微RNA-30d-5p通過調控ABCB5對胰腺癌進程的影響

鄭堅江，阿木提江·馬合木提，郭磊，劉躍全，張濤

作者單位：新疆維吾爾自治區人民醫院胰腺外科，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830001

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma， PAAD）是消化系統的高度惡性腫瘤。其中位生存期為3～6個月，5 年生存率低于5%。盡管手術切除和輔助用藥的治療效果已經取得了進展，但胰腺癌的生存率在過去幾十年中并沒有明顯提高［1］。最新流行病學調查報告稱，胰腺癌是全球第12位最常見的腫瘤和第4 位腫瘤殺手。在中國，胰腺癌的發病率逐年增加。胰腺癌早期的非典型癥狀和缺乏敏感的腫瘤生物標志物導致失去最佳手術機會。尋找高度特異性和有效的胰腺癌生物標志物以提高手術切除率是當務之急［2-3］。除了臨床和病理預測因素外，胰腺癌的分子亞型也越來越受到重視。分子譜分析技術揭示了癌基因和抑癌基因對癌癥發展、轉移模式、治療反應和預后的影響。

微RNA（miRNA）是小的非編碼RNA分子（包含約22個核苷酸），在 RNA 沉默和基因表達的轉錄后調控中發揮作用。它通過與靶基因結合的方式以調節基因表達，在癌細胞的增殖、凋亡和轉移中起關鍵作用［4-5］。最近，發現許多miRNA在人類惡性腫瘤中失調，包括肺癌、乳腺癌、結腸癌和胰腺癌等［6-8］。最近研究發現miR-30d-5p 在不同的病理條件下異常表達，例如癌癥和炎癥［9-10］。先前的研究已經證實miR-30d-5p 在多種癌癥中表達下調［11-12］。然而，miR-30d-5p 在胰腺癌中的潛在機制尚未得到充分證實。

生物信息學分析表明miR-30d-5p 和ABCB5 之間存在相互作用。ABCB5 作為ATP 結合盒（ABC）轉運蛋白的主要成員，可以維持干細胞的休眠狀態，降低細胞對外界物理和化學刺激的敏感性。它已被確定為惡性黑色素瘤衍生細胞的分子標志物［13］。ABCB5 的敲低顯著抑制了荷瘤小鼠的腫瘤體積［14-15］。但miR-30d-5p 和ABCB5 之間的相互關系在胰腺癌中尚未報道。本研究收集了胰腺癌樣本，以揭示miR-30d-5p 在影響其臨床特征中的作用。本研究試圖探討ABCB5 在胰腺癌發展中的作用及其與miR-30d-5p 的關系，為胰腺癌的生物標志物篩選及靶向治療的開發提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016 年12 月至2019 年1 月來新疆維吾爾自治區人民醫院接受手術治療的胰腺癌病人35例，術后即刻獲得胰腺腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織（距離癌組織＞3 cm）。其中男性21 例，女性14 例；年齡（58.6±13.7）歲（范圍為22～71 歲）。組織學分級包括低分化13 例、中分化14 例、高分化9例。根據國際抗癌協會（union for international cancer control，UICC）進行分期：Ⅰ～Ⅱ期17 例，Ⅲ期18例。無淋巴結轉移24 例，有淋巴結轉移11 例。病人術前未接受任何化療、放療或免疫治療，所有病理學診斷均由2 名以上的病理科醫生（主治醫師以上）進行確認。手術切除后，將組織冷凍在液氮中直至使用。病人或其近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 細胞培養人胰腺癌細胞系（CFPAC-1，SW1990，Capan-1 和PANC-1）和正常胰管上皮細胞系（HPDE）購自于北京北納生物有限公司。所有細胞均放置在含有5% 二氧化碳的標準加濕培養箱中在37 ℃環境下在含有10%胎牛血清（Gibco，美國，10099-141）的RPMI-1640培養基中培養。

