富血小板血漿調控SOX9對緩解SD大鼠膝骨關節炎的影響

梁朝鑫，周安遠，呂沛，王哲緯，楊斯淇，趙政偉，楊淵，6

作者單位：1廣西中醫藥大學，廣西壯族自治區 南寧 530200；2廣西醫科大學再生醫學研究中心，廣西壯族自治區 南寧 530021；3廣西醫科大學，廣西壯族自治區 南寧 530021；4廣西醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，廣西壯族自治區 南寧 530021；5廣西壯族自治區總工會南寧職工康復醫院康復科，廣西壯族自治區 南寧 530000；6廣西醫科大學開元埌東醫院骨科，廣西壯族自治區 南寧 530028

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見慢性的骨關節疾病，由于慢性關節軟骨組織變性損傷或功能遭受過度破壞，關節邊緣骨贅組織形成，導致局部疼痛劇烈，從而可能影響其行走、上下樓梯活動等一系列日常功能活動，且其久治也難愈，若沒有及時有效地采用藥物治療，將使KOA 的病情進一步發展，導致永久性關節功能畸形、殘疾等嚴重后果，影響病人正常的生活質量［1-2］。KOA 綜合征常發生于一些老年病人，病情嚴重者甚至可突然出現肢體行動遲緩及下肢運動功能障，給許多家庭乃至對整個社會經濟都給帶來的了巨大的經濟負擔，所以采取有效的治療尤為重要［3-5］。在骨科，治療膝骨性關節炎的最常用非手術方法有在關節腔中注射透明質酸鈉、口服多種非甾體抗炎藥以及采用局部理療手法和全身藥療等，這些方法雖然能緩解部分疼痛，但并不能起到抗炎和減輕軟骨退化的作用。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是一種通過快速離心抽取全血標本而采集得到的富含高濃度血小板血漿，PRP 樣本中含有的游離血小板濃度至少是正常健康人全血樣品中含血小板濃度的近3～5 倍［6］。PRP 含有多種不同的生長因子，可促進關節軟骨的修復，有可能成為治療KOA的有效方法［7］。研究［8］發現，Y 染色體上的性別決定基因區域（SOX9）具有能夠直接影響基因在軟骨細胞增生及骨骼組織中的再分化或成熟表達的決定性作用。且SOX9 基因能成為結合軟骨細胞肥大的重要標志物X型染色體膠原（ColX）基因表達的關鍵啟動子，同時可以激活影響其成熟表達基因［9］。隨著治療技術日趨成熟，近年來對PRP 及其應用機制在臨床治療和KOA 上的實驗研究工作越來越多，然而，PRP 在治療KOA 病程發展中的藥物作用機制相關的基礎研究則報道甚少。因此，本研究2021 年4月至2022 年3 月從體外通過采用脂多糖（LPS）抑制劑誘導大鼠軟骨細胞的損傷，體內通過體外離斷損傷大鼠膝前交叉韌帶建立了KOA 動物模型，研究PRP 通過體外調控因子SOX9 的表達及對大鼠體外的抗炎機制和大鼠體內的對KOA 病情的緩解及其作用機制，為臨床對于KOA 的診斷和治療提供一條新思路。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級SD大鼠（2～5日齡）6只，8周齡雄性SD 大鼠30 只，由廣西醫科大學動物實驗中心提供（ 倫理編號202105004）。 SOX9 激動劑（M09282290）購于廣西卓一科技有限公司；DMEM培養基（SH30022.01B）購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（21030704）購于浙江天杭生物科技股份有限公司；Ⅱ型膠原酶（C8150）購于北京索萊寶科技有限公司；0.25%胰蛋白酶購于北京索萊寶科技有限公司（20210717）；LPS（L2630）購于美國Sigma 公司；PBS（SV30087.02）購于美國Hyclone 公司；DEPC 處理水（C3088）購于德國RUIBIO 公司；氯仿（H44020154）購于中國上海國藥；異丙醇（80109218）購于中國上海滬試公司；無水乙醇（CNNO.32061）購于中國常熱市鴻盛精細化工有限公司；SYBRGreen PCR 試劑盒（Thermo F-415XL）購于美國賽默飛；逆轉錄試劑盒（Thermo K1622）購于美國賽默飛。

