射干制劑對失眠大鼠自主活動及TLR7/MyD88 信號通路的影響

黃 赫，趙文嘉，趙 磊，王若冰，包玉龍，范英蘭，張 瑜，張洪瀛，甘 雨，朱竟赫*

（1. 遼寧中醫藥大學附屬第二醫院醫學檢驗中心，沈陽 110034；2. 遼寧省中醫藥研究院中藥藥理室，沈陽 110034；3. 遼寧省中醫藥研究院實驗動物中心，沈陽 110034）

TLR（Toll-like receptor）是識別細菌、病毒等病原體的關鍵受體[1-2]。TLR7 是TLR 家族中識別單鏈病毒RNA（ssRNA）的關鍵成員[1-3]。TLR7 通過MyD88 依賴的途徑激活NF-κB，觸發趨化因子和炎癥細胞因子，并激活TGF-β 活化激酶1（TAK1）、IL-1 受體相關激酶（IRAK）和TNF 受體相關因子6（TRAF6）[4]。TLR7/MyD88信號通路既參與免疫調節，又能通過調節細胞因子調節睡眠功能。失眠屬于影響人類生理和心理健康的常見疾病，其病因可分為實證和虛證所致。中醫常采用實則瀉之，虛則補之的治則。射干具有瀉火、解毒、散血、消痰之功效，可對抗實證失眠。前期研究結果顯示，射干制劑具有戊巴比妥鈉協同作用等，然而其作用機制不十分明確。本研究從瀉火安神的角度，應用分子生物學、行為學測量系統、腦電圖技術和數理統計等手段與方法探討射干制劑對PCPA 所致失眠癥的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠，SPF 級，雌雄各半，體質量180 ～220 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。動物飼養于遼寧天一技術有限公司[動物使用許可證號：SYXK（遼）2020-0005]，環境溫度21 ～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2 藥物與試劑

射干提取物由遼寧中醫藥大學附屬第二醫院藥學實驗室提供，每粒膠囊含內容物0.30 g，1 g 內容物相當于0.33 g 提取物（批號：20200402）；朱砂安神丸由北京御生堂集團石家莊制藥有限公司提供（批號：141007）；地西泮片由上海上藥信誼藥廠有限公司生產（批號：1420060）。對氯苯丙氨酸（PCPA）由SIGMA 公司生產（批號：SHBD9168V）；動物組織總RNA 提取試劑盒（帶gDNA 清除柱）（貨號RE-03014）購自成都福際生物科技有限公司；羅氏SYBR GREEN 染料（貨號4913914001）購自羅氏公司。

1.3 儀器設備

EthoVision 大小鼠行為學系統，由NOLUDS公司提供；JJ2000B 電子天平，由江蘇常熟雙杰電子天平有限公司生產；PL83-S 型天平，由梅特勒-托利多儀器有限公司生產；TD5A-WS 臺式離心機，由長沙湘儀離心機儀器有限公司生產；羅氏LightCycler480 實時定量PCR儀，由Roche公司生產；Thermo Scientific 臺式高速冷凍離心機，由Thermo Scientific 公司生產。

1.4 射干提取物對大鼠自主活動的影響

各組在連續給藥7 d，末次給藥 1 h 后，放于自主活動箱內，攝像頭記錄其10 min 內自主活動錄像，用75%酒精消毒除去自主活動箱內前1 個大鼠留下的氣味，使各組之間不相互干擾，屋內保持安靜。應用EthoVision 大小鼠行為學系統比較空白組、模型對照組、射干低劑量組、射干中劑量組、射干高劑量組、朱砂安神丸組、地西泮組的實驗行為學指標，包括移動距離、移動時間、中心區頻率等。

1.5 試劑盒提取大鼠腦組織mRNA

取新鮮組織每20 mg 左右加入500 μL Buffer RL1，使用玻璃勻漿器將組織研磨均勻；將研磨均勻的勻漿液轉移至DNA 清洗柱（DNA-cleaning column）中，12 000 r·min-1（13 400×g）離心 2 min。移除DNA-Cleaning Column，保留收集管內上清液；向上述上清液（體積應約為 500 μL）中加入1.6倍體積 Buffer RL2（使用前請確認已按照說明加入無水乙醇），輕柔混勻；將700 μL 混合液轉移至RNA-only Column 中（純化柱放入收集管中），12 000 r·min-1（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液；將純化柱放回收集管中，將剩余混合液全部加入純化柱中，12 000 r·min-1（13 400×g），離心1 min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入500 μL Buffer RW1，12 000 r·min-1（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入700 μL Buffer RW2（使用前請確認已按照說明加入無水乙醇），12 000 r·min-1（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液，重復1 次；將純化柱放回收集管中，12 000 r·min-1（13 400×g）空管離心2 min，去掉離心柱中殘余的 Buffer RW2；將純化柱轉移至新的離心管中，向純化柱的膜中央滴加50 μL 已于65 ℃預熱的RNase-Free ddH2O（切勿將洗脫液添加到壓圈上，否則會損失較大體積的洗脫液），室溫放置2 min。12 000 r·min-1（13 400×g）離心1 min，收集RNA 溶液。為提高RNA產量，可將離心得到的 RNA 溶液重新加至純化柱中，重復步驟1 次。

