類固醇受體輔活化子-3對嚴重燒傷小鼠腸黏膜屏障功能損傷的影響

楊宇，易慶軍，李軍，張永洪，文婷婷

作者單位：電子科技大學醫學院附屬綿陽醫院、綿陽市中心醫院，a麻醉科，b兒科，四川 綿陽 621000

重度燒傷不僅會對皮膚和皮下軟組織造成大面積損傷，還會因缺血、缺氧、炎癥等對多個器官造成損害，而腸道是燒傷后最易受到損傷的器官之一［1］。嚴重燒傷后，全身血液灌注重新分布，腸道缺血缺氧，腸黏膜上皮屏障破壞，腸道細菌易位，內毒素進入血液，可導致腸道內毒素血癥，甚至敗血癥和多器官功能障礙［2-3］。因此，保護腸黏膜屏障功能可能是提高嚴重燒傷后存活率的有效方法。

類固醇受體輔活化子-3（steroid receptor coactivator-3， SRC-3）是一種轉錄共激活因子，SRC-3在腸道穩態中具有重要作用。據報道，SRC-3 可通過募集中性粒細胞來增強宿主對腸道細菌的防御［4］；并且SRC-3 可能與嚴重燒傷后T 淋巴細胞免疫功能抑制有關［5］。此外，SRC-3 可以通過抑制炎癥和促進結腸杯狀細胞分化和成熟，改善潰瘍性結腸炎［6］。然而，SRC-3 在嚴重燒傷后腸黏膜屏障功能損傷中的生物學作用仍未可知。黏液分泌不足和黏液成分變化引起的腸道黏液層損傷是引起腸道損傷的始發因素之一［7］。黏液由杯狀細胞分泌，可起到阻滯劑的作用，防止細菌、毒素與腸上皮接觸［8］。因此，本研究2022 年1—4 月從腸道黏液合成和分泌的角度探討SRC-3在嚴重燒傷后腸黏膜屏障功能損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級雌性SRC-3基因敲除（SRC-3-/-）小鼠和野生型（SRC-3+/+）小鼠各36 只，10～12 周齡，體質量范圍為18～23 g，由美國貝勒醫學院分子和細胞生物學實驗室提供。在實驗開始前將動物在溫度22～25 ℃、濕度60%～65%、12 h 光/暗循環的無病原體環境中適應1周。所有的實驗方案均符合動物護理和一般動物實驗倫理學原則。

1.2 主要試劑及儀器熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-dextran）（60842-46-8）購自美國MedChemExpress公司；小鼠內毒素（endotoxin， ET）（ml002005）、二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）（ml002199）、白細胞介素6（interleukin 6， IL-6）（ml063159）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α， TNF- α）（ml002095）ELISA 檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色試劑盒（G1120）、阿爾新藍-過碘酸-希夫（Alcian Blue Periodic acid Schiff， AB-PAS）染色試劑盒（G1285）購自北京Solarbio 公司；兔抗小鼠黏蛋白2（mucin2， Muc2）抗體（ab272692）、IL-6 抗體（ab208113）、TNF-α 抗體（ab183218）購自英國Abcam 公司；SRC-3（#2126）購自美國Cell Signaling Technology公司。iMark680多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）；BX53光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 模型的建立將SRC-3小鼠（n=36）作為實驗-/-組，SRC-3+/+小鼠（n=36）作為對照組。所有小鼠均采用40 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，然后使用電動推剪去除背毛。對照組和實驗組小鼠剃毛并固定相當于體表總面積（total body surface area，TBSA）30%的面積后，將其置于100 ℃水中8 s 誘導建立30% TBSA Ⅲ度燒傷模型［9］。燒傷后，立即腹腔注射林格氏液（50 mL/kg）進行復蘇，皮下注射丁丙諾啡（1 mg/kg）鎮痛。

1.4 指標檢測

1.4.1FITC-dextran 灌胃檢測腸道通透性 在燒傷后第1、3、5 天時，每組采用隨機數字表法選擇6 只小鼠，以440 mg/kg 的劑量灌胃FITC-dextran。4 h后，取血，靜置30 min 后離心分離血清。通過熒光分光光度法（激發：480 nm，發射：520 nm）測量血清中的熒光強度。然后根據標準曲線計算血清FITCdextran濃度，評估腸道通透性。