1.3 細胞轉染使用Lipofectamine?3000 試劑（Thermo Fisher Scientific，美國，L3000-015）在說明下進行轉染。miR-30d-5p mimic 和NC 購自GenePharma（中國上海）。為了確認轉染效率miR-30d-5p，細胞分為三組：對照組，未轉染的細胞；NC 組，細胞轉染NC；miR-30d-5p mimic 組，細胞轉染miR-30d-5p mimic。NC 序列：5'-GUGUAACACGUCUAUACGCCCA-3' 和 miR-30d-5p 模擬序列：5'-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3'。ABCB5 過表達載體 pcDNA3.1-ABCB5 和pcDNA3.1 空白載體由吉凱基因（中國上海）生產。為了確認ABCB5 的轉染效率，將細胞分為三組：對照組，未轉染的細胞；pcDNA3.1 組，用pcDNA3.1 轉染細胞；pcDNA3.1-ABCB5，用pcDNA3.1-ABCB5轉染細胞。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）根據試劑盒的方案，本研究使用TRIzol?RNA 分離試劑（Invitrogen，美國，R0016）從腫瘤組織和細胞中提取總RNA。然后，mRNA 使用High Capacity cDNA Reverse Transcription 轉錄為cDNA。根據制造商的方案，使用SYBR Green PCR Master Mix（Takara，日本，QPK-201）進行qRT-PCR 分析。對于miRNA 檢測，U6 作為檢測的內參基因。為了檢測mRNA，使用GAPDH 作為內參基因用于檢測。下面列出了引物序 列 ：miR-30d-5p 正 向 引 物 ：5'-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3' 和反向引物：5'-UAGUGCUUUCUACUUUAUGUU-3'；U6 正向引物：5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3' 和反向引物：5'-TGCCGTAGGTGTCCCTTTG-3'；ABCB5 的正向引物：5'-TCAGAGAAATGGAACTGCAGAAGA-3' 和反向引物： 5'-AAGGAAGGCAGGCTCCATTG-3'； GAPDH 正向引物：5'-AACAGCAACTCCCACTCTTC-3'和反向引物：5'-CCTGTTGCTGTAGCCGTATT-3'。循環條件如下：95 ℃初始變性10 min，隨后95 ℃ 10s、55 ℃ 10 s和72 ℃ 30 s 40個熱循環。最后在72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法對基因表達進行相對定量。

1.5 蛋白質印跡法使用蛋白提取試劑（50 mmol/L Tris HCl，pH 7.4； 120 mmol/L 氯化鈉； 1%Nonidet P-40； 0.25%脫氧膽酸鹽； 0.1%十二烷基硫酸鈉）提取蛋白質。然后使用BCA 蛋白測定試劑盒對樣品蛋白質濃度進行標準化。將蛋白質提取物均等地加到10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上，進行電泳，然后轉移到硝基纖維素膜上。用5%脫脂牛奶的PBS 封閉后，用相關一抗ABCB5（1∶1 000）孵育過夜，然后是辣根過氧化物酶結合的二抗（Santa Cruz Company）。通過化學發光底物試劑盒（Millipore Company，美國）檢測條帶吸光度。

1.6 雙螢光素酶報告基因檢測通過RT-PCR擴增了人ABCB5 基因的3'非翻譯區。 突變體的構建也是通過用定制的合成3'-UTR DNA 替換3'-UTR而產生的。通過雙螢光素酶報告系統（Promega，美國）測量海腎和螢火蟲螢光素酶的活性。根據制造商的說明，所有的瞬時轉染均使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美國，L3000-015）進行。

1.7 細胞活力和增殖分析通過CCK-8 試劑盒來確定細胞活力。按照制造商的操作說明，各處理組在轉染處理后檢測相關細胞增殖情況。

1.8 細胞凋亡檢測各組在培養48 h后采集細胞，并在避光條件下使用100 μL 的細胞培養基中加入5 μL Annexin V FITC 和5 μL 碘化丙啶進行染色。經過20 min 的孵育后，利用流式細胞儀（FACScan，美國）測定細胞凋亡率。