1.6 mRNA 反轉錄為cDNA 反應

5×PrimeScript Buffer（for Real Time）2.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL， Oligo dT Prime（50 μM）0.5 μL， Random 6 mers（100 μM）0.5 μL，Total RNA5 μL，RNase-Free ddH2O 1.5 μL，37℃15 min，85 ℃sec，4℃ +∞。

1.7 實時定量PCR 反應

FastStart Universal SYBR Green Master 25 μL，上游引物（10 μM）1.5 μL，下游引物（10 μM）1.5 μL，ddH2O 17 μL，cDNA 5 μL；50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 cycles。利用各組目的基因的CT 值，以β-actin 為內參，用2-ΔΔCT 法計算各組目的基因的相對表達量。引物序列：RAT TLR7F：GGAAACTGCCCTCGATGTT；RAT TLR7R：CCTGGAGGTTGCTCATGTT；RAT MYD88F：GAAGCGACTGATCCCTATCAAG；RAT MYD88R：CAAGTCAGCTCATCTTCCTCTC；RAT ACTINF：TCCCTGGAGAAGAGCTATGAG；RAT ACTINR：TCCATACCCAGGAAGGAAG。

1.8 射干制劑對PCPA 致失眠大鼠腦電波的影響

經前期處理后的各組大鼠于第4 天開始給藥，其中空白對照組給予同體積蒸餾水，持續給藥7 d，在第6天經腹腔注射戊巴比妥鈉建立失眠大鼠模型。末次給藥后，無線電遙測系統技術記錄戊巴比妥鈉致失眠大鼠1 h 的腦電活動，應用腦電信號分析睡眠時相并計算各組大鼠α 波百分比、β 波百分比、θ波百分比和δ 波百分比。

1.9 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統計學處理，計量結果符合正態分布，數據用均數±標準差（±s）表示，不同時間點比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 射干制劑對大鼠行為學指標的影響

見表1、圖1。

圖1 各組熱區圖圖像

表1 射干制劑對大鼠自主活動的影響（±s ，n = 10）

表1 射干制劑對大鼠自主活動的影響（±s ，n = 10）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別移動距離/cm移動速度/（cm·s-1）中心區頻率/次 中心區累計持續時間/s 中心區第一次潛伏期/s空白對照組1 958.27±849.37 3.26±1.39 3.47±2.9011.59±20.66 75.13±51.38模型對照組5 521.87±3 038.21## 9.18±5.11##23.88±12.79##12.12±15.23 37.36±28.18射干制劑低劑量組 3 810.76±1 787.42 6.43±3.0219.82±17.55 8.66±14.13 98.80±89.28射干制劑中劑量組 5 789.93±1 977.4310.02±3.9036.73±18.8715.88±17.83 86.91±92.87射干制劑高劑量組 3 272.63±793.58△ 5.42±1.59△12.39±6.02△20.53±24.16106.17±138.05朱砂安神丸組3 083.57±675.58△ 5.22±1.73△ 5.03±6.12△△10.05±16.02181.45±166.22△地西泮片組3 137.83±762.13△ 5.53±1.08△10.02±6.24△23.78±15.25 67.35±60.23

1.1 射干制劑對大鼠腦組織TLR7、MyD88 mRNA表達的影響

見表2。

表2 射干制劑對大鼠腦組織TLR7、MyD88 mRNA 表達的影響（±s，n = 10）

表2 射干制劑對大鼠腦組織TLR7、MyD88 mRNA 表達的影響（±s，n = 10）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

My D88 基因相對表達量空白對照組3.47±0.27 0.51±0.13模型對照組6.39±0.66 ##1.17±0.32 ##射干制劑低劑量組6.10±0.28△ 1.02±0.25△射干制劑中劑量組5.91±0.35△ 0.95±0.51△射干制劑高劑量組5.81±0.38△△0.83±0.18△△朱砂安神丸組4.11±0.62△△0.80±0.31△△地西泮片組3.84±0.16△△0.77±0.17△△組別TLR7 基因相對表達量

