長鏈非編碼RNA OPA相互作用蛋白5反向轉(zhuǎn)錄序列1靶向調(diào)控微RNA-128-3p對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

鄭留昌，崔發(fā)財，鄭培明，趙偉鋒

作者單位：鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，a檢驗科，b腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450003

惡性腫瘤一直是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的主要原因，2022年中國新發(fā)腫瘤病人482萬，新增腫瘤死亡病人321萬，其中結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率和病死率已升至第2 位和第5 位，且相比以往有逐年增高趨勢，這嚴(yán)重危害了國人的生命健康［1］。結(jié)直腸由于其特殊的解剖學(xué)特點，癌細(xì)胞可以通過淋巴、血液、腹膜或鄰近組織器官浸潤等多種形式進(jìn)行播散和轉(zhuǎn)移，研究報道約20%的CRC 病人在診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，約50%的最初局部病變病人將發(fā)展為轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響結(jié)直腸癌病人遠(yuǎn)期預(yù)后的重要因素［2-3］，因此闡明結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制和篩選有效的分子靶標(biāo)將極大幫助結(jié)直腸癌的診斷和治療。研究表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與表觀遺傳重構(gòu)、mRNA剪切和翻譯、蛋白質(zhì)定位和活化等過程中發(fā)揮重要作用［4］，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。OPA 相互作用蛋白5 反向轉(zhuǎn)錄序列1（OIP5-AS1）是新發(fā)現(xiàn)的一種定位于染色體15q15.1 的非編碼RNA，在非小細(xì)胞肺癌［6］、宮頸癌［7］、食管癌［8］等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程， 被認(rèn)為作為致癌基因發(fā)揮作用。miR-128-3p 被證實在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌基因功能，其表達(dá)下調(diào)與結(jié)直腸癌EMT 進(jìn)程［9］和腫瘤化療耐藥性相關(guān)［10］。本課題組前期通過ENCORI 軟件分析發(fā)現(xiàn)lncRNA OIP5-AS1 與miR-128-3p 間存在靶向結(jié)合位點，由于目前l(fā)ncRNA OIP5-AS1 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其影響結(jié)直腸癌進(jìn)展的機制尚未有研究報道，因此本研究旨在分析lncRNA OIP5-AS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其靶向調(diào)控miR-128-3p 對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，為闡明結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供有價值的理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 一般資料根據(jù)樣本量計算公式：N=Z2×［P×（1-P）］/E2，將置信區(qū)間Z 設(shè)定為1.96，概率值P設(shè)為90%，允許誤差設(shè)定在10%以內(nèi)，得出本研究所需樣本量最少為 35例。選取2017年1月至2018年12月在鄭州大學(xué)人民醫(yī)院住院并進(jìn)行手術(shù)治療的38 例結(jié)直腸病人作為研究對象，收集病人經(jīng)手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織（距癌組織邊緣 ＞2 cm）樣本并凍存于液氮罐中。結(jié)直腸癌病人納入標(biāo)準(zhǔn)［11］：（1）病人術(shù)前未接受其他任何形式的抗腫瘤治療；（2）所有病人均為首次診斷結(jié)直腸癌和實施首次手術(shù)；（3）所有病人臨床資料完整且術(shù)后組織病理由2 位病理科醫(yī)師共同診斷為結(jié)直腸癌；（4）病人沒有精神性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病人既往或現(xiàn)在伴發(fā)其他類型腫瘤；（2）病人有嚴(yán)重器質(zhì)性疾病；（3）病人患有潰瘍性結(jié)腸炎、急性或慢性胃腸道炎癥以及自身免疫性疾病。38 例結(jié)直腸癌病人中，男性23 例，女性15 例；年齡范圍為39～76 歲，年齡（57.8±6.9）歲；病理組織學(xué)分級Ⅰ～Ⅱ級25 例，Ⅲ～Ⅳ級13 例；參考美國腫瘤聯(lián)合委員會（AJCC）第8 版結(jié)直腸癌TNM 分期：Ⅰ期7 例，Ⅱ期13 例，Ⅲ期18 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18 例。所有病人或其近親屬均簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 細(xì)胞與試劑LoVo 細(xì)胞和HT-29 細(xì)胞購自上海慧穎生物科技有限公司，SW620、SW480 和FHC細(xì)胞保存在鄭州大學(xué)人民醫(yī)院中心實驗室。0.25%胰酶、新生小牛血清（NBCS）、RPMI1640 系列培養(yǎng)基、LipofectamineTM3000及雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒均為賽默飛公司旗下產(chǎn)品；RNA-easy Isolation 試劑、通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV）、高特異性染料法定量PCR 檢測試劑盒（AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix）購自諾唯贊生物科技公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，兔抗人單克隆抗體［細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）蛋白、E2F1 和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）］，山羊抗兔二抗（HPR 標(biāo)記）均購自武漢菲恩生物科技公司；miR-128-3p 模擬物（miR-128-3p mimic）、miR-128-3p抑制物（miR-128-3p inhibitor）、OIP5-AS1 小干擾RNA（si-OIP5-AS1）及相關(guān)陰性對照均由上海禾午生物科技有限公司設(shè)計合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染37 ℃，5%二氧化碳條件下用RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%FBS 和100 g/L 鏈霉素）培養(yǎng)實驗細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109個/升，6孔板鋪板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時，按照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并在48 h 后檢測轉(zhuǎn)染效率。根據(jù)轉(zhuǎn)染物和實驗?zāi)康膶W620 細(xì)胞分為si-OIP5-AS1 組、si-NC 組、 miR-128-3p mimic 組、mimic-NC 組、miR-128-3p inhibitor+ si-OIP5-AS1組和inhibitor-NC+ si-OIP5-AS1 組。