1.9 MiRNA 靶基因位點預測TargetScan（http：//www.targetscan.org）數據庫用于預測miR-30d-5p 和ABCB5的靶向位點和結合序列。

1.10 裸鼠成瘤實驗5周齡的雄性BALB/c 裸鼠購自上海實驗動物公司（上海SLAC 公司，GX1347）。將穩定表達miR-30d-5p 模擬物及ABCB5 過表達的5.0×106PC 細胞皮下注射到裸鼠前腿下方的皮膚上。在16 d 內觀察小鼠的腫瘤形成。 然后處死小鼠，并確定每個腫瘤的體積及質量。

1.11 統計學方法數據分析采用SPSS 22.0 軟件進行分析，定量數據采用±s表示。兩組間比較采用配對t檢驗。三組及三組以上的數據采用單因素方差分析（one-way ANOVA），事后采用Tukey 法進行兩兩比較，檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 MiR-30d-5p 在胰腺癌組織中低表達微陣列分析顯示 miR-30d-5p 是胰腺癌組織中下調幅度最大的 miRNA，此外我們通過TCGA 數據庫驗證了miR-30d-5p 在腫瘤組織中顯著下降（圖1）。我們對miR-30d-5p 的預后驗證了低表達與不良預后顯著相關。QRT-PCR 檢測發現，與正常組織（1.03±0.17）相比，其在腫瘤組織中的表達（0.35±0.08）顯著下降（t=66.79，P=0.003）。進一步與HPDE（0.98±0.18）相比，CFPAC-1，SW1990，Capan-1 和PANC-1 細胞系中miR-30d-5p 的表達（0.63±0.08、0.23±0.07、0.48±0.07、0.31±0.05）也顯著降低（F=15.78，P=0.005）。

圖1 微RNA-30d-5p在胰腺癌組織前10個差異表達微RNA熱圖

2.2 MiR-30d-5p 對胰腺癌細胞增殖能力的影響首先，與NC（1.12±0.07）相比，qRT-PCR 的結果證實轉染后Capan-1（2.48±0.32）和PANC-1（2.84±0.29）細胞中 miR-30d-5p 的表達更高（t=7.83，P=0.004 和t=10.28，P=0.006）。同時，CCK-8檢測顯示細胞生長被miR-30d-5p 顯著抑制（P＜0.05）。同樣，與NC（1.00±0.02）相比，miR-30d-5p 可減少Capan-1（0.36±0.17）和PANC-1（0.43±0.12）細胞集落數（t=36.30，P＜0.001和t=35.61，P＜0.001），見圖2。

圖2 集落形成檢測轉染微RNA-30d-5p后兩種細胞的集落數情況（HE染色×200）

2.3 MiR-30d-5p 能夠靶向ABCB5 發揮作用熱圖顯示胰腺癌組織中mRNA 的差異表達，見圖3。PC 組中ABCB5 的表達（2.73±0.28）明顯高于正常組織（1.12±0.07）（t=41.25，P=0.003）。進一步檢測胰腺癌細胞株中ABCB5 mRNA 和蛋白水平，與HPDE（1.328±0.162）相比，Capan-1（3.755±0.40）和PANC-1（3.545±0.24）細胞中ABCB5 mRNA 和蛋白水平均上調（F=233.20，P=0.003 和F=186.23，P=0.002），見圖4。利用Targetscan 數據庫預測（圖5），本研究確定了ABCB5和miR-30d-5p之間的潛在相互作用位點。此外，螢光素酶報告實驗表明，與陰性對照組相比，共轉染ABCB5野生型和miR-30d-5p模擬物時，相對螢光素酶活性顯著降低。

