藏紅花素抑制音猬因子信號通路對結(jié)直腸癌細胞惡性生物學行為的影響

高晶晶，孫志濤，姜輝，張寶玉，肖偉，周國慶，宋東旭，張亞玲，馬紅艷

作者單位：滄州市人民醫(yī)院，a胃腸外科，b肛腸外科，c神經(jīng)外科，d病理科，河北 滄州 061000

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)常見的癌癥之一，也是癌癥患者死亡的第二大原因。雖然早期篩查、手術切除、輔助化療、放療、靶向治療等治療方案降低了結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率。但部分病人治療效果不甚理想，甚至存在高復發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率以及高耐藥率等不良情況［1-2］。因此，迫切需要探索新的治療策略。許多研究試圖通過將已批準的藥物與天然化合物結(jié)合來改善治療，并建立以天然化合物為基礎的治療方案［3］。藏紅花素是研究最多的天然化合物之一，其為藏紅花的主要活性成分，是一種水溶性類胡蘿卜素。研究表明藏紅花素具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化和抗抑郁等［4-5］。在最近的幾年中，藏紅花素也被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性，可抑制包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的進展［6-7］。但關于藏紅花素的抗癌作用機制目前仍不十分清楚。音猬因子（sonic hedgehog，Shh）信號通路是Hedgehog 信號通路之一，參與細胞分化、增殖、凋亡等生命過程，該通路的異常激活是促進結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素［8］。基于上述內(nèi)容，2021年1月至2022年7月進行本研究，旨在通過體外培養(yǎng)人結(jié)直腸癌細胞SW620，觀察藏紅花素對SW620 細胞惡性生物學行為的影響，并探究抑制Shh信號通路作為其藥理機制的可能性。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑、儀器ATCC 來源人結(jié)腸癌細胞SW620（上海晶抗生物工程公司，貨號JKCS0045）；藏紅花素（上海玉博生物科技公司，貨號ES-0329）；Shh 通路激活劑Purmorphamine（MedChemExpress 公司，貨號HY-15108）；Leibovitz's L-15 培養(yǎng)基（江蘇凱基生物公司，貨號KGM41300）；Annexin V-FITC/PI 試劑盒（北京百奧萊博科技公司，貨號HR0399）；0.1%結(jié)晶紫染液（北京Solarbio 公司，貨號G1063）；CCK-8 試劑、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（上海碧云天生物公司，貨號C0038、P0013B、P0012）；兔源一抗anti-Shh、anti-平滑蛋白（Smoothened，Smo）、anti-神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關癌基因-1（Gliomaassociated oncogene-1，Gli-1）（Abcam 公司，貨號ab53281、ab235183、ab134906）；兔源一抗anti-GAPDH、山羊抗兔二抗（沈陽萬類生物公司，貨號WL01114、WLA023）。HERAcell 240i 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；iMark680 多功能酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)SW620 細胞采用添加10%FBS 的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、無二氧化碳的培養(yǎng)箱中，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 CCK-8 實驗、克隆形成實驗檢測SW620 細胞增殖情況CCK-8 實驗：將SW620 細胞以5×103個/孔接種至96孔板，待貼壁后添加不同劑量藏紅花素（5、10、20、40、60、80 mg/L）處理細胞24 h；另用濃度為10、20、40 mg/L 的藏紅花素處理細胞，作為藏紅花素L/M/H 組［9］、40 mg/L 藏紅花素+1 μmol/L Purmorphamine［10］（藏紅花素H+Shh通路激活劑組）、Shh通路激活劑組（1 μmol/L Purmorphamine），另設置正常培養(yǎng)的對照（Control）組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。而后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育2 h，通過Multiskan SkyHigh 酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度（OD）。細胞活力與OD450成正比。

克隆形成實驗：將SW620 細胞以1×103個/孔接種至6 孔板，待貼壁后分組處理同上，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。而后每孔加入4%多聚甲醛固定20 min，棄固定液后加入0.1%結(jié)晶紫染色10 min，于顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞的克隆形成數(shù)。

1.4 劃痕愈合實驗檢測SW620 細胞遷移能力將

SW620 細胞以5×104個/孔接種至24 孔板，待貼壁后棄去培養(yǎng)基，用100 μL 槍頭于孔中間豎著劃一條直線，PBS 清洗去除劃下的細胞，添加培養(yǎng)基（分組處理同1.3）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于顯微鏡下拍照，經(jīng)Image J軟件計算劃痕面積愈合率。