1.4.2ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-6 水平和血漿DAO 活性以及ET 水平 在燒傷后的不同時間點，每組采用隨機數字表法選擇6 只小鼠，取血并分離血清，通過ELISA測量血清TNF-α和IL-6水平；取部分血樣放入普通的肝素抗凝管中，靜置后離心，分離血漿，檢測血漿中DAO 活性；另取部分血樣放入無熱原的ET測定專用管中，靜置后離心，分離血漿，檢測血漿中ET水平。

1.4.3HE 和AB-PAS 染色評估腸黏膜損傷和杯狀細胞黏液分泌情況 取血后，從小鼠身上采集回腸組織樣本（長5 cm）并固定在中性福爾馬林溶液（pH 7.4）中。然后石蠟包埋、制備連續切片（5 μm厚）。然后將切片脫蠟并用HE 或AB-PAS 染色試劑盒染色。在光學顯微鏡下觀察并拍照。HE 染色觀察腸黏膜損傷，評分標準如下［7］：絨毛正常，0 分；絨毛頂部存在囊性空間，毛細血管充血，1 分；絨毛頂端上皮下間質增大，中度內皮水腫，2 分；固有層明顯水腫，上皮細胞變性壞死，絨毛尖端脫落，3 分；上皮細胞層變性、壞死、脫落、部分絨毛脫落、裸固有層、毛細血管擴張、充血，4 分；絨毛脫落、固有層崩解、出血、潰爛，5 分。AB-PAS 染色評估杯狀細胞黏液分泌情況（可反映杯狀細胞分化成熟情況），計數染成藍色和紫紅色陽性杯狀細胞（AB+/PAS+細胞）。AB 將酸性黏多糖染成藍色，PAS將中性黏多糖染成紫紅色。

1.4.4免疫組織化學（immunohistochemistry， IHC）染色檢測Muc2 的表達 取腸組織石蠟切片，經過脫蠟、水化、抗原修復后，與3%過氧化氫（H2O2）一起孵育以滅活內源性過氧化物酶活性。切片在室溫下用3%牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，在4 ℃下與一抗Muc2（1∶100）孵育過夜。隨后，將切片用PBS 洗滌，并在室溫下與二抗（山羊抗兔，1∶100）孵育1 h。DAB 顯色，蘇木精復染細胞核，光學顯微鏡下觀察腸組織Muc2 陽性表達，每張切片采用隨機數字表法選擇3個視野，用Image Pro Plus 6.0計算平均光密度（mean optical density， MOD）。

1.4.5蛋白質印跡法檢測腸黏膜中SRC-3、Muc2、IL-6 和TNF-α 蛋白表達 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液從腸黏膜中提取總蛋白。通過SDS-PAGE 凝膠分離等量的蛋白質提取物，并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。將膜用5%脫脂牛奶封閉后，在4 ℃下與一抗SRC-3（1∶1 000）、Muc2（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）孵育過夜。然后，與相應的二抗（1∶5 000）一起孵育1 h。增強化學發光底物（ECL）顯色，用Image J軟件分析條帶灰度值，并以GAPDH 為內參蛋白，計算目的蛋白的相對表達。

1.5 統計學方法采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析，計量資料以xˉ±s表示。兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SRC-3 在燒傷小鼠中的表達變化與未燒傷SRC-3+/+小鼠相比，在燒傷后第1、3、5 天，從SRC-3+/+小鼠腸黏膜組織裂解物中檢測到SRC-3蛋白表達呈降低趨勢；在SRC-3-/-小鼠的腸黏膜中未檢測到SRC-3蛋白。見圖1。

圖1 燒傷小鼠腸黏膜中SRC-3蛋白表達

2.2 SRC-3 缺失對燒傷小鼠腸道通透性的影響在燒傷后第1、3、5 天時，與對照組（SRC-3+/+小鼠）相比，實驗組SRC-3-/-小鼠血清FITC-dextran 濃度顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組小鼠血清熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-dextran）濃度比較/± s