圖3 ABCB5在PC中高表達并被微RNA-30d-5p靶向調控：A為TCGA mRNA分析的火山圖；B為TCGAmRNA分析的熱圖

圖4 蛋白質印跡法檢測ABCB5的蛋白水平

圖5 預測的miR-30d-5p和ABCB5之間的結合位點

2.4 MiR-30d-5p 通過靶向ABCB5 影響胰腺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲與NC（1.14±0.08）比較，QRT-PCR 結果顯示ABCB5 mRNA 表達水平在si-ABCB5 組（0.37±0.06）中的表達顯著降低，而ABCB5 組（3.08±0.26）則促進了它的表達（F=559.90，P=0.003），見表1，圖6。

表1 ABCB5 mRNA在Capan-1細胞系不同處理組中的表達

圖6 蛋白質印跡法檢測各處理組ABCB5蛋白的表達

細胞活力結果表明，轉染si-ABCB5 或miR-30d-5p mimics 的腫瘤細胞增殖被顯著抑制，而ABCB5組的細胞增殖能力顯著增強；而當miR-30d-5p mimics 的共同轉染則逆轉了ABCB5 對細胞增殖的促進作用（F=473.60，P=0.004）。細胞凋亡試驗顯示，miR-30d-5p mimic組和si-ABCB5組的細胞凋亡率顯著高于NC 組，而ABCB5組的凋亡率顯著降低；而當miR-30d-5p mimics 的共同轉染則逆轉了凋亡趨勢（F=90.43，P=0.005）。

劃痕和Transwell 實驗表明，ABCB5 組促進了Capan-1 細胞的遷移和侵襲，而 miR-30d-5p 轉染能夠逆轉ABCB5 對遷移及侵襲的影響（F=155.50，P=0.005），見圖7。最后在PANC-1 細胞中我們進行了同樣的重復驗證，結果趨勢與Capan-1 細胞中出現的趨勢是相同的（圖8；表2，3）。

表2 ABCB5 mRNA 在PANC-1細胞系不同處理組中的表達及蛋白水平比較/± s

表2 ABCB5 mRNA 在PANC-1細胞系不同處理組中的表達及蛋白水平比較/± s

組別NC miR-30d-5p si-ABCB5 ABCB5 miR-30d-5p+ABCB5重復次數3 3 3 3 3 ABCB5 mRNA 0.793±0.079 0.238±0.008 0.262±0.004 2.162±0.101 0.865±0.016 ABCB5 mRNA蛋白表達1.110±0.053 0.440±0.040 0.400±0.044 2.767±0.119 1.263±0.108

表3 PANC-1細胞系不同處理組閉合創面的細胞遷移情況及侵襲細胞數量比較/± s

表3 PANC-1細胞系不同處理組閉合創面的細胞遷移情況及侵襲細胞數量比較/± s

處理組NC miR-30d-5p si-ABCB5 ABCB5 miR-30d-5p+ABCB5重復次數3 3 3 3 3閉合創面/%43.153±5.967 27.720±4.035 29.820±5.087 79.123±5.614 47.363±2.456侵襲細胞數量2.490±1.050 2.230±1.000 2.440±1.110 2.390±1.053 0.138±0.055

圖7 Transwell侵襲試驗各處理組細胞侵襲情況（MicroStackerTM法 ×200）：A為NC;B為微RNA-30d-5p；C為si-ABCB5;D為ABCB5;E為微RNA-30d-5p＋ABCB5

