維生素E聚乙二醇琥珀酸酯乳化α-生育酚琥珀酸酯納米乳的制備及體外抗腫瘤細胞活性評價

齊雪靜，曹輝，趙宇，張引蘭

作者單位：1南京市第二醫院、南京中醫藥大學附屬南京醫院藥學部，江蘇 南京 210003；2齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161003

α-TOS 是天然維生素E（vitamin E， VE）的一種酯化衍生物（結構如圖1）。近年來越來越多的文獻報道α-TOS 可以通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡，在體外對小鼠黑色素瘤［1］、乳腺癌［2］、前列腺癌［3］、淋巴癌［4］、結腸癌［5］等細胞株均具有較強的抑制作用。此外，相對于傳統藥物α-TOS 具有較好的選擇性，能選擇性地殺滅腫瘤細胞，對正常細胞沒有毒副作用［6-7］。這種高效低毒的抗腫瘤特性使其成為理想的線粒體靶向抗腫瘤候選藥物。然而由于α-TOS 具有水溶性差、易被人體內的酯酶水解等缺點，從而限制了其臨床應用。

圖1 α-TOS的結構

為了克服上述問題，將納米給藥系統應用于抗腫瘤領域的技術應運而生。納米給藥系統具有結構穩定、毒性小、生物相容性良好、提高藥物的生物利用度等優點。目前α-TOS 的納米制劑包括納米粒、納米乳、脂質體、納米囊泡等，這些制劑不僅改善了α-TOS的溶解性，同時提高了藥物的靶向性，相對于傳統制劑有更突出的優勢，但目前臨床上還未有上市制劑。然而納米制劑也存在輔料用量大、載藥量低、材料自身毒性等缺點。因此選擇合適的輔料具有重要意義。維生素E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）是一種聚乙二醇（PEG）維生素E 琥珀酸鹽的衍生物，具有兩親性質［8］，HLB 值為13.2，水溶性較好［9］，廣泛用作乳化劑、增溶劑、藥物傳遞載體及增塑劑［10-13］，旨在提高藥物的生物利用度［14］、包封率［15］、細胞毒性和延長藥物半衰期［16］。此外TPGS對P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）具有抑制作用，可以逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥［17］。因此TPGS 在抗腫瘤藥物傳遞系統應用較為廣泛。本研究自2022 年1—4 月基于α-TOS 的局限性設計開發了α-生育酚琥珀酸酯納米乳（T-NE），根據前期的研究成果選擇了合適的處方，并通過偽三元相圖對處方進行了優化；然后通過外觀、類型、粒徑、載藥量、透射電鏡、多分散系數、放置穩定性等方法系統地表征了T-NE；最后通過體外抗腫瘤細胞活性實驗證明納米乳增加了α-TOS的藥效。

1 材料和方法

1.1 儀器AEU-210 型分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司，BSA124S-CW），恒溫加熱磁力攪拌器（上海曉霄實驗儀器設備有限公司，SH-3），KQ3200E 醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），激光粒徑分析儀（英國Malvern 公司，Zetasizer 3000HS），臺式低速大容量離心機（南京曉曉儀器設備有限公司，湘儀L-550），Agilent1260 Infinity 液相色譜儀（美國安捷倫公司）， MCO-15AC 二氧化碳培養箱（三洋電器股份有限公司），LDZX-50A2780型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），倒置生物顯微鏡（北京佳源興業科技有限公司，XDS-1B），酶標儀（Tecan 集團奧地利有限公司，Infinite 200 PRO），Hitachi-HT7700透射電鏡（上海滬西分析儀器廠有限公司），一次性無菌U 型底96 孔板（浙江拱東醫用塑廠）。