表1 兩組小鼠血清熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-dextran）濃度比較/± s

組別對照組實驗組t值P值鼠數6 6 FITC-dextran（μg/L）第1天685.14±79.36 1 156.21±107.65 8.63＜0.001第3天743.72±82.29 1 425.81±115.36 11.79＜0.001第5天824.35±85.44 1 613.27±120.94 13.05＜0.001

2.3 SRC-3 缺失對燒傷小鼠血漿DAO 活性和ET水平的影響在燒傷后第1、3、5 天時，與對照組（SRC-3+/+小鼠）相比，實驗組SRC-3-/-小鼠血漿DAO活性和ET水平顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組小鼠血漿二胺氧化酶（DAO）活性和內毒素（ET）水平比較/± s

表2 兩組小鼠血漿二胺氧化酶（DAO）活性和內毒素（ET）水平比較/± s

組別對照組實驗組t值P值鼠數DAO/（U/mL）ET/（EU/mL）6 6第1天1.85±0.22 2.69±0.31 5.41＜0.001第3天2.09±0.25 3.12±0.36 5.76＜0.001第5天2.20±0.27 3.70±0.39 7.75＜0.001第1天0.94±0.12 1.28±0.16 4.16 0.002第3天1.30±0.15 1.79±0.21 4.65＜0.001第5天1.82±0.23 2.43±0.28 4.12 0.002

2.4 SRC-3 缺失對燒傷小鼠腸黏膜形態學的影響HE 染色結果顯示，對照組SRC-3+/+小鼠在燒傷后第3、5 天腸黏膜出現明顯損傷，主要表現為絨毛腫脹、黏膜充血水腫、毛細血管充血、炎癥細胞浸潤。與對照組相比，實驗組SRC-3-/-小鼠在燒傷后第1、3、5天腸黏膜病理損傷程度加重，燒傷后第1天腸黏膜水腫、毛細血管充血、絨毛縮短，燒傷后第3、5天絨毛破裂、壞死、脫落、炎癥細胞浸潤、黏膜下充血、水腫、固有層剝落、絨毛紊亂萎縮，甚至形成淺表潰瘍，腸黏膜損傷評分顯著升高（P＜0.05）。見圖2，表3。

表3 兩組小鼠腸黏膜損傷評分比較/± s

表3 兩組小鼠腸黏膜損傷評分比較/± s

組別對照組實驗組t值P值鼠數6 6腸黏膜損傷評分/分第1天1.38±0.20 1.95±0.23 4.58 0.001第3天2.01±0.24 2.52±0.29 3.32 0.008第5天2.49±0.28 3.17±0.35 3.72 0.004

圖2 兩組小鼠腸黏膜形態學變化（HE染色×100）

2.5 SRC-3 缺失對燒傷小鼠腸杯狀細胞分化成熟的影響AB-PAS 染色結果顯示，在燒傷后第1、3、5天，與對照組（SRC-3+/+小鼠）相比，實驗組SRC-3-/-小鼠腸組織中AB+杯狀細胞的豐度明顯降低，PAS+杯狀細胞數量顯著增加（P＜0.05）。見圖3，表4。

表4 兩組小鼠腸杯狀細胞數量比較/± s

表4 兩組小鼠腸杯狀細胞數量比較/± s

組別對照組實驗組t值P值鼠數AB+杯狀細胞數/腸隱窩PAS+杯狀細胞數/腸隱窩第3天15.80±1.91 9.24±1.35 3.87＜0.001第1天21.42±2.53 15.36±1.84 4.74＜0.001第5天10.35±1.74 4.70±0.62 7.49＜0.001 6 6第1天8.72±1.10 13.60±1.85 5.55＜0.001第3天10.45±1.28 17.08±2.16 6.47＜0.001第5天13.50±1.46 22.94±2.51 7.96＜0.001

圖3 兩組小鼠腸杯狀細胞分化成熟情況（AB-PAS染色×100）

2.6 SRC-3缺失對燒傷小鼠腸黏膜中Muc2表達的影響IHC 染色結果顯示，在燒傷后第1、3、5 天，與對照組（SRC-3+/+小鼠）相比，實驗組SRC-3-/-小鼠腸黏膜中Muc2 表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖4，表5。