1.4 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測采用RNAeasy Isolation 試劑提取CRC 組織及細(xì)胞的總RNA，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA 生成cDNA，采用AceQ?qPCR SYBR Green Master 試劑盒在ABI 7500 熒光PCR 儀上進(jìn)行擴增，條件為： 95 ℃ 預(yù)變性10 min 后繼續(xù)變性20 s，56 ℃退火25 s，71 ℃延伸 20 s，擴增循環(huán)46 次。采用2-ΔΔCt法計算LncRNA OIP5-AS1 和miR-128-3p 的相對表達(dá)量。LncRNA OIP5-AS1 和miR-128-3p啟動子序列信息見表1。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

1.5 克隆形成實驗將處于對數(shù)增長期的各實驗組細(xì)胞以1×103個/孔接種至6孔板并連續(xù)培養(yǎng)14 d，中途每隔3 d 進(jìn)行培養(yǎng)基更換并觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)結(jié)束后用PBS 清洗、多聚甲醛固定并進(jìn)行結(jié)晶紫染色，繼續(xù)PBS 洗滌3 次，晾干后在顯微鏡下觀察并用數(shù)碼相機拍照，一個克隆點超過50個細(xì)胞被稱為克隆細(xì)胞。實驗重復(fù)3次。

1.6 CCK-8實驗調(diào)整各實驗組細(xì)胞濃度為3×108個/升，96 孔板每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，然后向每孔中添加10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值［D（λ）450 nm］。實驗重復(fù)3次。

1.7 劃痕愈合實驗各實驗組細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)100%時，用10 μL移液器槍頭在培養(yǎng)孔底部正中垂直劃一條直線，空白組作為對照，繼續(xù)孵育48 h 后，測量劃痕寬度并計算愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次。

1.8 Transwell 實驗參考使用說明書將Matrigel膠預(yù)先包被于transwell 小室上室，將各實驗組細(xì)胞用無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2×107/L，取100 μL 加入上室，下室培養(yǎng)基中額外加入10%NBCS，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。PBS 清洗下室2 次，風(fēng)干后直接用0.1%結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野，計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，計算平均值。實驗重復(fù)3次。

1.9 雙螢光素酶報告實驗采用ENCORI 軟件（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測LncRNA OIP5-AS1 和miR-128-3p 間的靶向結(jié)合位點，并設(shè)計合成野生型和突變型報告基因質(zhì)粒（OIP5-AS1-WT和OIP5-AS1-MUT）。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時，將報告基因質(zhì)粒、miR-128-3p mimic 和內(nèi)參phRL-TK（轉(zhuǎn)染量40∶1）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h 后，采用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光活性。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法收集各實驗組細(xì)胞用裂解液提取總蛋白，繪制BCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE 電泳膠，進(jìn)行蛋白上樣、分離和轉(zhuǎn)膜，TBST 封閉后，將PVDF 膜與E-cadherin 一抗（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）一抗和Vimentin（1∶800）一抗、cyclin D1（1∶600）一抗和E2F1（1∶800）一抗和GAPDH 一抗（1∶2 000）放置冷藏冰箱孵育過夜，TBST 漂洗后，加入山羊抗兔二抗（1∶2 000）繼續(xù)孵育1.5 h，用ECL試劑使PVDF膜顯影，采用image J進(jìn)行條帶分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0 和Graphpad prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組間均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用pearson 檢驗分析LncRNA OIP5-AS1 和miR-128-3p 表達(dá)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA OIP5-AS1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)LncRNA OIP5-AS1在結(jié)直腸癌組織中的相對表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，其在結(jié)直腸癌細(xì)胞株（SW480、SW620、HT-29 和LoVo）中的相對表達(dá)水平顯著高于FHC 細(xì)胞，見表2，表3。上述結(jié)果表明lncRNA OIP5-AS1 異常表達(dá)可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。另外，由于lncRNA OIP5-AS1 在SW620 細(xì)胞中有著更高的表達(dá)水平，被用于后續(xù)實驗研究。