1.2 方法

1.2.1SD 大鼠軟骨細胞提取和培養 2～5 日齡SD大鼠均在全身麻醉下處死，經嚴格的無菌條件下取出膝關節軟骨，剔除肌肉、韌帶等軟組織，從膝關節韌帶下方剪取膝關節軟骨，并將全部軟骨剪為約1 mm3的碎塊。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA 抑制劑在37 ℃培養基中消化30 min，隨后使用2 gLⅡ型胰膠原酶抑制劑消化4 h，1 000 r/min 離心收集底層軟骨細胞，加入10%活胎牛血清蛋白液和1%青鏈霉素混合液后制成的DMEM 培養基內進行培養，觀察軟骨細胞的分布，隔天更換培養基，待軟骨細胞增殖到90%以上時，按1∶3 比例進行細胞傳代，第3 代軟骨細胞還可用于作后續培養實驗。

1.2.2實驗分組與藥物干預 實驗分為正常組、模型組（10 mg/LLPS）、低、中、高濃度PRP 實驗組（10mg/L LPS+5%PRP、10 mg/L LPS+10%PRP 和10 mg/L LPS+20%PRP）和SOX9 實驗組（10 mg/L LPS+SOX9 激動劑）。將第3 代軟骨細胞分別接種到6 個孔板內及放有爬片板的第24孔板孔中，待軟骨細胞表面完全貼壁以后，模型組和實驗組先以10 mg/L LPS 處理1 h 后分別加入5%PRP、10%PRP、20%PRP及含少量SOX9 激動劑的DMEM 培養基中，每組接種3個復孔，藥物處理后24 h后收樣。

1.2.3酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測相關炎癥因子的水平 各組細胞培養24 h 后，通過離心取上清液進行ELISA 檢測。按檢測試劑盒說明書，檢測各組細胞的白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）等炎癥因子水平。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）分析軟骨蛋白相關基因的表達水平 采用qPCR 分析軟骨蛋白聚糖抗體（ACAN）、Ⅱ型多肽膠原酶（COL2A1）、基質金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、低聚蛋白多糖酶（ADAMTS）-4、ADAMTS-5、IL-1β、IL-6、環氧化酶-2抑制劑（COX-2）等的表達水平。采用各組總的RNA 作為樣品裝入提取試劑盒，提取純化出上述各組樣品中總的RNA，然后分別使用逆轉錄試劑盒將這些RNA 樣品全部經過逆轉錄處理保存記錄為cDNA。qPCR 反應主要過程為95 ℃變性加熱10 s，60 ℃變性加熱退火60 s，共分作40個反應循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參。按照2-ΔΔCt方法計算各個目的基因相對表達量。重復3次。

1.2.5動物試驗和病理切片染色 成年的健康大鼠按隨機數字表法分為實驗組、對照組、假手術組，每組各10只，實驗組和對照組通過離斷膝關節前交叉韌帶來建立大鼠急性骨關節炎動物模型，假手術組動物通過切開大鼠關節腔后直接縫合建立。造模1 個月后，實驗組隔日予膝關節關節腔內注射PRP 溶液（PRP∶氯化鈣=1∶9）0.5 mL，對照組和假手術組隔日分別關節腔內注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續1 個月，各組將大鼠關節軟骨組織脫蠟酶激活后分別用常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色、番紅固綠染色和甲苯胺藍染色后用光學顯微鏡下連續拍照取圖。