表5 兩組小鼠腸黏膜中黏蛋白2（Muc2）表達水平比較/± s

表5 兩組小鼠腸黏膜中黏蛋白2（Muc2）表達水平比較/± s

組別對照組實驗組t值P值鼠數Muc2 6 6第1天0.041±0.005 0.029±0.004 4.59 0.001第3天0.030±0.003 0.018±0.002 8.15＜0.001第5天0.022±0.003 0.010±0.001 9.30＜0.001

圖4 兩組小鼠腸黏膜中Muc2陽性表達情況（IHC染色×100）

2.7 SRC-3 缺失對燒傷小鼠血清IL-6 和TNF-α水平的影響在燒傷后第1、3、5 天，與對照組（SRC-3+/+小鼠）相比，實驗組SRC-3-/-小鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）。見表6。

表6 兩組小鼠血清白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）比較/（ng/L，± s）

表6 兩組小鼠血清白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）比較/（ng/L，± s）

組別對照組實驗組t值P值鼠數IL-6 TNF-α第3天27.25±4.31 89.40±10.68 13.22＜0.001第1天20.38±2.76 45.36±5.42 10.06＜0.001第5天40.74±5.20 126.30±14.19 13.87＜0.001 6 6第1天26.45±3.51 39.12±4.82 5.20＜0.001第3天32.26±4.73 50.75±5.64 6.15＜0.001第5天41.18±5.06 72.23±7.40 8.48＜0.001

2.8 SRC-3 缺失對燒傷小鼠腸黏膜中Muc2、IL-6和TNF-α蛋白表達的影響在燒傷后第1、3、5 天，與對照組（SRC-3+/+小鼠）相比，實驗組SRC-3-/-小鼠腸黏膜中Muc2 蛋白水平顯著降低，IL-6、TNF-α 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。見圖5、表7。

表7 兩組小鼠腸黏膜中黏蛋白2（Muc2）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）蛋白水平比較/± s

表7 兩組小鼠腸黏膜中黏蛋白2（Muc2）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）蛋白水平比較/± s

組別對照組實驗組t值P值鼠數Muc2 IL-6/（ng/L）TNF-α/（ng/L）第1天0.65±0.08 0.46±0.06 4.65＜0.001第3天0.47±0.06 0.28±0.04 6.45＜0.001第5天0.35±0.05 0.16±0.03 7.98＜0.001第1天0.30±0.04 0.48±0.06 6.11＜0.001第3天0.41±0.05 0.60±0.08 4.93＜0.001 6 6第5天0.50±0.07 0.79±0.09 6.23＜0.001第1天0.25±0.03 0.40±0.06 5.48＜0.001第3天0.32±0.05 0.71±0.08 10.13＜0.001第5天0.41±0.06 0.83±0.10 8.82＜0.001

圖5 兩組小鼠腸黏膜中Muc2、IL-6和TNF-α蛋白表達

3 討論

腸道對缺血、缺氧和炎癥非常敏感，嚴重燒傷會降低腸道血液灌注，導致腸黏膜結構和功能受損，使腸道屏障功能減弱，進而引發嚴重的全身炎癥反應，從而導致多器官損傷［1］。腸道屏障包括黏液層的化學屏障、上皮細胞層的機械屏障和固有層的免疫屏障［10］。腸黏膜是負責食物消化吸收的主要部位，其屏障功能也是維持機體環境穩態的核心要素。腸黏膜的完整性是反映腸屏障功能的重要指標［11］。SRC-3 是一種多功能蛋白，在調節細菌脂多糖誘導的炎癥［12］和腸道穩態［4，6］中起重要作用。已有研究證實，敲除SRC-3 基因可能在嚴重燒傷后增加機體對病原微生物的易感性［4］。在本研究中，為了確定SRC-3 在燒傷中的功能，檢查了不同燒傷階段小鼠腸黏膜中SRC-3的表達。筆者發現與未燒傷SRC-3+/+小鼠相比，在燒傷后第1、3、5 天，SRC-3+/+小鼠腸黏膜中SRC-3 蛋白表達逐漸降低；而在SRC-3-/-小鼠的腸黏膜中未檢測到SRC-3 蛋白。此外，與SRC-3+/+小鼠相比，SRC-3-/-小鼠在燒傷后觀察到更嚴重的腸黏膜屏障功能障礙，并產生更多的促炎細胞因子（IL-6、TNF-α）。因此，SRC-3 對燒傷誘導的腸黏膜屏障功能可能具有重要保護作用。