1.5 Transwell 實驗檢測SW620 細胞侵襲能力將SW620 細胞用不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基重懸（1×105個/mL），取100 μL 接種至預先包被Matrigel 的Transwell 小室中，24 孔板中加入600 μL 含10%FBS 的培養(yǎng)基，孵育24 h，而后取出Transwell 小室，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，用棉簽拭去上表面的細胞，PBS清洗、晾干后經(jīng)0.1%結(jié)晶紫染色10 min，于顯微鏡下計數(shù)侵襲細胞數(shù)量。

1.6 Flow Cytometry 檢測SW620 細胞凋亡情況將SW620 細胞以5×104個/孔接種至24 孔板，待貼壁后分組處理同1.3，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞。計數(shù)后轉(zhuǎn)移至流式管中（2×105個/100 μL），每管加入5μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，4 ℃孵育15 min，借助BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測SW620 細胞中Shh 信號通路相關蛋白表達SW620細胞接種及處理同“1.6”，向收集的細胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定濃度，2×loading buffer 定量后進行熱變性處理，利用凝膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃孵育兔源一抗anti-Shh、anti-Smo、anti-Gli-1、anti-GAPDH（過夜），次日室溫孵育山羊抗兔二抗2 h，滴加ECL 發(fā)光液后置于GelSMART 凝膠成像儀中拍照，經(jīng)Image J軟件進行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0 進行分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較行One-way ANOVA 檢驗，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 激活Shh 通路對SW620 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響與對照組相比，Shh 通路激活劑組SW620 細胞活力升高（t=3.65，P=0.011），克隆形成數(shù)（t=2.66，P=0.038）、劃痕面積愈合率（t=3.77，P=0.009）、侵襲數(shù)（t=2.72，P=0.035）、Shh（t=3.32，P=0.016）、Smo（t=3.01，P=0.022）、Gli-1 蛋白表達（t=4.74，P=0.003）增加，細胞凋亡率減少（t=9.54，P＜0.001）。見圖1，表1。

表1 激活Shh通路對SW620細胞殖、遷移、侵襲、凋亡和Shh通路相關蛋白表達的影響/± s

表1 激活Shh通路對SW620細胞殖、遷移、侵襲、凋亡和Shh通路相關蛋白表達的影響/± s

注：Shh為音猬因子，Smo為平滑蛋白，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

組別對照組Shh通路激活劑t值P值Gli-1/GAPDH 0.98±0.07 1.25±0.09 4.74 0.003重復次數(shù)4 4細胞活力/D（λ）1.50±0.13 1.89±0.17 3.65 0.011克隆形成數(shù)/個124.75±10.39 145.12±11.26 2.66 0.038劃痕面積愈合率/%60.58±5.29 75.94±6.20 3.77 0.009侵襲數(shù)/個214.59±10.62 239.76±15.18 2.72 0.035凋亡率/%12.85±1.16 6.02±0.84 9.54＜0.001 Shh/GAPDH 1.27±0.08 1.47±0.09 3.32 0.016 Smo/GAPDH 1.15±0.09 1.38±0.12 3.01 0.022

圖1 激活Shh通路對SW620細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和Shh通路相關蛋白表達的影響:A為細胞克隆形成實驗；B為細胞遷移能力（劃痕愈合實驗）；C為細胞侵襲能力（Transwell實驗）；D為細胞凋亡（流式細胞術）

2.2 藏紅花素對SW620 細胞的細胞毒性作用CCK-8結(jié)果顯示，使用10、20、40、60、80 mg/L的藏紅花素分別處理SW620 細胞24 h 后，藏紅花素以劑量依賴性方式降低SW620細胞活力，見表2。經(jīng)計算，藏紅花素對SW620 細胞的IC50值接近40 mg/L，因此，選用10、20、40 mg/L 的藏紅花素處理細胞進行后續(xù)實驗。

表2 藏紅花素對SW620細胞的細胞毒性作用/± s

表2 藏紅花素對SW620細胞的細胞毒性作用/± s

注：①與0 mg/L藏紅花素相比，P＜0.05。

藏紅花素濃度0 mg/L 5 mg/L 10 mg/L 20 mg/L 40 mg/L 60 mg/L 80 mg/L F值P值細胞活力/%100.00±0.00 97.24±6.10 80.93±6.57①62.62±6.04①51.45±5.33①40.28±5.19①27.90±3.25①121.73＜0.001重復次數(shù)4 4 4 4 4 4 4

