭,田 華,李鴻珠

(1. 廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,福建 廈門 361023;2. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部,福建 廈門 361102)

腎小球系膜細胞是腎臟重要的固有細胞之一[1],位于腎小球毛細血管袢之間,鄰接內(nèi)皮細胞或基底膜,形態(tài)不規(guī)則,細胞突起可深至內(nèi)皮細胞和基底膜之間,具有維持系膜基質(zhì)穩(wěn)態(tài)和腎小球結(jié)構(gòu)、支撐毛細血管、調(diào)節(jié)濾過表面積,分泌腎素、吞噬壞死和凋亡細胞等重要作用[1-2]。因此,腎小球系膜細胞損傷對機體的危害非常大。

硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是繼一氧化碳和一氧化氮之后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子。生理濃度范圍的H2S在機體各個組織器官發(fā)揮重要的生物學(xué)作用,其發(fā)揮作用的靶點是調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子轉(zhuǎn)運、能量代謝、蛋白質(zhì)修飾等[3-5]。據(jù)報道,外源性H2S通過抑制氧化應(yīng)激和細胞凋亡減輕腎臟[6]損傷;同時,外源性H2S可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞增殖與遷移[7],也可減輕同型半胱氨酸誘導(dǎo)的系膜細胞凋亡和基質(zhì)重塑[8],但其與腎小球系膜細胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷的關(guān)系尚未見報道。本研究的目的是證實H2S可直接作用于腎小球系膜細胞,通過抑制氧化應(yīng)激,降低細胞凋亡,增加細胞存活率,從而增強腎小球系膜細胞拮抗H/R損傷的能力。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑小鼠腎小球系膜細胞系 SV40MES13 購自中國科學(xué)院上海細胞庫,硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)、PD98059(mitogen-activated protein kinase 1,ERK1/2 抑制劑)和7-azido-4-methylcoumarin購自美國Sigma公司,CCK8試劑盒和活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒、Western blotting相關(guān)試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)生化試劑盒購自南京建成生物工程研究所。CSE、 cleaved-caspase-3、Cytc、Bcl-2和β-acin抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,ERK1/2抗體購自美國 Cell Signaling 公司,DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國 Gibco 公司,其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 SV40MES13細胞培養(yǎng)、處理與分組SV40MES13細胞在含5% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中孵育,待其細胞密度達到60%～70% 時,將SV40MES13細胞放入自制的缺氧罐內(nèi),通入混合氣體(2% O2,5% CO2, 93% N2)2 h,再將細胞取出,放入培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h,復(fù)制H/R模型[9],記為缺氧/復(fù)氧(H/R)組。將正常培養(yǎng)的SV40MES13細胞記為對照(Control)組。在復(fù)氧過程中加入 100 μmol· L-1NaHS記為H/R+NaHS組。

1.3 CCK8試劑盒檢測細胞活力SV40MES13細胞以1×103個/孔均勻接種于96孔板,各組分別處理后,用無菌的PBS漂洗2次;每孔加入10 μL CCK-8工作液,在37 ℃ 恒溫箱中避光繼續(xù)培養(yǎng)2 h;將96孔板置于酶標(biāo)儀讀取570 nm波長的A值,計算并分析細胞活力。

1.4 Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡率細胞在發(fā)生凋亡時,其細胞膜的通透性會增強,且凋亡細胞的染色體 DNA 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生改變,使凋亡細胞內(nèi)染料相比正常的細胞染料多,更有效地與 DNA 結(jié)合,使藍色熒光明顯增強。具體操作是:各孔板中細胞分別處理后,用PBS 漂洗細胞3次,加入5 g· L-1的 Hoechst 33342 染液,37 ℃ 避光孵育 30 min;隨后在暗室中棄去染液,再用 PBS 漂洗3 次,并在每孔中加入500 μL PBS。在熒光顯微鏡下觀察并拍照,每組選取10個視野統(tǒng)計凋亡細胞的比率。

1.5 細胞內(nèi)ROS水平測定以1×106個/孔接種在12孔板中,并分別處理;PBS 洗滌3次,加入終濃度10 μmol· L-1的DCFH-DA溶液,37 ℃ 恒溫箱中避光孵育20 min;用不含血清 DMEM 的培養(yǎng)基清洗細胞3次,充分去除DCFH-DA染料;488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長的熒光顯微鏡進行拍照。細胞內(nèi)ROS將非熒光DCFH氧化成熒光DCF,熒光強度反映ROS水平。