燒傷后腸道屏障功能受損可促使細菌和毒素易位，這種易位可引發腸道感染和高腸道代謝，導致預后不良［13］。ET、DAO 是腸道損傷的敏感指標，腸道損傷后血漿ET 水平、DAO 活性顯著升高［14］。在本研究中，在燒傷后第1 天至第5 天，SRC-3-/-小鼠的腸道通透性明顯高于SRC-3+/+小鼠，同時血漿ET水平、DAO 活性均明顯升高。用HE 染色測定腸黏膜損傷進一步證實了此結果，燒傷后SRC-3-/-小鼠腸黏膜充血水腫，黏膜剝脫、潰爛程度較SRC-3+/+小鼠加重。表明嚴重燒傷后SRC-3的缺失使腸組織結構受到明顯影響，加重了腸道屏障功能損傷。

腸黏液屏障是腸道屏障系統的重要組成部分，由腸黏液組成。腸黏液由杯狀細胞分泌，在維持腸黏膜結構和功能中的作用越來越受到重視［15］。未成熟的杯狀細胞主要分泌中性黏液，隨著不斷分化，唾液酸含量不斷增加，酸性黏液含量是杯狀細胞成熟的重要指標［7］。本研究發現，燒傷后SRC-3-/-小鼠酸性黏液的分泌較SRC-3+/+小鼠顯著減少，中性黏液的分泌增加。Muc2 免疫組化染色和蛋白免疫印跡結果顯示，腸道黏液的核心成分黏蛋白Muc2在SRC-3-/-小鼠中的表達水平顯著低于SRC-3+/+小鼠。腸黏液層由大約30種核心蛋白組成，包括黏蛋白、抗菌肽和分泌的免疫球蛋白A。其中，由腸杯狀細胞在上皮細胞層合成的Muc2 是最重要的成分［16］。Muc2 的表達和分泌不足，則Muc2 黏液屏障的內層會逐漸變薄并變得可穿透。這時，腸道細菌可以侵入黏液層，與腸上皮細胞層接觸，誘發腸道炎癥甚至癌變［17-18］。IL-6、TNF-α 作為促炎遞質，在燒傷中廣泛釋放，已被報道與燒傷患者腸道屏障功能損傷有關［19］。Chen 等［6］的研究顯示，在潰瘍性結腸炎小鼠中，SRC-3 的缺失減少了Muc2 陽性結腸杯狀細胞數量，同時促炎細胞因子的產生增加。在本研究中可觀察到燒傷后SRC-3-/-小鼠血清和腸黏膜中IL-6、TNF-α 水平較SRC-3+/+小鼠顯著升高，與以往的研究結果一致。表明SRC-3的缺失嚴重損害了杯狀細胞的分化和成熟，可能是燒傷誘發腸黏膜屏障功能障礙的病因之一。提示，SRC-3 可以減少燒傷對杯狀細胞的損傷，促進杯狀細胞的分化和成熟。

綜上所述，SRC-3 缺失可以在嚴重燒傷后損害杯狀細胞的分化成熟，減少腸黏液的合成與分泌，加重腸黏膜屏障功能障礙。本研究表明SRC-3可能是腸黏膜屏障功能的主要調節因子，在保護宿主免受細菌感染方面發揮著重要作用。因此，如何在燒傷后維持SRC-3 的表達進而保護腸黏膜屏障功能，是未來研究的重點。此外，SRC-3 如何調控杯狀細胞的分化成熟以及SRC-3基因的缺失是否會影響創傷小鼠的自愈能力仍有待探索。