表2 LncRNA OIP5-AS1和miR-128-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況/± s

表2 LncRNA OIP5-AS1和miR-128-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況/± s

注：lncRNA OIP5-AS1 為長鏈非編碼RNA OPA 相互作用蛋白5反向轉(zhuǎn)錄序列1，miR-128-3p為微RNA-128-3p。

miR-128-3p 表達(dá)1.52±0.39 0.72±0.21 8.20＜0.001組別癌旁組織癌組織t值P值例數(shù)38 38 LncRNA OIP5-AS1 表達(dá)0.98±0.29 1.42±0.40 5.46＜0.001

表3 LncRNA OIP5-AS1和miR-128-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況/± s

表3 LncRNA OIP5-AS1和miR-128-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況/± s

注：lncRNA OIP5-AS1 為長鏈非編碼RNA OPA 相互作用蛋白5反向轉(zhuǎn)錄序列1，miR-128-3p為微RNA-128-3p。①與FHC細(xì)胞比較，P＜0.05。② 與FHC細(xì)胞比較，P＜0.01。

miR-128-3p 表達(dá)0.70±0.15①0.46±0.03②0.59±0.14①0.74±0.09①1.02±0.11 10.42 0.001組別SW480細(xì)胞SW620細(xì)胞HT-29細(xì)胞LoVo細(xì)胞FHC細(xì)胞F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 LncRNA OIP5-AS1 表達(dá)1.60±0.25①2.19±0.33②1.62±0.23①1.95±0.20②1.05±0.10 10.29 0.001

2.2 miR-128-3p 在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)miR-128-3p 在結(jié)直腸癌組織中的相對表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，其在結(jié)直腸癌細(xì)胞株（SW480、SW620、HT-29 和LoVo）中的相對表達(dá)水平顯著低于FHC 細(xì)胞。上述結(jié)果表明，miR-128-3p 的異常表達(dá)也與結(jié)直腸癌的進(jìn)展過程有關(guān)。見表2，3。

2.3 LncRNA OIP5-AS1表達(dá)下調(diào)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染si-OIP5-AS1可有效抑制SW620 細(xì)胞中LncRNA OIP5-AS1 的表達(dá)，si-OIP5-AS1 組的細(xì)胞增殖活性、克隆細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率及E2F1、cyclin D1、vimentin 和Ncadherin 蛋白表達(dá)均顯著低于si-NC 組（均P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著高于si-NC 組（P＜0.05），見表4，5。

表4 lncRNA OIP5-AS1表達(dá)下調(diào)后SW620細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化/± s

表4 lncRNA OIP5-AS1表達(dá)下調(diào)后SW620細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化/± s

注：lncRNA OIP5-AS1為長鏈非編碼RNA OPA相互作用蛋白5反向轉(zhuǎn)錄序列1，Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1。

組別si-NC si-OIP5-AS1 t值P值LncRNA OIP5-AS1表達(dá)1.05±0.16 0.51±0.15 4.18 0.014細(xì)胞增殖吸光度/D（λ）450 nm 24 h 0.57±0.04 0.53±0.03 1.18 0.302 cyclin D1表達(dá)0.90±0.17 0.38±0.08 18.45 0.003重復(fù)次數(shù)3 3 48 h 0.69±0.06 0.58±0.02 2.99 0.040 72 h 0.84±0.07 0.65±0.06 3.56 0.024克隆細(xì)胞數(shù)55.33±8.32 33.33±5.51 3.82 0.019 E2F1表達(dá)0.82±0.11 0.45±0.13 5.87 0.028