1.6 細胞勻漿中SOD 活性和MDA含量測定將各組SV40MES13細胞用勻漿器研磨并制成 10% 的細胞勻漿液,用3 000 r·min-1離心 10 min 之后,取上清液,分別檢測SOD 活性和 MDA 含量。SOD測定采用羥胺法;MDA 測定采用 TBA法;步驟嚴(yán)格按照說明書要求進行。在紫外分光光度計上讀出吸光度值,按公式分別計算 SOD 活性和 MDA 含量。

1.7 探針7-azido-4-methylcoumarin(C-7Az)測量細胞H2S含量SV40MES13細胞接種于3.5 cm小型培養(yǎng)皿中,各組細胞分別用PBS緩沖液清洗2次,每次1 min左右。將細胞與含有50 μmol· L-1C-7Az的PBS于暗處常溫孵育30 min,孵育完成用PBS洗滌細胞3次,每次1 min。使用熒光顯微鏡觀察細胞中C-7Az對H2S的熒光響應(yīng)。

1.8 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達首先細胞中加入適量的RIPA裂解液,提取總蛋白,用BCA方法對提取的總蛋白進行定量。然后蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉后,加入一抗4 ℃ 過夜孵育。加入二抗室溫孵育1 h,滴加ECL試劑在PVDF膜上,使用ImageJ分析蛋白條帶灰度值,以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 SV40MES13細胞內(nèi)源性CSE/H2S系統(tǒng)變化與Control比較,H/R明顯降低CSE的蛋白表達和H2S產(chǎn)率(P<0.01);與H/R比較,H/R+NaHS顯著增加CSE的蛋白表達和H2S產(chǎn)率(P<0.01)(Fig 1)。這說明SV40MES13細胞H/R 損傷與內(nèi)源性CSE/H2S系統(tǒng)下調(diào)有關(guān),外源性H2S可上調(diào)CSE/H2S系統(tǒng)。

Fig 1 Change of H2S production and CSE protein expression in different groups (n=4)

2.2 SV40MES13細胞活力變化與Control組比較,H/R組細胞活力降低(P<0.01);與H/R組比較,H/R+NaHS組細胞活力顯著升高(P<0.01)(Fig 2)。這說明外源性H2S可逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的SV40MES13細胞活力下降。

Fig 2 Change of cell activity in different groups (n=8)

2.3 SV40MES13細胞氧化應(yīng)激變化與Control比較,H/R明顯升高ROS和MDA含量,降低SOD活性(P<0.01);與H/R比較,H/R+NaHS顯著逆轉(zhuǎn)了H/R對上述指標(biāo)的影響(P<0.01)(Fig 3)。這說明外源性H2S通過減少氧化應(yīng)激抑制SV40MES13細胞H/R損傷。

2.4 SV40MES13細胞凋亡相關(guān)指標(biāo)改變與Control組比較,H/R組細胞凋亡率促凋亡蛋白細胞色素 C(cytochrome c,Cyt c)和Cleaved caspase-3表達顯著增加(P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少(P<0.01)。與H/R組比較,H/R+NaHS組細胞凋亡率和促凋亡蛋白表達明顯減少(P<0.01),抑凋亡蛋白表達顯著增加(P<0.01)(Fig 4和5)。這說明外源性H2S通過減少細胞凋亡抑制SV40MES13細胞H/R損傷。

2.5 SV40MES13細胞ERK1/2通路變化與Control比較,H/R明顯降低磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)活性(P<0.01);與H/R比較,H/R+NaHS顯著增加p-ERK1/2活性,且PD98059 取消了NaHS的作用(P<0.01)。各組總ERK1/2(t-ERK1/2)活性保持不變(Fig 6)。這說明外源性H2S通過激活ERK1/2通路減少細胞凋亡和氧化應(yīng)激,從而抑制SV40MES13細胞H/R損傷。

Fig 3 Change of oxidative stress related indexes in different groups (n=5)

Fig 4 Change of apoptosis rate in different groups (n=8)

Fig 5 Changes of apoptosis-related protein expression in different groups (n=4)

Fig 6 Changes of ERK1/2 pathway in different groups of cells (n=4)

3 討論

缺血/再灌注過程中產(chǎn)生大量氧自由基、炎性細胞、鈣超載,進而促使細胞凋亡,H/R誘導(dǎo)的細胞損傷模型已被用于缺血/再灌注損傷的體外模型[10]。本實驗結(jié)果顯示,與Control組比較,H/R組細胞活力、SOD活性和抑凋亡蛋白(Bcl-2)表達明顯降低,而ROS和MDA含量、細胞凋亡率、促凋亡蛋白(Cyt c和Cleaved caspase-3)表達顯著增加。這說明H/R促進SV40MES13細胞發(fā)生氧化應(yīng)激和細胞凋亡,提示我們成功建立了腎小球系膜細胞H/R損傷模型。

