乳制品中γ-氨基丁酸含量的測定

陳盛

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中樞神經系統中非常重要的活性物質，具有多種生理功能。γ-氨基丁酸是中樞神經系統的一種抑制性神經遞質，在調節神經元興奮度上起著重要作用，具有安神、降血壓、改善肝腎功能、促進睡眠、緩解焦慮、抗抑郁等多種生理功效。

現有的食品中，γ-氨基丁酸檢測的手段主要有酶法、比色法、液相色譜法及液相色譜-串聯質譜法。其中，高效液相色譜法因高準確度、高靈敏度等優勢應用較為廣泛，但是由于γ-氨基丁酸對紫外、可見光不靈敏，必須被衍生化后加上發光基團后才能被高效液相色譜的紫外或熒光檢測器檢測到，其衍生產物并不穩定，對檢測結果影響較大。

本研究建立了使用氨基酸分析儀檢測乳與乳制品中γ-氨基丁酸含量的方法，其利用γ-氨基丁酸水溶性的特點，經鹽酸水解后，經離子交換柱層析分離，與茚三酮溶液產生顯色反應，用標準曲線法定量檢測出其含量。整個操作過程快速簡單，不需要額外衍生，提取效率高，適合乳與乳制品中γ-氨基丁酸含量的測定。

1.實驗部分

1.1試劑和材料

1.1.1試劑

鹽酸（HCl）：濃度≥36%，優級純。

氫氧化鈉（NaOH）：優級純。

檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）：優級純。

苯酚（C6H5OH）：優級純。

檸檬酸三鈉（二水）：優級純。

硼酸：優級純。

醋酸鈉：優級純。

醋酸鉀：優級純。

冰乙酸：優級純。

茚三酮：優級純。

1.1.2試劑配制

鹽酸溶液（6mol/L）：取500mL 鹽酸加水稀釋至1000mL，混勻。

NaoH溶液：稱取50gNaoH，溶于50mL 水中，用水定容至100mL后混勻備用。

檸檬酸鈉緩沖溶液：稱取19.6g檸檬酸鈉加水溶解，后加入16.5mL鹽酸，用水定容至1000mL，用鹽酸溶液調節pH至2.2。

1.1.3氨基酸分析儀上所使用溶液配制

緩沖液Buffer A：取11.8g檸檬酸三鈉+6.0g檸檬酸+0.5g苯酚溶于水中，加入濃鹽酸6.5mL、甲醇65mL，混勻后用HCl溶液和NaOH溶液調pH值到3.45，最后定容至1L，過膜待用（0.45μm）。

緩沖液Buffer B：取19.6g檸檬酸三鈉+5.0g硼酸+3.1g氫氧化鈉溶于水中，混勻后用HCl溶液和NaOH溶液調pH值到10.85，最后定容至1L，過膜待用（0.45μm）。

4mol鉀/鈉醋酸緩沖液（pH 5.51）：取272.0g三水醋酸鈉、196.0g醋酸鉀，加入500mL水及200mL乙酸溶解。混合均勻，用乙酸調pH值到5.51后，定容至1L，過膜待用（0.45μm）。

茚三酮衍生溶液：取20g茚三酮+600mL、甲醇+2g苯酚攪拌溶解；加入400mL 4mol鉀/鈉醋酸緩沖液混合均勻，定容至1L儲備液待用；最后向溶液中加入還原劑，充入氮氣2分鐘。

清洗溶液：600mL異丙醇與400mL去離子水混合。

1.2標準溶液配制

標準品 ：γ-氨基丁酸標準品，天津埃爾塔公司。

標準儲備液：分別稱取 0.0100g 標準品（4.3）置于10.0mL 棕色容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，標準儲備液濃度為1.0mg/mL，4oC冰箱中保存，有效期3個月。

標準工作液：分別取各標準儲備液（4.4.1）1.0mL至10.0mL 棕色容量瓶中，用水定容至刻度，此標準工作液濃度為100μg/mL，4oC冰箱中保存，有效期1個月。

1.3儀器和設備

氨基酸分析儀：賽卡姆（北京）科學儀器有限公司。電子天平：BP211D，Sartorius公司。

漩渦混合器——TALBOYS（上海安譜科學儀器有限公司）；氮吹儀（上海安譜科學儀器有限公司）；鼓風干燥箱（上海安譜科學儀器有限公司）。

1.4分析步驟

1.4.1樣品前處理

稱取試樣1g（精確到0.0001g）置于水解瓶中，加入10mL6mol/L 鹽酸溶液（1.2.1），并加入3-4滴苯酚。將水解瓶放入冰箱冷凍室內，冷凍約3min-5min后，抽真空后充入氮氣（重復抽真空-充入氮氣3次），在充氮氣狀態下擰緊螺絲蓋。將水解瓶置于110℃±1℃的鼓風干燥箱內，水解22h后，取出后冷卻至室溫。

打開水解瓶，將水解液過濾至50mL離心管中。準確吸取1.0mL濾液移入15mL玻璃試管中，用試氮吹儀在40℃-50℃水浴中下吹干。

加入1.0mL pH2.2檸檬酸鈉緩沖溶液到15mL試管內溶解殘渣，振蕩混勻后，吸取溶液過膜待用（0.22μm）。

1.5測定條件

1.5.1 氨基酸分析儀條件

色譜柱： LCA K06/Na柱。

流動相：檸檬酸鈉A=0.12N，pH 3.45；B=0.2N，pH10.85。

流速：洗脫泵 0.45mL/min+衍生泵 0.25mL/min。

柱溫：58℃-70℃梯度控溫。

進樣體積：50μL。

檢測波長：440nm及570nm。

壓力：30bar-40bar 。

1.6標準曲線的制作

準確移取適量標準工作液，用水定容，再得到濃度分別為：50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L的標準溶液。將標準系列溶液注入氨基酸分析儀，得到各組分的色譜圖和峰面積。以目標化合物的濃度為橫坐標，以目標化合物的峰面積為縱坐標，繪制工作曲線。

2.結果與分析

2.1線性關系

在濃度為50-2000μg/L，γ-氨基丁酸的峰面積與其濃度呈良好的線性關系，線性方程 y=0.8701x+2.1092，R2=1。具體見表1、圖1。

2.2儀器精密度

配制濃度為1μg/mL的γ-氨基丁酸標準工作溶液，連續進樣6次，其峰面積相對標準偏差為0.88%。其結果見表2、圖2。

2.3 檢出限和定量限

根據γ-氨基丁酸標準溶液的峰面積計算，當信噪比（S/N）為3時，測得儀器的檢出濃度為50μg/L，得到方法的檢測限為0.5mg/kg；方法的定量限則為1.5mg/kg。

2.4回收率、精密度及空白試驗

以純牛奶及奶酪為空白樣品，分別在樣品中添加γ-氨基丁酸標準溶液進行回收試驗，添加濃度分別為50、100、200mg/kg， 每個濃度3個平行。結果見表3。

3.小結與討論

本文實驗結果表明，氨基酸分析儀可以用于乳與乳制品中γ-氨基丁酸含量的測定。該方法比高效液相色譜法減少了手動衍生的步驟，可直接進行測定，操作簡單，節省時間，同時衍生產物較高效液相色譜法穩定。用氨基酸分析儀測量乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量的方法簡單快速，在濃度為50-2000μg/L，γ-氨基丁酸的峰面積與其濃度呈良好的線性關系。該方法豐富了乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量的測定方法，可為研究乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量提供技術參考。