液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藍芩口服液中16種化學(xué)成分的含量

吳凡，陳輝，，張杞柳，湯道權(quán)

作者單位：1徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221004；2徐州市藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇 徐州 221002

藍芩口服液主要由板藍根、黃芩、梔子、黃柏、胖大海五味中藥經(jīng)一定的加工工藝制備而成。具有清熱解毒、利咽消腫等功效，目前已在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療上呼吸道感染等多種疾病，又多用于兒童用藥，因此，對其進行全面的質(zhì)量控制至關(guān)重要。由于藍芩口服液由多種中藥組成，中藥又具有多成分多靶點的特點，因此，藍芩口服液的療效是多種成分共同作用的結(jié)果，基于中藥的“君臣佐使”理論［1］，中藥的每種成分都可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此，較大范圍地檢測藍芩口服液的活性成分對藍芩口服液的質(zhì)量控制具有重要意義。但其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對梔子中的梔子苷進行質(zhì)量控制，不能科學(xué)、全面地反應(yīng)藍芩口服液的整體質(zhì)量。栗煥煥等［2］利用高效液相色譜法（HPLC）建立了鹽酸小檗堿、木蘭花堿等12 種成分的含量測定方法。陳輝等［3］利用雙波長高效液相色譜法建立了綠原酸、梔子苷等5 種成分的含量測定方法。孫燕等［4］利用HPLC 波長切換法建立了（R，S）-告依春、黃芩苷等4種成分的含量測定方法。但活性成分中有的紫外吸收弱，HPLC 方法無法對這些成分準(zhǔn)確定量。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）相較于HPLC 方法靈敏度更高，且沒有紫外吸收對化合物也能準(zhǔn)確定量。也有研究人員和筆者所在團隊曾利用LCMS/MS 法對藍芩口服液中的幾種成分進行定量分析［5-7］，但分析成分較少，無法全面反映整體質(zhì)量。

板藍根中的鳥苷、腺苷、胞苷、表告依春具有抗炎、抗病毒的藥理作用［8］，異牡荊苷具有止咳作用。黃芩中以黃酮類化合物為主的漢黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩素和黃芩素具有抗氧化、抗炎、抗?jié)兊人幚碜饔茫?-10］。梔子中的環(huán)烯醚萜苷類化合物為梔子的主要成分，梔子苷和山梔苷為其中的兩種，綠原酸為梔子中有機酸酯類化合物含量較高的一種［11］。黃柏中的主要成分為生物堿類化合物，其中巴馬汀、黃柏堿、木蘭花堿、小檗堿都具有抗炎作用［12-15］。另外結(jié)合高分辨質(zhì)譜對藍芩口服液的多組分表征［16］，最終本實驗確定了漢黃芩苷、黃芩苷、異牡荊苷、梔子苷、巴馬汀、黃柏堿、木蘭花堿、小檗堿、鳥苷、漢黃芩素、黃芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山梔苷和綠原酸等16種活性成分作為目標(biāo)，建立LC-MS/MS定量分析的測定方法，更加全面有效地對藍芩口服液進行質(zhì)量控制。也為其他藍芩制劑的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器與試劑

UPLC-MS/MS ACQUITY UPLC 和XevoTQ-S Micro 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國 Waters 公司）；XPRI0型電子天平（瑞士梅特勒公司）。

漢黃芩苷對照品（批號wkq22022807，含量98%）、黃芩苷對照品（批號wkq22010409，含量98%）、異牡荊苷對照品（批號wkq22051104，含量98%）、梔子苷對照品（批號wkq22011304，含量98%）、巴馬汀對照品（批號wkq22070507，含量98%）、鹽酸黃柏堿對照品（批號wkq22022407，含量98%）、木蘭花堿對照品（批號wkq21083001，含量98%）、鹽酸小檗堿對照品（批號wkq22010610，含量97.8%）、鳥苷對照品（批號wkq21042810，含量98%）、漢黃芩素對照品（批號wkq22012903，含量98%）、黃芩素對照品（批號wkq22030204，含量98%）、腺苷對照品（批號wkq22040708，含量98%）、胞苷對照品（批號wkq22021607，含量98%）、表告依春對照品（批號wkq22012803，含量98%）、山梔苷對照品（批號wkq22032806，含量98%）、綠原酸對照品（批號wkq22032106，含量98%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；藍苓口服液（江蘇揚子江制藥有限公司，批號21080331，21011032，21081081，21081182，21071821；規(guī)格10 mL）；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純；水為屈臣氏蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為FortisXi C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，95%A；2～5 min，92%→85% A；5～7 min，85%→70% A；7～10 min，70%→65% A；10～11 min，65%→60% A；11～12 min，60%→30% A；12～13 min，30%→5% A；13～15 min，5% A；15～15.1 min，5%→95% A；15.1～18 min，95% A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；總運行時間18 min；進樣量：2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件脫溶劑氣：氮氣（600L/h）；毛細(xì)管電壓：2.5 kV（正離子模式）和2.0 kV（負(fù)離子模式）；離子源：ESI 源；離子源溫度：150 ℃去溶劑溫度：550 ℃。多反應(yīng)檢測（MRM）方式進行定量分析。離子化模式見表1。