1.3 統計學方法采用SPSS 24.0 統計分析軟件對數據進行統計分析。計量資料采用±s表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組炎癥因子水平比較采用ELISA 法定量檢測各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6及iNOS水平。與正常組比較，模型組軟骨細胞在經過LPS 處理以后，IL-1β、TNF-α、IL-6 和iNOS 水平明顯增高，而分別予以不同藥物濃度的PRP 處理和SOX9 處理以后，其血清炎癥因子水平則不同程度降低（P＜0.05或P＜0.01），且SOX9 實驗組降低效果最為顯著（均P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS的水平比較/± s

表1 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS的水平比較/± s

注：IL為白細胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子α，iNOS為誘導型一氧化氮合酶。①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組低濃度PRP實驗組中濃度PRP實驗組高濃度PRP實驗組SOX9實驗組iNOS 0.84±0.02 1.06±0.01①1.02±0.01①②0.99±0.01①②0.95±0.01①②0.92±0.01①②重復次數3 3 3 3 3 3 IL-1β 58.3±2.26 81.65±1.37①77.46±0.89①②72.37±1.37①②68.95±1.58①②64.29±1.87①②IL-6 34.75±1.75 73.3±1.75①65.12±2.67①②57.53±1.75①②53.44±1.01①②47.01±1.75①②TNF-α 13.41±0.23 22.76±0.37①22.06±0.14①②20.88±0.21①②19.75±0.21①②19.24±0.16①②

2.2 各組軟骨蛋白相關基因的表達水平比較采用RT-PCR 分析ACAN、COL2A1 等軟骨特異性基因表達和MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5、IL-1β、IL-6、COX-2 等軟骨炎癥相關的蛋白基因表達水平。與正常組比較，模型組使用LPS 后軟骨細胞軟骨特異性基因的表達水平被明顯下調，軟骨炎癥相關基因的表達水平被明顯上調，三種不同濃度PRP 和SOX9 激動劑處理后，明顯逆轉了軟骨特異性基因表達水平的下調和軟骨炎癥相關基因表達的上調，其中以SOX9實驗組的作用最為顯著（均P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠軟骨特異性基因及軟骨炎癥相關基因的表達水平比較/± s

表2 各組大鼠軟骨特異性基因及軟骨炎癥相關基因的表達水平比較/± s

注：ACAN 為軟骨蛋白聚糖抗體，COL2A1 為Ⅱ型多肽膠原酶，MMP 為基質金屬蛋白酶，ADAMTS 為低聚蛋白多糖酶，IL 為白細胞介素，COX-2為環氧化酶-2抑制劑。①與正常組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

MMP-13 1.00±0.01 1.47±0.01①1.43±0.01①②1.40±0.01①②1.33±0.01①②1.19±0.02①②ADAMTS-4 1.00±0.03 1.58±0.01①1.50±0.01①②1.45±0.02①②1.41±0.01①②1.31±0.01①②組別正常組模型組低濃度PRP實驗組中濃度PRP實驗組高濃度PRP實驗組SOX9實驗組組別正常組模型組低濃度PRP實驗組中濃度PRP實驗組高濃度PRP實驗組SOX9實驗組重復次數3 3 3 3 3 3 ADAMTS-5 1.00±0.03 1.24±0.01①1.22±0.01①1.17±0.01①②1.15±0.01①②1.08±0.01①②ACAN 1.00±0.07 0.64±0.01①0.74±0.02①②0.79±0.01①②0.81±0.01①②0.90±0.02①②IL-6 1.00±0.06 1.41±0.01①1.39±0.01①②1.36±0.01①②1.32±0.01①②1.20±0.01①②COL2A1 1.00±0.01 0.64±0.01①0.65±0.01①②0.69±0.01①②0.70±0.01①②0.84±0.02①②COX-2 1.00±0.03 1.49±0.01①1.45±0.01①1.27±0.01①1.22±0.01②1.15±0.017②MMP-3 1.00±0.01 1.39±0.01①1.33±0.01①②1.32±0.01①②1.29±0.01①②1.16±0.02①②IL-1β 1.00±0.01 1.44±0.01①1.33±0.01①②1.28±0.01①②1.25±0.01①②1.15±0.02①②