2.3 藏紅花素對SW620 細胞增殖能力的影響與對照組相比，藏紅花素L 組、藏紅花素M 組、藏紅花素H 組SW620 細胞活力下降，克隆形成數(shù)減少（P＜0.05）；與藏紅花素H 組相比，藏紅花素H+Shh 通路激活劑組SW620 細胞活力升高，克隆形成數(shù)增加（P＜0.05）。見圖2，表3。

表3 各組SW620細胞增殖情況/± s

表3 各組SW620細胞增殖情況/± s

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與藏紅花素H組相比，P＜0.05。

組別對照組藏紅花素L組藏紅花素M組藏紅花素H組藏紅花素H+Shh通路激活劑組F值P值重復次數(shù)4 4 4 4 4細胞活力/D（λ）1.58±0.14 1.27±0.12①0.96±0.11①0.61±0.08①1.05±0.12②克隆形成數(shù)/個128.45±10.73 102.28±9.41①71.45±6.52①48.61±5.39①83.14±6.35②58.34＜0.001 38.92＜0.001

圖2 克隆形成實驗檢測SW620細胞增殖：A為對照組;B為藏紅花素L組;C為藏紅花素M組;D為藏紅花素H組;E為藏紅花素H+Shh通路激活劑組

2.4 藏紅花素對SW620 細胞遷移、侵襲能力的影響與對照組相比，藏紅花素L 組、藏紅花素M 組、藏紅花素H 組SW620 細胞劃痕面積愈合率、侵襲數(shù)減少（P＜0.05）；與藏紅花素H 組相比，藏紅花素H+Shh 通路激活劑組SW620 細胞劃痕面積愈合率、侵襲數(shù)增加（P＜0.05）。見圖3，4；表4。

表4 各組SW620細胞遷移、侵襲情況/± s

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與藏紅花素H組相比，P＜0.05。

組別對照組藏紅花素L組藏紅花素M組藏紅花素H組藏紅花素H+Shh通路激活劑組F值P值重復次數(shù)4 4 4 4 4劃痕面積愈合率/%61.37±5.12 49.26±5.48①37.19±4.63①27.62±3.25①40.59±3.92②侵襲數(shù)/個218.73±13.28 174.52±11.36①133.68±10.15①75.94±8.29①146.25±11.24②91.88＜0.001 31.49＜0.001

圖3 劃痕愈合實驗檢測SW620細胞遷移能力（×100）

2.5 藏紅花素對SW620 細胞凋亡的影響與對照組相比，藏紅花素L 組、藏紅花素M 組、藏紅花素H組SW620 細胞凋亡率增加（P＜0.05）；與藏紅花素H組相比，藏紅花素H+Shh 通路激活劑組SW620 細胞凋亡率減少（P＜0.05）。見圖5，表5。

表5 各組SW620細胞凋亡情況/± s

表5 各組SW620細胞凋亡情況/± s

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與藏紅花素H組相比，P＜0.05。

組別對照組藏紅花素L組藏紅花素M組藏紅花素H組藏紅花素H+Shh通路激活劑組F值P值凋亡率/%13.56±1.22 20.49±1.53①31.62±1.85①45.39±2.17①27.43±1.61②199.38＜0.001重復次數(shù)4 4 4 4 4

圖5 流式細胞儀檢測SW620細胞凋亡：A為對照組;B為藏紅花素L組;C為藏紅花素M組;D為藏紅花素H組;E為藏紅花素H+Shh通路激活劑組

2.6 藏紅花素對SW620 細胞中Shh 信號通路相關蛋白表達的影響與對照組相比，藏紅花素L組、藏紅花素M組、藏紅花素H組SW620細胞中Shh、Smo、Gli-1 蛋白表達減少（P＜0.05）；與藏紅花素H 組相比，藏紅花素H+Shh 通路激活劑組SW620 細胞中Shh、Smo、Gli-1 蛋白表達增加（P＜0.05）。見圖6，表6。

表6 各組SW620細胞中Shh信號通路相關蛋白表達情況/± s

表6 各組SW620細胞中Shh信號通路相關蛋白表達情況/± s

注：Shh為音猬因子，Smo為平滑蛋白，Gli-1為神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關癌基因-1，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。①與對照組相比，P＜0.05。②與藏紅花素H組相比，P＜0.05。