表5 lncRNA OIP5-AS1表達(dá)下調(diào)后SW620細(xì)胞侵襲遷移能力和EMT相關(guān)蛋白變化/± s

表5 lncRNA OIP5-AS1表達(dá)下調(diào)后SW620細(xì)胞侵襲遷移能力和EMT相關(guān)蛋白變化/± s

注：lncRNA OIP5-AS1 為長鏈非編碼RNA OPA 相互作用蛋白5 反向轉(zhuǎn)錄序列1，E-cadherin 為E-鈣黏蛋白，N-cadherin 為N-鈣黏蛋白，Vimentin為波形蛋白。

Vimentin表達(dá)0.90±0.17 0.38±0.08 5.11 0.036組別si-NC si-OIP5-AS1 t值P值重復(fù)次數(shù)3 3侵襲細(xì)胞數(shù)239.7±17.0 126.0±22.0 7.08 0.002劃痕愈合率/%80.93±8.43 37.60±6.16 7.19 0.002 E-cadherin表達(dá)0.76±0.32 1.03±0.09 4.53 0.045 N-cadherin表達(dá)0.82±0.11 0.45±0.13 17.97 0.003

2.4 miR-128-3p 表達(dá)上調(diào)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic 可顯著上調(diào)結(jié)SW620 細(xì)胞中miR-128-3p 的表達(dá)，miR-128-3p mimic 組的細(xì)胞活性、克隆細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率及E2F1、cyclin D1、vimentin 和N-cadherin蛋白表達(dá)均顯著低于mimic-NC 組（均P＜0.05），Ecadherin 蛋白表達(dá)顯著高于mimic-NC 組（P＜0.05），見表6，7。

表6 miR-128-3p表達(dá)上調(diào)后SW620細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化/± s

表6 miR-128-3p表達(dá)上調(diào)后SW620細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化/± s

注：miR-128-3p為微RNA-128-3p，Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1。

組別mimic-NC miR-128-3p mimic t值P值細(xì)胞增殖吸光度/D（λ）450 nm 24 h 0.59±0.04 0.55±0.04 0.96 0.391 cyclin D1表達(dá)0.81±0.08 0.42±0.10 7.40 0.018重復(fù)次數(shù)3 3 miR-128-3p表達(dá)1.08±0.17 1.68±0.23 3.60 0.023 48 h 0.73±0.04 0.63±0.02 3.59 0.023 72 h 0.89±0.06 0.69±0.01 5.76 0.005克隆細(xì)胞數(shù)40.00±4.00 25.67±4.93 3.91 0.017 E2F1表達(dá)0.88±0.16 0.39±0.11 11.48 0.008

表7 miR-128-3p表達(dá)上調(diào)后SW620細(xì)胞侵襲遷移能力和EMT相關(guān)蛋白變化/± s

表7 miR-128-3p表達(dá)上調(diào)后SW620細(xì)胞侵襲遷移能力和EMT相關(guān)蛋白變化/± s

注：miR-128-3p為微RNA-128-3p，E-cadherin為E-鈣黏蛋白，N-cadherin為N-鈣黏蛋白，Vimentin為波形蛋白。

組別mimic-NC miR-128-3p mimic t值P值Vimentin表達(dá)1.04±0.17 0.49±0.04 5.03 0.037重復(fù)次數(shù)3 3侵襲細(xì)胞數(shù)259.7±33.6 146.3±11.2 5.54 0.005劃痕愈合率/%81.93±6.37 39.72±5.12 8. 95 0.001 E-cadherin表達(dá)0.68±0.04 0.98±0.05 11.64 0.007 N-cadherin表達(dá)0.97±0.06 0.61±0.06 5.51 0.031

2.5 LncRNA OIP5-AS1 靶向調(diào)控miR-128-3p 的表達(dá)Pearson 相關(guān)性檢驗顯示miR-128-3p 和LncRNA OIP5-AS1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.31，P=0.005），提示LncRNA OIP5-AS1 和miR-128-3p 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制中可能存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。LncRNA OIP5-AS1 和miR-128-3p 間的靶向結(jié)合位點，見圖1。

圖1 miR-128-3p和LncRNA OIP5-AS1間靶向結(jié)合位點

將OIP5-AS1-WT 質(zhì)粒或OIP5-AS1-MUT 質(zhì)粒與miR-128-3p mimic 共轉(zhuǎn)染SW620 細(xì)胞，前者熒光活性較陰性對照組顯著降低（0.72±0.08 比1.08±0.17，t=6.28，P=0.024），后者較對照組無明顯改變（t=0.74，P=0.538）。