1.2 材料α-TOS（邁瑞達，批號M097147），TPGS（邁瑞達，批號M057777），維生素E（VE）（邁瑞達，批號M159328），PEG 400（邁瑞達，批號M056425），RPMI1640細胞培養液（賽默飛世爾生物化學制品有限公司，批號A1049101），唑溴鹽（MTT）（賽默飛世爾生物化學制品有限公司，批號M6494），胎牛血清（賽默飛世爾生物化學制品有限公司，批號16140089），0.25 %含EDTA 胰酶（Gibco公司，批號R001100），二甲基亞砜（DMSO）（賽默飛世爾生物化學制品有限公司，批號20688），無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司，色譜純），青霉素-鏈霉素（100萬單位/瓶）（Gibco 公司，批號15140148），高效液相用試劑均為分析純。

1.3 細胞人乳腺癌細胞系MCF-7 和人卵巢癌細胞系A2780，由南京市第二醫院臨床科研中心贈送。

2 方法

2.1 空白納米乳處方初步篩選及優化納米乳處方設計最重要的一步是選擇合適的組分以及確定各組分比例，本研究通過文獻閱讀及前期研究經驗最終確定TPGS 做表面活性劑，PEG400 做助表面活性劑、VE 做油相。采用水滴定法繪制偽三元相圖，確定納米乳區的范圍，以納米乳區域的大小為指標找出納米乳的最佳處方組分比例。

偽三元相圖優化處方：室溫下，將表面活性劑與助表面活性劑按一定的比例混合，作為混合表面活性劑（Smix），其質量比記為Km，精密稱取油相，使其與混合表面活性劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1（w/w）的比例混合，磁力攪拌混勻后逐滴加入水，當水滴加到某一點時，體系的黏度突然變小，形成澄清、透明有藍色乳光的納米乳，記錄此時滴定的蒸餾水的量，計算形成納米乳時臨界點各組分的質量，計算出其百分含量。以Oil、Smix、Water 分別作為相圖的3 個頂點，應用Origin 8.5 軟件繪制偽三元相圖，圖中只標出了納米乳區（NE）。實驗中又考察了空白納米乳中VE/TPGS=3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（w/w）時以澄清度為指標納米乳的形成情況，確定油相與乳化劑的比例。

2.3 制劑學性質評價

2.3.1納米乳類型鑒別 采用染色法鑒別納米乳的類型，取相同體積的T-NE 兩份，同時分別滴加適量甲基紅及亞甲基藍染料溶液，靜止放置，觀察兩種染料（紅色和藍色）在納米乳液中擴散速度的快慢以及外觀的變化。甲基紅染料為油溶性染料，易在油相中擴散；亞甲基藍染料為水溶性染料，易在水溶液中擴散。若藍色的擴散速度大于紅色的擴散速度，則為O/W 型納米乳，反之則為W/O 型納米乳。

2.3.2納米乳類型的形態學考察 取新鮮制備的

T-NE 稀釋適量倍數，滴置于覆有支撐膜的銅網上，固定2～3 min 后用濾紙小片從銅網邊緣吸干多余的液體，用1%的磷鎢酸液染色2 ～ 3 min，吸干多余染液，自然干燥，置于透射電鏡下觀察其形態。

2.3.3粒徑分布及Zeta 電位測定 粒徑是衡量納米乳形成與否的絕對標準，也是區分普通乳劑、亞納米乳和納米乳的重要指標，粒徑的分布是評價納米乳穩定性的最重要性質之一。

取新制備T-NE 溶液，用適量蒸餾水稀釋后，用Zetasizer ZS90 激光粒徑分析儀測定其粒徑、粒徑分布及Zeta電位。以上實驗重復3次。

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2.3.4含量測定 色譜柱：DiamonsilTMC18柱（200mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：純甲醇，磷酸調pH 3.1～3.9；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；α-TOS 檢測波長：284 nm；進樣量：10 μL。α-TOS 的峰面積和濃度滿足線性方程A=2.222 9C-4.702 7（r=0.999 9），在5.00 ～ 250 mg/L濃度范圍內，線性關系良好。