2.3 各組大鼠膝關節大體觀通過對比實驗組、對照組和假手術組的膝關節大體觀發現，實驗組與假手術組膝關節表面光滑，差異并不明顯，對照組膝關節大體觀腫脹且表面粗糙。見圖1。

圖1 各組大鼠膝關節大體觀：A為實驗組；B為對照組；C為假手術組

2.4 各組大鼠膝關節軟骨組織HE、番紅O 及甲苯胺藍染色假手術組大鼠膝關節的軟骨表層保持光滑與完整，軟骨細胞結構未遭受損傷破壞，細胞結構排列整齊，細胞內外兩層基質均完整存在；對照組大鼠膝關節的軟骨層較為粗糙，細胞結構遭受嚴重破壞，細胞結構排列出現紊亂、散落及不整齊，部分細胞的基質也發生變性降解，并見局部有明顯炎癥細胞浸潤和組織壞死變性；實驗組大鼠膝關節的膝關節軟骨層均較正常連續而完整且光滑，軟骨細胞數量比較多且細胞排列相對較規范整齊，細胞外基質亦較對照組連續和完整，僅有較少量軟骨炎癥細胞浸潤。見圖2。

圖2 各組大鼠膝關節軟骨組織細胞圖（×400）：A為HE染色；B為番紅O染色；C為甲苯胺藍染色

2.5 各組大鼠膝關節軟骨組織免疫組化染色結果本研究中，MMP-13 和ADAMTS-4 兩種抗體均在免疫組化染色中有陽性表現。

3 討論

KOA 是骨科目前較常見到的一種膝關節退化性骨骼肌肉疾病，影響整個關節表面的骨關節所有重要組織，包括膝關節軟骨、骨、韌帶肌腱和肌肉等，KOA 導致的主要臨床病理組織改變有關節軟骨細胞的增生變性、損壞及骨質增生形成和骨周圍皮膚軟組織損傷的繼發性炎癥刺激反應等。目前KOA 的治療方法都有其局限性，近年來隨著PRP 的不斷深入研究與應用，采用在膝關節腔內注射PRP治療KOA 取得了進一步的發展。PRP 作為含有多種生長因子的血小板濃縮物，可有效促進膝關節軟骨細胞的再生［10］。其中，在關節腔內注射PRP 治療KOA，可使免疫促炎因子IL-1β 和TNF-α 均降低，進而改善了KOA的癥狀［11-12］。本研究探討了PRP能通過選擇性調控SOX9 受體的表達及其對LPS 誘導下的大鼠關節軟骨損傷后的功能保護效果及PRP 產生了對大鼠骨關節功能的潛在保護修復作用，結果表明PRP 可通過選擇性調控SOX9 基因的表達來有效緩解并阻斷了小鼠KOA病情的進展。