2.5 MiR-30d-5p 通過靶向 ABCB5 影響體內腫瘤生長本研究使用小鼠腫瘤模型驗證了miR-30d-5p/ABCB5對胰腺導管腺癌的影響。結果顯示，miR-30d-5p 組小鼠的腫瘤生長受到明顯抑制，而ABCB5組則加速了腫瘤生長；然而，在同時轉染miR-30d-5p和ABCB5的小鼠中，腫瘤生長情況與對照組相似（F=237.40，P＜0.01），見圖9A。同樣地，在刺激后的30 d內，與相關對照組相比，miR-30d-5p組的腫瘤質量顯著減少，而ABCB5 組則增加；然而，在NC 組和miR-30d-5p+ABCB5 組差異無統計學意義（F=458.0，P=0.663）。通過HE 和KI67 染色觀察發現，轉染ABCB5 cDNA 的細胞具有較強的轉移能力，而轉染miR-30d-5p 的細胞則表現出較低的轉移能力。共轉染 ABCB5和miR-30d-5p模擬物對PC細胞的轉移無明顯影響（圖9B）。

圖9 微RNA-30d-5p通過阻斷ABCB5抑制PC腫瘤生長和轉移：A為從小鼠身上切除的腫瘤；B為小鼠腫瘤組織

3 討論

MiRNA是小的非編碼RNA分子，參與調節癌癥進展中的細胞增殖、凋亡、分化、侵襲和遷移［16-19］。有研究表明miRNA 在胰腺癌中充當癌基因或腫瘤抑制基因［20-21］。研究表明，miR-30d-5p 過表達可能會抑制胰腺癌的生長［22］。在本研究中，我們的結果顯示miR-30d-5p 在胰腺癌腫瘤組織中下調。此外，miR-30d-5p 過表達被證明可抑制胰腺癌細胞增殖并促進細胞凋亡，表明miR-30d-5p 在胰腺癌中起抑癌基因的作用。

眾所周知，miRNA 通過降解靶mRNA 或抑制其翻譯來調節基因表達。本研究假設miR-30d-5p 通過調節相應基因來調節胰腺癌細胞的生物學能力。迄今為止，已鑒定出幾個miR-30d-5p 的靶基因，如CAVI 和GSTPI。基于我們之前的生物信息學分析，我們證明ABCB5是miR-30d-5p的靶基因之一，并且在胰腺癌組織中顯著上調。為了進一步證實 miR-30d-5p 是否通過調節ABCB5 表達發揮關鍵的腫瘤抑制作用，我們分別用miR-30d-5p 和ABCB5 轉染Capan-1 和PANC-1 細胞。結果表明，轉染si-ABCB5或miR-30d-5p 的Capan-1 細胞活力明顯受到抑制，而轉染ABCB5 cDNA 的細胞活力增強；用ABCB5 cDNA 和miR-30d-5p模擬物轉染的細胞的細胞活力改變被逆轉。最近有研究結果顯示miR-30d-5p 在人惡性胸膜間皮瘤中能夠顯著抑制腫瘤的細胞增殖和遷移［23］。本研究中我們首次發現了miR-30d-5p 在胰腺癌中存在同樣的作用。然而目前關于ABCB5 在腫瘤中的研究較少，鄭天亮等［24］關注到ABCB5 在食管瘤放療敏感性的作用；吳星也曾報道其在黑色素瘤中的作用［25］。本研究首次發現ABCB5 能夠充當miR-30d-5p 的下游基因在胰腺癌治療中同樣扮演重要角色。這一猜想在進一步細胞凋亡試驗中得到進一步佐證。隨后，本研究通過Transwell 侵襲試驗和傷口愈合試驗測量miR-30d-5p/ABCB5 對Capan-1 和PANC-1 細胞體外侵襲和遷移能力的影響。結果表明，ABCB5 促進了細胞的遷移和侵襲，而miR-30d-5p 則顯著抑制了他們的轉移。我們的雙螢光素酶報告基因檢測驗證了miR-30d-5p 能夠靶向調控ABCB5 的表達。這些數據證實了miR-30d-5p 能夠通過靶向調控ABCB5 的表達影響胰腺癌進展。

綜上所述，本研究發現miR-30d-5p 通過調控ABCB5 的表達抑制PC 細胞的增殖、遷移和侵襲。這些結果為預測PC 的預后和治療靶點提供了新的生物標志物。