表1 藍芩口服液16種化合物的離子化模式

2.3 混合對照品儲備溶液的制備分別精密稱取漢黃芩苷、黃芩苷、異牡荊苷、梔子苷、巴馬汀、黃柏堿、木蘭花堿、小檗堿、鳥苷、漢黃芩素、黃芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山梔苷和綠原酸對照品適量，用甲醇溶解，配成濃度分別為0.512，0.563，0.576，0.596，0.580，0.592，0.537，0.526，0.539，0.521，0.537，0.536，0.528，0.567， 0.586，0.526 g/L的單一成分對照品儲備液。精密量取16 種單一對照品儲備液適量制成漢黃芩苷、黃芩苷、異牡荊苷、梔子苷、巴馬汀、黃柏堿、木蘭花堿、小檗堿、鳥苷、漢黃芩素、黃芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山梔苷和綠原酸濃度分別為 51.20，157.6，0.144 0，447.0，0.812 0，8.288，7.518，7.364，0.970，7.294，7.518，7.504，1.056，7.938，8.204，7.364 mg/L 的混合對照品儲備溶液。

2.4 供試品溶液的制備精密量取藍苓口服液（批號21080331）3 mL 置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。進樣前用0.22 μm 的濾膜過濾，待進樣分析。

2.5 專屬性試驗精密量取“2.3”項下的混合對照品儲備液5 mL 至25 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液，分別精密移取空白溶劑、混合對照品溶液和供試品溶液各2 μL。按照“2.1”項下色譜條件和“2.2”項下質(zhì)譜條件進樣分析，得到空白溶劑、藍苓口服液中16 種活性成分的混合對照品、供試品溶液的NMR 色譜圖。結(jié)果顯示，在18 min 內(nèi)，16 種活性成分分離良好無干擾，且峰形良好。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定、線性范圍及檢出限取“2.3”項下混合對照品儲備溶液，逐級稀釋成系列不同濃度的對照品溶液，進樣測定。以對照品濃度（x）為橫坐標(biāo)，對照品峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對其進行線性回歸分析。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，16 種化合物在各自的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。由檢測限和定量限結(jié)果可以看出，本方法靈敏度較高。

表2 藍芩口服液16種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.7 儀器精密度試驗取“2.5”項下混合對照品溶液進樣分析，連續(xù)進樣6次，每次2 μL，記錄峰面積，結(jié)果漢黃芩苷、黃芩苷、異牡荊苷、梔子苷、巴馬汀、黃柏堿、木蘭花堿、小檗堿、鳥苷、漢黃芩素、黃芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山梔苷和綠原酸峰面積RSD 分別為2.31%，1.62%，1.95%，1.86%，1.43%，1.06%，2 .08%，1.22%，1.99%，1.32%，1.09%，1.12%，2.11%，1.52%，1.95%，1.36%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗按“2.4”項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h 進樣2 μL 測定。計算漢黃芩苷、黃芩苷、異牡荊苷、梔子苷、巴馬汀、黃柏堿、木蘭花堿、小檗堿、鳥苷、漢黃芩素、黃芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山梔苷和綠原酸含量的 RSD 分別為1.41%，1.87%，1.56%，1.06%，1.08%，0.99%，2.08%，1.67%，1.34%，1.04%，1.09%，1.29%，2.07%，1.25%，1.97%，1.26%。表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗按“2.4”項下方法平行制備6 份供試品溶液，依法進樣分析，計算得漢黃芩苷、黃芩苷、異牡荊苷、梔子苷、巴馬汀、黃柏堿、木蘭花堿、小檗堿、鳥苷、漢黃芩素、黃芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山梔苷和綠原酸平均含量分別為0.348，1.054，0.004，3.014，0.008，0.066，0.056，0.054，0.007，0.060，0.057，0.053，0.009，0.053，0.066，0.059g/L，RSD 分別為2.03%，1.89%，1.93%，2.06%，1.83%，1.96%，2.08%，1.83%，1.28%，2.34%，1.39%，2.26%，2.28%，1.73%，1.57%，1.93%。表明方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗分別精密量取供試品0.75mL 至50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別精密加入“2.3”項下的混合對照品儲備溶液2.5、5、7.5 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成低中高三種濃度，每個濃度平行3 份，總共9 份，進樣測定分析，記錄峰面積，計算加樣回收率。16 種活性成分的回收率為91.7%～ 108.3%，表明該方法回收率良好。結(jié)果見表3。