樣品溶液配制：吸取50 μL T-NE 于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，超聲破乳，5 000 r/min 離心5 min，取上清液即得樣品溶液，4 ℃冰箱保存備用。

取新鮮制備的3 份T-NE，按“樣品溶液配制”項下方法處理后，在上述色譜條件基礎上采用HPLC法測定T-NE制劑中α-TOS的含量。

2.3.5穩定性考察

2.3.5.1溫度 取新鮮制備的T-NE 密封于西林瓶中，分別在4、25、37 ℃不同溫度下放置，并于第5、10、20、40、60 、90 d 后的固定時間點取樣，并記錄T-NE的外觀和藥物含量變化。

2.3.5.2長期穩定性 取新鮮制備的T-NE 密封于西林瓶中，于常溫下放置9 個月，分別在3、6、9 個月后的固定時間點取樣，并記錄T-NE的外觀和藥物含量變化。

2.4 細胞活力實驗（MTT）

2.4.1細胞培養 將人乳腺癌細胞MCF-7、人卵巢癌細胞A2780 分別置于RPMI 1640 培養液（含10%新生胎牛血清FBS，青霉素、鏈霉素各100 U/mL）的75 cm3培養瓶中，在37 ℃、5%二氧化碳，以及飽和濕度條件下培養。

2.4.2MTT 實驗 分別取對數期MCF-7 和A2780用胰酶進行消化形成細胞懸液，進行細胞計數。用RPMI 1640 調整細胞懸液濃度為2.5×107個/升，將細胞懸液接種于96孔培養板，每孔接種100 μL。實驗設四組，分別將T-NE 和游離α-TOS（DMSO＜0.25%）溶液用RPMI 1640 稀釋成2、5、10、15、20 μmol/L 濃度作為制劑測試實驗組。配制α-TOS 在15 μmol/L和20 μmol/L 濃度下的T-NE 所對應空白納米乳溶液，并配制DMSO 的RPMI 1640，考察實驗所用最大濃度DMSO 對細胞活力是否產生影響。給藥的同時，建立細胞對照組（未加藥物處理）和陰性培養液空白對照組，每組6 個樣本。加藥后繼續培養48 h，將板中的培養液棄去，每孔中加MTT 溶液（5 g/L）20 μL，震蕩混勻后繼續培養4 h，棄上清，每孔加入DMSO100 μL 震蕩5 min 溶解結晶后，在全自動酶標儀上490 nm 處測定各孔的光密度值（OD），計算存活率。

存活率的計算公式：存活率（100%）=［（實驗組的OD 值-空白的OD 值）/（對照組的OD 值-空白的OD值）］×100%。

2.5 統計學方法本研究采用SPSS 25.0 統計軟件（美國IBM 公司）處理，計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 偽三元相圖優化處方由圖2 可知，隨著Km增大，納米乳區域逐漸增大，Km=3∶1 與Km=2∶1 時納米乳區域接近，Km=3∶1 時形成的納米乳黏度較大且制備過程中易形成凝膠，考慮到盡量減少表面活性劑用量的要求，選取最優Km 為2∶1。且當VE/TPGS=1∶2 時制得的納米乳較為均一透明，放置穩定性較好。以載藥量和澄清度為指標，結果得到納米乳處方最優處方：α-TOS、VE、TPGS、PEG 400質量比為1∶1∶2∶1、蒸餾水2 mL。

圖2 納米乳的偽三元相圖

3.2 T-NE 的制備采用乳化蒸發法制備出均一透明伴有藍乳光的T-NE。

3.3 制劑學性質評價

3.3.1納米乳類型的確定 T-NE 樣品染色發現，亞甲基藍擴散的速度明顯快于蘇丹紅，呈現均勻的深藍色，而蘇丹紅染料完全懸浮于樣品溶液上不擴散，表明所制備的T-NE為O/W型。