長期以來,H2S被認為是一種污染環(huán)境的有毒氣體,但近年來研究發(fā)現(xiàn),生理濃度范圍內(nèi)的H2S通過抑制細胞增殖、炎癥反應(yīng)、細胞焦亡,調(diào)控凋亡、氧化應(yīng)激、mPTP 開放、離子通道及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等在心血管、神經(jīng)、消化、呼吸等系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[3-5,11-13]。據(jù)報道,外源性H2S可抑制心肌細胞H/R損傷,但其與腎小球系膜細胞H/R損傷的關(guān)系尚不清楚。

本實驗研究結(jié)果顯示,與Control比較,H/R明顯降低CSE蛋白表達和H2S產(chǎn)率;與H/R比較,H/R+NaHS顯著增加CSE蛋白表達和H2S產(chǎn)率。這說明腎小球系膜細胞H/R 損傷與內(nèi)源性CSE/H2S系統(tǒng)下調(diào)有關(guān),外源性H2S可上調(diào)CSE/H2S系統(tǒng)。

眾所周知,H/R誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生,使ROS生成增加。低濃度ROS對機體起到保護作用,過量的ROS促進脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物的生成,如丙二醛(MDA)[14]。MDA能夠損傷組織和細胞,并且MDA水平反映了ROS的損傷程度。體內(nèi)抗氧化劑可清除過量產(chǎn)生的ROS[14],如,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX),它們作為自由基清除劑,主要清除過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(OH·),從而減輕氧化應(yīng)激對細胞損傷[14-15]。

H/R可誘導(dǎo)細胞凋亡。當(dāng)H/R引起細胞損傷時,Cyt c從受損的線粒體中釋放出來。Cyt c 通過形成含有細胞色素c/Apaf-1/ caspase-9 的復(fù)雜凋亡體,觸發(fā)胞質(zhì)caspase-3活化,進而導(dǎo)致細胞凋亡。Bcl-2是一種有效的細胞凋亡抑制因子,可以抑制線粒體的破壞進而減少 Cyt c的漏出和抑制caspase的活化,最終抑制細胞凋亡[15]。

結(jié)果顯示,與Control組比較,H/R組細胞活力、SOD活性和抑凋亡蛋白(Bcl-2)表達明顯降低,而ROS和MDA含量、細胞凋亡率、促凋亡蛋白(Cyt c和cleaved-caspase-3)表達顯著增加。與H/R比較,H/R+NaHS逆轉(zhuǎn)了H/R對上述指標(biāo)的影響。這說明外源性H2S通過減少氧化應(yīng)激和細胞凋亡,從而抑制腎小球系膜細胞H/R損傷。

ERK1/2信號通路是絲裂原活化蛋白激酶的成員之一,是調(diào)控細胞生長、增殖、凋亡、炎癥、應(yīng)激等環(huán)節(jié)的重要通路[10]。當(dāng)ERK1/2 發(fā)生磷酸化活化時,磷酸化的 ERK1/2 一方面能夠使多種caspase 的表達受到抑制,進而阻礙細胞凋亡的發(fā)生,另一方面能夠使核因子表達受到抑制進而阻礙炎癥細胞因子的分泌及炎癥反應(yīng)的發(fā)生[16]。

本實驗結(jié)果顯示,與Control比較,H/R明顯降低p-ERK1/2活性;與H/R比較,H/R+NaHS顯著增加p-ERK1/2活性,且 ERK1/2抑制劑PD98059取消了NaHS的作用。各組t-ERK1/2活性保持不變。這說明外源性H2S通過激活ERK1/2通路減少氧化應(yīng)激和細胞凋亡,進而抑制腎小球系膜細胞H/R損傷。

綜上所述,本研究揭示了(1)腎小球系膜細胞H/R 損傷與內(nèi)源性CSE/H2S系統(tǒng)下調(diào)有關(guān);(2)外源性H2S通過上調(diào)ERK1/2通路減少氧化應(yīng)激和細胞凋亡,進而抑制腎小球系膜細胞H/R損傷(Fig 7)。這為缺血性腎臟疾病的防治提供了新思路和新靶點。

Fig 7 Mechanism of exogenous H2S inhibiting H/R injury in glomerular mesangial cells