2.6 下調(diào)miR-128-3p逆轉(zhuǎn)LncRNA OIP5-AS1敲除對結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移影響將miR-128-3p inhibitor及陰性對照inhibitor-NC 分別與si-OIP5-AS1 共轉(zhuǎn)染SW620 細(xì)胞后，si-OIP5-AS1+miR-128-3p inhibitor 組miR-128-3p 表達(dá)水平顯著低于si-OIP5-AS1+inhibitor-NC 組，但兩組間lncRNA OIP5-AS1 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor 可下調(diào)miR-128-3p 表達(dá)水平，但不會對lncRNA OIP5-AS1 表達(dá)造成影響。si-OIP5-AS1+ miR-128-3p inhibitor 組的細(xì)胞活性、克隆細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率及E2F1、cyclin D1、vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)均顯著高于si-OIP5-AS1+inhibitor-NC 組（均P＜0.05），Ecadherin 蛋白表達(dá)顯著低于si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組（P＜0.05），見表8，9。

表8 共轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor和si-OIP5-AS1后SW620細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白變化/± s

表8 共轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor和si-OIP5-AS1后SW620細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白變化/± s

注：lncRNA OIP5-AS1 為長鏈非編碼RNA OPA 相互作用蛋白5 反向轉(zhuǎn)錄序列1，miR-128-3p 為微RNA-128-3p，Cyclin D1 為細(xì)胞周期蛋白D1。

組別重復(fù)次數(shù)克隆細(xì)胞數(shù)LncRNA OIP5-AS1表達(dá)0.49±0.07 0.57±0.05 1.16 0.252 E2F1表達(dá)細(xì)胞增殖吸光度/D（λ）450 nm 24 h 0.55±0.04 0.58±0.04 0.86 0.439 miR-128-3p表達(dá)1.01±0.13 0.70±0.12 3.13 0.035 cyclin D1表達(dá)0.39±0.04 0.74±0.07 56.02＜0.001 si-OIP5-AS1+inhibitor-NC si-OIP5-AS1+miR-128-3p inhibitor t值P值3 3 48 h 0.62±0.05 0.72±0.04 2.98 0.041 72 h 0.68±0.04 0.82±0.05 3.49 0.025 34.00±2.00 43.33±2.08 5.60 0.005 0.42±0.08 0.71±0.08 6.93 0.020

表9 共轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor和si-OIP5-AS1后SW620細(xì)胞侵襲遷移能力和EMT相關(guān)蛋白變化/± s

表9 共轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor和si-OIP5-AS1后SW620細(xì)胞侵襲遷移能力和EMT相關(guān)蛋白變化/± s

注：lncRNA OIP5-AS1 為長鏈非編碼RNA OPA 相互作用蛋白5 反向轉(zhuǎn)錄序列1，miR-128-3p 為微RNA-128-3p，E-cadherin 為E-鈣黏蛋白，N-cadherin為N-鈣黏蛋白，Vimentin為波形蛋白。

Vimentin表達(dá)0.44±0.03 0.67±0.02 18.63 0.003組別si-OIP5-AS1+inhibitor-NC si-OIP5-AS1+miR-128-3p inhibitor t值P值重復(fù)次數(shù)3 3侵襲細(xì)胞數(shù)133.3±13.2 243.0±22.1 7.38 0.002劃痕愈合率/%31.60±5.36 78.30±5.74 10. 30 0.001 E-cadherin表達(dá)0.91±0.06 0.68±0.04 5.56 0.031 N-cadherin表達(dá)0.55±0.06 0.79±0.05 6.17 0.025