3.3.2形態學考察 結果如圖3 所示，表明制得的T-NE外觀形態呈類球型，大小均勻，表面光滑圓整，粒子間無粘連。

圖3 T-NE電鏡圖

3.3.3粒徑大小、分布和Zeta 電位 在最優處方工藝條件下，平行3 次制備T-NE，粒徑和Zeta 電位的測定結果見圖4 和圖5。納米乳平均粒徑為（258.8±3.48）nm，PDI 為0.136±0.03，平均Zeta 電位值為（-27.0±0.46）mV。表明新鮮制備的T-NE 分散性良好，粒徑較小且分布均一，穩定性較好，不易聚集。

圖4 T-NE的粒徑分布圖

圖5 T-NE的Zeta電位分布圖

3.3.4含量測定 新鮮制備的T-NE 的平均載藥量為（20.15±1.91）g/L，制得的納米乳載藥量較高。

3.3.5穩定性考察 由表1 可知，T-NE 在4 ℃和25 ℃條件下穩定性良好，90 d 外觀依舊保持均勻泛藍色乳光，且藥物含量未發生明顯變化。37 ℃條件下放置40 d 有絮結出現，可能和細菌滋生有關，在60 d 和90 d 出現破乳，部分α-TOS 析出。上述結果表明，T-NE 放置在4 ℃和25 ℃條件下保存較穩定。T-NE 在常溫下放置3、6、9 個月含量分別為（20.08±0.80）、（20.01±0.92）、（19.94±2.22）g/L，三組差異無統計學意義（P＞0.05），且外觀保持淡藍色均一乳狀液體，表明T-NE有較好的長期貯存穩定性。

表1 溫度對T-NE穩定性的影響（n=3，± s）

表1 溫度對T-NE穩定性的影響（n=3，± s）

時間5 d 20 d 40 d 60 d 90 d F值P值4 ℃25 ℃37 ℃外觀均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光含量/（g/L）20.14±2.82 19.98±1.78 19.89±2.57 19.98±0.42 20.07±1.80 0.65 0.637外觀均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光含量/（g/L）20.09±1.25 19.74±2.31 19.80±1.56 20.09±2.14 19.95±0.75 2.72 0.091外觀均勻、藍色乳光均勻、藍色乳光有絮結有絮結、沉淀有絮結、沉淀含量/（g/L）20.10±1.61 20.02±0.94 19.85±1.89 15.58±1.92 15.48±1.43 468.80＜0.001 F值0.04 2.16 0.12 581.80 893.60 P值0.956 0.197 0.891＜0.001＜0.001

3.4 MTT實驗為了驗證T-NE對MCF-7和A2780細胞活力的作用以及空白納米乳對α-TOS毒性作用的影響，進行了MTT實驗。結果見表2，3。

表2 不同藥物對MCF-7細胞作用48 h后細胞存活率（n=6，± s）

表2 不同藥物對MCF-7細胞作用48 h后細胞存活率（n=6，± s）

注：-表示不需要檢測。MCF-7為人乳腺癌細胞，DMSO為二甲基亞砜，T-NE為α-生育酚琥珀酸酯納米乳。

濃度5 μmol/L 10 μmol/L 15 μmol/L 20 μmol/L P值0.568 0.001＜0.001＜0.001空白納米乳DMSO------87.32±4.50 92.99±4.57 T-NE 101.96±10.59 78.88±5.30 65.62±2.35 31.17±8.91游離α-TOS 104.94±6.40 97.68±8.76 87.50±7.49 76.90±11.82

表3 不同藥物對A2780細胞作用48 h后細胞存活率（n=6，± s）

表3 不同藥物對A2780細胞作用48 h后細胞存活率（n=6，± s）

注：-表示不需要檢測。A2780 為人卵巢癌細胞，DMSO 為二甲基亞砜，T-NE為α-生育酚琥珀酸酯納米乳。

空白納米乳---濃度2 μmol/L 5 μmol/L 10μmol/L 15μmol/L DMSO---P值0.028 0.004 0.011＜0.001 87.61±3.52 97.15±4.24 T-NE 76.83±4.52 73.23±2.69 45.52±4.01 12.29±1.83游離 α-TOS 83.03±2.97 79.71±2.79 54.95±5.41 21.60±2.86