組別對照組藏紅花素L組藏紅花素M組藏紅花素H組藏紅花素H+Shh通路激活劑組F值P值Gli-1/GAPDH 0.96±0.11 0.76±0.09①0.61±0.09①0.37±0.06①0.70±0.08②24.31＜0.001重復次數(shù)4 4 4 4 4 Shh/GAPDH 1.32±0.14 1.07±0.12①0.85±0.11①0.52±0.08①0.84±0.08 30.03＜0.001 Smo/GAPDH 1.19±0.12 0.96±0.11①0.72±0.08①0.43±0.06①0.81±0.09②35.73＜0.001

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測SW620細胞中Shh信號通路相關蛋白表達

3 討論

目前，手術與化療相結(jié)合是結(jié)直腸癌的主要治療方法，但結(jié)直腸癌病人接受該治療方法后復發(fā)率仍在50%左右［11-12］。此外，傳統(tǒng)細胞毒性化療藥物在殺滅腫瘤細胞的同時，對正常細胞也會產(chǎn)生嚴重不良反應［13］。因此，有必要開發(fā)新型抑制結(jié)直腸癌進展的藥物。

天然化合物因其副作用小、成本低的優(yōu)勢而成為腫瘤治療領域的熱點［14-15］。藏紅花素為有前景的天然產(chǎn)物之一，近年來其抗癌活性受到廣泛關注，可抑制胃癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌等諸多癌癥的惡性進展［16-18］。Teng 等［19］報道，藏紅花素能明顯抑制ApcMinC/Gpt 結(jié)直腸癌小鼠的腫瘤生長，改善結(jié)腸組織的病理改變，同時體外功能實驗表明藏紅花素可誘導結(jié)直腸癌細胞周期阻滯，提高細胞凋亡率。Güllü 等［20］報道藏紅花素不僅可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖，還可抑制其遷移。在本研究中，我們觀察到SW620 細胞經(jīng)不同劑量藏紅花素處理后，細胞活力下降，克隆形成數(shù)、劃痕面積愈合率、侵襲數(shù)均減少，凋亡率增加，且存在劑量-效應關系，表明藏紅花素能夠抑制SW620 細胞增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡，與既往研究一致。

Shh 信號通路是調(diào)控腫瘤細胞惡性生物學行為的重要通路，激活Shh 信號通路可促進結(jié)腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制Shh 信號通路可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲［21-22］。Shh信號通路由Shh、碎片蛋白（Patched，Ptch）、Smo 和Gli 等蛋白構成，Gli為該通路的下游轉(zhuǎn)錄因子，當Shh 信號通路處于靜息狀態(tài)時，Ptch 與Smo結(jié)合以抑制Smo的活性，從而抑制Gli 激活；當Shh 信號激活時，Shh 與Ptch 結(jié)合，改變Ptch 的空間構象，解除Ptch 對Smo 的抑制作用，使Smo得到解離，進而激活Gli，調(diào)控腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移、凋亡和新血管形成［23-24］。Purmorphamine為Shh 信號通路的特異性激活劑，其可直接結(jié)合并激活該通路中的Smo 蛋白，進而激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄［25］。在本研究中，使用Purmorphamine 激活Shh 通路后，SW620 細胞的增殖、遷移和侵襲能力均升高，細胞凋亡率降低，表明激活Shh 信號通路可促進SW620 細胞惡性表型。為了探究藏紅花素抑制SW620細胞惡性生物學行為是否與抑制Shh信號通路有關，我們首先檢測了經(jīng)不同劑量藏紅花素處理后SW620 細胞中Shh 信號通路相關蛋白表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Shh、Smo、Gli-1 蛋白表達均減少，且經(jīng)40 mg/L 藏紅花素處理后減少更明顯。鑒于40 mg/L 的藏紅花素對結(jié)腸癌的抑制作用優(yōu)于10、20 mg/L 藏紅花素，所以選擇此濃度進行機制探討。我們在40 mg/L 藏紅花素處理的基礎上增加Shh 通路激活劑Purmorphamine處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SW620細胞增殖、遷移、侵襲能力增強，凋亡率減少。這兩部分結(jié)果共同表明藏紅花素抑制SW620 細胞惡性生物學行為與抑制Shh信號通路有關。

綜上所述，藏紅花素可抑制SW620 細胞增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡，可能與抑制Shh信號通路有關。本研究可望為藏紅花素的抗結(jié)直腸癌應用提供一定的理論依據(jù)。在本研究所選劑量內(nèi)，藏紅花素的抗癌活性存在劑量依賴性，后續(xù)會增加藏紅花素的干預劑量探究藏紅花素的毒性以及更高的劑量是否活性更強。此外，在未來的研究中會構建裸鼠移植瘤模型進一步驗證藏紅花素的作用機制。