3 討論

LncRNA 是非編碼RNA 的主要成員，它本身不具備蛋白編碼功能，但能在基因表達(dá)調(diào)節(jié)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞代謝、生長、分化和凋亡等多種生物途徑的調(diào)控［12］。近年來研究表明，lncRNA 表達(dá)失調(diào)與CRC 的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，這為CRC 診斷、治療及預(yù)后評估相關(guān)生物標(biāo)志物的篩選提供了新的研究思路。 例如，Song 等［13］發(fā)現(xiàn)LncRNA MCM3AP-AS1 在結(jié)直腸癌病人組織、細(xì)胞及外周血中的表達(dá)均有顯著升高，它與病人的臨床病理分期和預(yù)后相關(guān)，并在預(yù)測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)方面具有較好的靈敏度和特異度；Kuang 等［14］報道lncRNAs AC156455.1 和AC104532.2 可作為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，并有可能成為免疫治療的設(shè)計靶點；此外，Zhang 等［15］篩選并建立了一組N6 腺苷甲基化（m6A）相關(guān)lncRNA，在預(yù)測結(jié)直腸癌病人的無病生存期方面有一定應(yīng)用價值。OIP5-AS1 是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，研究顯示其在卵巢癌［16］中異常高表達(dá)，敲降其表達(dá)可導(dǎo)致整合素α6（ITGA6）表達(dá)降低，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。LncRNA OIP5-AS1在胰腺癌中也處于異常高表達(dá)狀態(tài)，其通過調(diào)控叉頭框蛋白M1（FOXM1）/Wnt/β-catenin 信號通路影響胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［17］。此外，研究報道lncRNA OIP5-AS1 高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌［18］化療耐藥相關(guān)，并是影響肺腺癌［19］病人預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。本研究首次發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1 在結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高，通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA 抑制OIP5-AS1 表達(dá)后，結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞的克隆數(shù)量、增殖活性、侵襲細(xì)胞數(shù)及劃痕愈合率均較對照組顯著降低，表明OIP5-AS1在結(jié)直腸癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮癌基因作用。cyclin D1 和E2F1 是細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵蛋白，它們的異常表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控功能紊亂，細(xì)胞增殖失控，從而導(dǎo)致癌癥發(fā)生。本研究中，沉默OIP5-AS1 表達(dá)后，SW620 細(xì)胞中cyclin D1 和E2F1 表達(dá)水平相應(yīng)降低，表明lncRNA OIP5-AS1 通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞特性獲得及免疫逃逸方面均發(fā)揮重要作用，E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 是其特征性標(biāo)志物。本研究中，沉默OIP5-AS1 表達(dá)后，SW620 細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)升高，Vimentin 和N-cadherin 表達(dá)降低，EMT進(jìn)程被逆轉(zhuǎn)，表明lncRNA OIP5-AS1通過調(diào)控EMT 進(jìn)程影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移過程。

miR-128-3p 能抑制人體多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，被認(rèn)為是一種具有廣泛抑癌作用的微RNA，如華科雷等［20］發(fā)現(xiàn)miR-128-3p 在胃癌組織中低表達(dá)，其通過靶向CLDN18 抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力；Shi 等［21］發(fā)現(xiàn)miR-128-3p 在肝癌組織中低表達(dá)，其通過靶向CDC6 抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，miR-128-3p 在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，這與相關(guān)研究結(jié)果一致，提示其在結(jié)直腸癌的進(jìn)展過程中也發(fā)揮抑癌基因作用。轉(zhuǎn)染miR-128-3p 模擬物上調(diào)其表達(dá)后，cyclin D1、E2F1、Vimentin 和N-cadherin 的表達(dá)較對照組顯著降低， E-cadherin 表達(dá)顯著升高， SW620 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力得到有效抑制，表明miR-128-3p 也可通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白及EMT 蛋白表達(dá)影響結(jié)直腸癌的增殖及遷移過程。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)lncRNA OIP5-AS1和miR-128-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩者間相互作用是影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要機制。研究［22］表明，LncRNA 作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），能發(fā)揮“miRNA 分子海綿”的作用，吸附和抑制miRNA 表達(dá)，提高miRNA 靶基因的表達(dá)，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制中一個新的研究方向。例如，lncRNA PVT1 靶向調(diào)控miR-128-3p 的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移［23］，lncRNA HCP5 靶向調(diào)控miR-128-3p 的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌的進(jìn)展［24］，LINC00467 靶向調(diào)控miR-128-3p 的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌的血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移［25］。本研究結(jié)果表明lncRNA OIP5-AS1和miR-128-3p間存在靶向結(jié)合位點，雙螢光素酶報告實驗證實lncRNA OIP5-AS1 靶向調(diào)控miR-128-3p 表達(dá)，在沉默OIP5-AS1 表達(dá)的同時抑制miR-128-3p 的表達(dá)，SW620 細(xì)胞中cyclin D1、E2F1、Vimentin 和N-cadherin 表達(dá)升高， E-cadherin 表達(dá)降低，沉默OIP5-AS1 表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用被逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果表明，lncRNA OIP5-AS1 對miR-128-3p 的靶向調(diào)控可能是其參與結(jié)直腸癌進(jìn)展過程的重要途徑。

綜上所述，lncRNA OIP5-AS1 在結(jié)直腸癌中異常高表達(dá)，沉默OIP5-AS1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，這可能與它對miR-128-3p 的靶向調(diào)控有關(guān)。