表3 藍芩口服液中16種成分的回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.11 樣品的含量測定分別測定5 個批號藍苓口服液中16種化合物的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果/（n=5，g/L）

從結(jié)果可以看出，不同批號間16種活性成分含量差異較大，可能是原料、儲存運輸?shù)葪l件的差異造成的。因此對藍苓口服液進行多組分的定量檢測是十分必要的。

3 討論

3.1 流動相的選擇水相比較了水、0.1%甲酸溶液、0.01 mol/L 醋酸銨溶液，發(fā)現(xiàn)水相中加入少量的甲酸后，各化合物均具有較好地響應(yīng)。

有機相比較了乙腈和甲醇溶液，在乙腈系統(tǒng)下，各化合物峰形更好。通過優(yōu)化色譜梯度條件，能夠在18 min分離檢測到16種成分，使檢測效率顯著提高。

3.2 色譜柱的選擇較好的分離可以避免化合物間的干擾，提高質(zhì)譜響應(yīng)。但由于檢測成分較多，常規(guī)液相色譜柱分析時間太長。為了提高效率，我們選擇小內(nèi)徑和粒徑的超高壓色譜柱，在保證有效分離的同時大大縮短分析時間。我們比較了Fortis Xi C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Kromasil C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和WatersBEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），三種色譜柱均具有較好的分離效果，說明色譜條件耐用性較好。為了和前期研究相統(tǒng)一，我們最終選擇了Fortis Xi C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化筆者通過多次單獨優(yōu)化各成分的錐孔電壓和碰撞能量，根據(jù)質(zhì)譜響應(yīng)確定定量離子對，山梔苷和綠原酸在負(fù)離子模式下基線噪音更小，檢出限更低，質(zhì)譜響應(yīng)更高，故對山梔苷和綠原酸在負(fù)離子模式下進行定量分析。

3.4 結(jié)果分析現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)僅要求梔子苷的含量不得少于2.50 g/L，由檢測結(jié)果得知5 個批次均符合標(biāo)準(zhǔn)的要求。另外，由檢測結(jié)果可看出，藍芩口服液中梔子苷、黃芩苷和漢黃芩苷含量較高，梔子中的梔子苷和黃芩中的黃芩苷、漢黃芩苷可能是藍芩口服液發(fā)揮療效的主要成分。異牡荊苷、巴馬汀、鳥苷和胞苷含量較低，且胞苷無紫外吸收，通過HPLC 無法對其進行檢測，在藍芩口服液的現(xiàn)有研究報道中未發(fā)現(xiàn)對巴馬汀的定量分析，因此，本實驗所建立的含量測定方法成功測定藍芩口服液中的微量成分對藍芩口服液的質(zhì)量控制研究具有重要意義。但由檢測結(jié)果可以明顯看出，16 種活性成分批次間含量差異較大，在生產(chǎn)藍芩口服液時應(yīng)該在其原材料水平上進行嚴(yán)格質(zhì)量控制，以保證各批產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。由于中藥成分極其復(fù)雜多樣，故只對其中一種成分進行含量要求無法安全、有效、全面地對藍芩口服液進行質(zhì)量控制，因此，對藍芩口服液進行多組分定量分析是十分必要的。