KOA 病程中，在膝關節的退行性改變和生物力學失衡的影響下，刺激了軟骨細胞產生炎癥反應，并通過巨噬細胞對關節退變、損傷等病理環境下發生反應，產生了大量的炎癥因子［13-14］。有研究［15］發現，軟骨調控相關基因表達異常可能與退行性改變相關。由于PRP 中含有著較高水平的血小板濃度，同時活化血小板還可直接激活其他多種血小板生長因子，為KOA 病變組織的修復創造了更有利的環境［16-17］。同時，研究［18］發現PRP 可減少軟骨中MMP-13陽性細胞的表達，通過抑制MMP-13的表達從而進一步發揮了對軟骨的保護作用。并且ADAMTS-4也是關節退行性構改變發生的一種重要生物學標志蛋白之一，其本身作為對關節軟骨外膜基質蛋白的水解酶，關節軟骨蛋白質的誘導降解酶有其重要獨特的作用［19］，并在關節炎中聚蛋白多糖降解具有巨大效力［20］。相關研究［21］結果顯示，通過抑制ADAMTS-4的和調節ADAMTS-5的結合水平可同時有效的降低對聚蛋白多糖的降解，從而明顯減少低聚蛋白多糖的丟失率和軟骨細胞破壞。SOX9蛋白屬于SOX 蛋白家族，對軟骨細胞表型調控及軟骨穩態細胞的有效誘導保護功能具有特殊重要生理作用，在誘導軟骨細胞的分化增殖與分化凋亡中均有很重要獨特的重要作用，是將合成的軟骨細胞生長刺激因子誘導成為軟骨組織分化生長過程調控中關鍵的重要因素［22］。有研究［23］發現，SOX9 可調節軟骨外基質的表達。Zhang 等［24］研究發現，SOX9 還可抑制ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-7、ADA 及MTS-12 個基因表達的mRNA 蛋白生成，進而有效影響了聚蛋白多半糖酶基因表達的逆轉錄，證實出了SOX9 確實是一種聚蛋白多糖酶表達的特異性抑制活性物，從而可能對關節軟骨和細胞外基質產生的有效保護。SOX9 可以直接通過抑制軟骨細胞中的軟骨肥大酶和促進部分未被分化過的軟骨細胞進行細胞再生分化過程［25-26］，且間接參與促進了對軟骨細胞中的COL2A1軟骨細胞特異性酶激活誘導作用，控制促進了COL2A1 在軟骨細胞分子中的特異性表達［27］。而MMP-13 則可致使COL2A1降解［28］。由此推斷SOX9 可能通過抑制ADAMTS-4和MMP-13 基因的表達，從而達到減少聚蛋白多糖丟失和抑制軟骨細胞肥大及COL2A1 降解，進而可有效緩解KOA病程的發展。

本研究中的體外實驗部分在中體外使用了LPS（10 mg/L）對軟骨細胞產生出了關節炎癥的誘導病理反應，建立出了由軟骨細胞的炎癥模型，體內部分研究通過離斷SD 大鼠膝關節前交叉韌帶而建立出的膝骨關節炎模型。體外試驗研究數據中，不同的血清濃度水平上的PRP 和SOX9 激動劑聯合作用位點均可同時通過兩種作用機制分別增強了膠原軟骨特異性基因ACAN 和對COL2A1 mRNA 水平的高選擇性誘導表達，且在SOX9 激動劑的作用下表達最明顯，同時它們亦可分別通過降低對MMP-3、MMP-13 和對ADAMTS-4、ADAMTS-5 基因的mRNA表達的水平，從而緩解Ⅱ型膠原的降解和阻止了聚蛋白多糖的丟失，這二者似乎都可能更大程度有利于軟骨細胞的外基質結構的重新形成。在軟骨炎癥因子方面，各濃度下的PRP 表達和在SOX9 激動劑作用下均不同程度降低了在LPS誘導條件下的軟骨組織損傷模型細胞表面中的包括IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2 等在內的高特異性mRNA 水平的表達，同時在軟骨細胞表面上的包括IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 等其他抗炎癥因子水平含量也明顯降低，并且在SOX9 激動劑作用下的效果最明顯。大鼠病理切片顯示，PRP 能明顯改善KOA 的關節病變，從而減緩大鼠延緩型關節炎病程和發展趨勢，表明PRP 對關節軟骨損傷的恢復具有積極的作用。

綜上所述，PRP對關節軟骨損傷有保護作用，其作用機制可能是通過調控SOX9 的表達，進而降低炎癥因子的表達且緩解Ⅱ型膠原降解和減少聚蛋白多糖的流失，緩解了軟骨細胞外基質的降解，從而有效緩解了KOA 的進一步發展。目前膝關節腔內注射PRP 越來越多地成為在臨床上治療KOA 的有效方案。然而，對于PRP 的長期療效和具體作用機制還需進一步研究。