2.3 射干制劑對大鼠腦電波百分比的影響

見表3。

表3 射干制劑對大鼠腦電波百分比的影響（±s ，n = 10）

表3 射干制劑對大鼠腦電波百分比的影響（±s ，n = 10）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05；與模型對照組比較，△P ＜0.05

組別時間點/minδ 波/%θ 波/%α 波/%β 波/%空白對照組600.59±0.700.38±0.240.88±0.481.51±0.74模型對照組600.65±0.36#0.62±0.301.51±0.603.10±1.59射干制劑低劑量組600.91±0.53△0.59±0.211.42±1.572.71±0.89射干制劑中劑量組601.09±0.79△0.65±0.301.42±0.693.13±1.58射干制劑高劑量組600.68±0.810.60±0.311.12±0.482.67±1.13朱砂安神丸組601.49±1.43△0.58±0.311.47±0.652.53±0.92地西泮片組601.25±0.89△0.71±1.431.88±1.103.81±2.75

3 討論

失眠的特征是難以開始睡眠、維持睡眠或清晨醒來，并伴有日間睡眠障礙。越來越多的證據[5-8]表明，失眠與一系列負面的健康后果相關，如精神障礙、心血管功能障礙、2型糖尿病和肥胖型等多因素相關。射干的散血、消痰之功效，可對抗實證失眠。本研究利用PCPA 誘導的大鼠模型，探討射干制劑對失眠的改善作用和分子機制。PCPA 造模后大鼠興奮度增高、白天活動量大，提示造模成功。Etho Vision大小鼠行為學系統詳細病理方面尚不清楚[9]。本次自主活動結果和熱區圖圖像結果顯示，射干制劑組、朱砂安神丸組及地西泮片組自主活動減少、興奮性受到抑制、睡眠/覺醒周期得到調節。朱砂安神丸組在中心區第一次潛伏期增多，與朱砂安神丸有顯著的安神效果相符合。

Toll樣受體（TLRs）是一種重要的模式識別受體，它可以識別病原體特定分子群中的高階結構模式。除了免疫之外，不同的TLR 和TLR 相關信號分子被認為有助于哺乳動物中樞神經系統的發育和可塑性[10]。MyD88 是一種在細胞內傳遞或橋接TLR介導的信號的適配器分子。MyD88 對于TLRs 配體觸發的細胞內級聯反應至關重要，它釋放促炎細胞因子、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、IL-1β 和其他促炎因子，如一氧化氮、環氧合酶、前列腺素E2 和三磷酸腺苷，其中大多數已被發現調節睡眠/覺醒周期時間[11]。據報道[1]，有些中藥通過調節TLR7/MyD88 信號通路抑制炎癥反應而發揮對流感病毒引起的急性肺損傷的體內保護作用。此外，TLR7/MyD88 信號通路也由于其免疫調節作用而作為SLE 的治療靶點[12]。敲除多個TLRs 和信號因子的實驗[13]證明了TLR7 在SARSCoV-2 感染誘導的炎癥信號中至關重要。TLR7/MyD88 信號通路在炎癥反應和免疫調節方面發揮重要作用。綜上所述，TLR7/MyD88 信號通路可能在調節失眠大鼠睡眠/覺醒周期方面有著重要意義。

本研究實時定量PCR 結果顯示，模型對照組與空白對照組相比，腦組織TLR7、My D88 相對表達量顯著升高，說明造模成功；同模型對照組相比，射干制劑低劑量組、射干制劑中劑量組TLR7、MyD88 mRNA 表達量均降低（P＜0.05），其中射干制劑高劑量組TLR7、 MyD88 的mRNA 表達量顯著降低（P＜0.01），推測無論是射干制劑、朱砂安神丸還是地西泮可能通過調節TLR7、MyD88 mRNA 表達從而改善睡眠，其中射干制劑高劑量組改善大鼠睡眠的改善最明顯。大鼠腦電圖結果顯示，低中劑量的射干制劑、朱砂安神丸和地西泮片可能是通過增加腦電圖δ 波百分比以改善大鼠睡眠。

綜上所述，射干制劑可調節失眠大鼠的睡眠/覺醒周期和增加腦電圖δ 波百分比來改善睡眠；且此作用可能是通過調節腦組織TLR7、MyD88 基因的表達發揮作用，其中射干制劑高劑量組療效最好。探討射干制劑的抗失眠藥效作用機制可初步闡明其所調控的網絡，以期找到明確藥效對應的作用靶點，為抗失眠新藥研發提供支撐。