以MCF-7 細胞為模型，T-NE 的IC50值為16.68 μmol/L，在20 μmol/L 濃度下α-TOS游離藥物組細胞存活率仍為76.90%；以A2780 細胞為模型，T-NE 組較游離藥物組細胞存活率明顯下降，IC50值更小，是游離α-TOSIC50值（9.54 μmol/L）的 0.79 倍，且空白納米乳作用于上述兩種細胞48 h 后，細胞的存活率均大于80%，同時實驗所用濃度的DMSO 不會對細胞產生干擾。可以認為將α-TOS載入納米乳中能明顯提高藥物抑制腫瘤細胞增殖的能力，且空白納米乳基本無毒性作用，由此可見本實驗所制備的T-NE作為一種新劑型的藥物傳遞系統，能夠較好地發揮α-TOS的抗腫瘤作用。

4 討論

納米乳常規制備方法主要有高壓乳勻法、微乳法、乳化蒸發法、溶劑乳化法、薄膜-超聲分散法等。本實驗結合近年來國內外大量的文獻報道，通過對各種制備方法進行分析比較并結合本實驗室對納米制劑的研究經驗，最終選定了乳化蒸發法制備納米乳。乳化蒸發法與其他方法相比操作簡單、條件可控。由于α-TOS對光、熱敏感，所以在滴加油相的操作過程中應控制溫度不高于40 ℃且制備成功后避光保存，確保得到穩定且外觀均一澄清泛藍光的納米乳。

Gaonkar 等［18］用TPGS 做乳化劑得到的納米乳均有很高的載藥量和包封率。鑒于TPGS 優良的乳化性能和較高的安全性，結合前期研究［14］將乳化劑聚氧乙烯蓖麻油更換為TPGS，旨在規避其不良反應如急性超敏反應、神經毒性等［19］，同時提高α-TOS的溶解度和抗腫瘤效果。將油相油酸乙酯替換為VE，制備了新型的T-NE，并考察了Km 值對乳化區域的影響，結果表明用VE/TPGS/ PEG400=1∶2∶1 和水系統制備的納米乳體系性狀良好，為帶藍光的透明均一溶液，粒徑小且分布均勻，載藥量高達（20.15±1.91）g/L，且在4 ℃和25 ℃條件下保存90 d 依舊穩定不分層，且適合室溫長期貯存。

前期預實驗研究中MCF-7 和A2780 細胞系對α-TOS 相對比較敏感，因此MTT 實驗中將其作為細胞模型。結果表明將α-TOS 包載于納米乳中，能夠較好地發揮藥物抗腫瘤活性作用，最大濃度的空白納米乳處理后的細胞與陰性對照組相比沒有顯著差別。因此，空白納米乳在實驗中僅作為傳遞α-TOS 的載體，實驗中所觀察到的細胞毒性作用均由藥物本身引起，同時表明實驗濃度下天然的化合物輔料TPGS、VE 和PEG400 無細胞毒性作用，具有較好的安全性。

本實驗成功制備了T-NE，改善了α-TOS 的不足，并通過外觀、粒徑、類型、穩定性等對其進行了系統的表征；體外腫瘤細胞活性評價初步驗證明納米乳可以增強α-TOS 對腫瘤細胞的抑制作用，且理化性質滿足靜脈注射劑的要求，為α-TOS 的制劑開發和深入研究提供了參考。后期課題組會進一步考察其體外釋放試驗、流式細胞術、荷瘤鼠以及安全性試驗等，以期為其用于臨床研究提供理論基礎。