長鏈非編碼RNAMIR22HG和微RNA-9-3p在骨關節炎病人血清中的表達及與病情嚴重程度的相關性

尹文平，陳丹，包旭佳

作者單位：南充市中醫醫院，a骨傷四科，b內二科，四川 南充 637300

骨關節炎（osteoarthritis， OA）是最常見的關節退行性疾病之一，其特點是軟骨逐漸退化，軟骨下骨增厚，骨刺形成增加［1］。OA 病人的身體和經濟負擔是巨大的，隨著人口老齡化，其影響到總人口的15%，而60歲以上的老年人口占50%［2］。因此，探索與OA 相關的生物標志物對OA 的治療十分重要。長鏈非編碼RNA （long non-coding RNAs， lncRNAs）作為一組核苷酸長度大于200 的非編碼RNA，已被證實與多種疾病的發病機制有關，越來越多的研究表明，大量lncRNA 異位表達于OA 軟骨中，參與了OA 的發生發展［3］。MIR22HG 是最近發現的一種lncRNA，被發現與許多癌癥的發生和進展有關［4］。研究發現，MIR22HG 在受損的膝關節軟骨中顯著上調［5］。miRNA 是非編碼小分子RNA，可以調節細胞的增殖、分化和凋亡［6］。miR-9-3p 是具有多種功能的miRNA，在細胞炎癥、增殖以及分化過程中起關鍵的調控作用［7］。有研究證實miR-9 在OA 中低表達，是OA 的潛在保護因子［8］。因此推測lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 可能與OA 的發生、發展存在聯系。本研究通過檢測OA 病人與健康體檢者血清lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 的表達水平，探討lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p與病情嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020 年10 月至 2021 年10 月在南充市中醫醫院確診為OA 的病人120 例，為OA組，采用隨機數字表法選擇體檢健康者60例為對照組。由兩名影像學專家對OA 病人嚴重程度進行膝關節骨性關節炎（KL）分級，如果出現意見不同，則由更高職稱的影像學專家進行判定。影像KL 分級分為Ⅰ級到Ⅳ級，本研究OA病人為Ⅱ級34例，出現少量骨贅，存在關節間隙變窄；Ⅲ級42例，骨贅增生比Ⅱ級多，軟骨硬化，間隙變窄；Ⅳ級44 例，關節間隙狹窄或基本消失，有明顯的畸形現象［9］。研究已經通過南充市中醫醫院倫理委員會審核批準（批號2020-0812），所有病人均知情并簽署知情同意書。納入標準：（1）符合OA 診斷及治療指南的診斷金標準［10］；（2）符合OA 的臨床和影像學診斷標準；（3）存在骨摩擦音，骨關節疼痛持續近1個月。排除標準：（1）其他慢性疾病或其他炎癥性疾病者；（2）既往曾有繼發性關節炎或創傷性關節炎病人；（3）患有自身免疫性疾病者；（4）病人伴有精神疾病或認知功能障礙，無法配合完成本研究。一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 骨關節炎（OA）組與健康對照一般資料比較

1.2 評分方法對OA 病人進行視覺模擬評分（VAS）、美國特種外科醫院膝關節評分（HSS）、西安大略和麥馬斯特大學骨關節炎指數可視化量表（WOMAC）。VAS 評分為0～10 分，0 分無痛，3 分以下有輕微疼痛，4～6分疼痛到影響睡眠，7～10分病人疼痛難忍，分值越高越嚴重；HSS 評分分為5 個等級，共計100分，≥86為優秀，75～85為良好，60～74為中，＜60為差，分值越低越嚴重；WOMAC評分是由關節疼痛、僵硬和功能三個方面構成，共有24個問題，每個問題分值為0～4，分值越高越嚴重［10］。

1.3 lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 水平檢測方法OA 組病人于入院后第2天清晨，對照組于體檢當天清晨分別取其靜脈血3 mL，離心，分離上清，將血清于-80 ℃儲存，避免反復凍融影響實驗。采用TRIzol試劑（貨號Invitrogen，上海文韌生物科技有限公司）提取血清的總RNA。使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（貨號DRR041A，日本Takara 公司）對分離的RNA 進行逆轉錄。使用SYBR Green PCR Master Mix（貨號CD-06271-ML，武漢純度生物科技有限公司）在熒光定量PCR 儀（美國ABI-7300）中進行實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）。以U6和GAPDH 作為內部對照。二者表達水平用2-ΔΔCt法估算。本研究中用于qRT-PCR 的引物序列如表2所示，引物由上海杏園瑞民生物工程有限公司合成。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 統計學方法數據處理使用SPSS 25.0 軟件完成。計量數據用±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗分析；三組間的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson 法分析OA 病人血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 的相關性以及二者與VAS 評分、HSS 評分和WOMAC 評分等指標的相關性；受試者操作特征（ROC）曲線分析血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 對OA 的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OA 組和對照組血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 的表達水平比較OA 組的血清中lncRNA MIR22HG 的表達水平顯著高于對照組，miR-9-3p 的表達水平顯著低于對照組，均差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 OA組和對照組血清中lncRNA MIR22HG、miR-9-3p的表達水平比較/± s

注：lncRNA為長鏈非編碼RNA，miR-9-3p為微RNA-9-3p。

組別對照組OA組t值P值miR-9-3p 1.05±0.12 0.72±0.13 16.46＜0.001例數60 120 lncRNA MIR22HG 1.01±0.22 1.48±0.25 12.36＜0.001

2.2 血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 表達水平相關性相關性分析結果顯示，OA 組病人血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 的表達水平呈負相關關系（r=-0.44，P＜0.001）。如圖1所示。

圖1 血清中lncRNA MIR22HG和miR-9-3p表達水平相關性

2.3 病情嚴重程度不同的OA 病人血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 表達水平比較KL Ⅳ級血清lncRNA MIR22HG 的表達水平顯著高于KL Ⅲ級和KL Ⅱ級（q=5.22，P=0.045；q=8.39，P＜0.001），KLⅢ級表達水平顯著高于KL Ⅱ級（q=3.42，P=0.001）；KL Ⅳ級血清miR-9-3p 的表達水平顯著低于KL Ⅲ級和KL Ⅱ級（q=8.31，P＜0.001；q=12.26，P＜0.001），KL Ⅲ級表達水平顯著低于KL Ⅱ級（q=4.37，P=0.007）。見表4。

表4 病情嚴重程度不同的OA病人血清中lncRNA MIR22HG和miR-9-3p表達水平比較/± s

表4 病情嚴重程度不同的OA病人血清中lncRNA MIR22HG和miR-9-3p表達水平比較/± s

注：lncRNA 為長鏈非編碼RNA，miR-9-3p 為微RNA-9-3p，KL 為膝關節骨性關節炎。①與KL Ⅱ級比較，P＜0.05。②與KL Ⅲ級比較，P＜0.05。

例數34 42 44 lncRNA MIR22HG 1.31±0.24 1.45±0.25①1.65±0.26①②18.18＜0.001組別KL Ⅱ級KL Ⅲ級KL Ⅳ級F值P值miR-9-3p 0.84±0.10 0.75±0.13①0.59±0.14①②39.82＜0.001

2.4 病情嚴重程度不同的OA 病人的VAS 評分、HSS評分以及WOMAC 評分KL Ⅳ級病人的VAS評分和WOMAC 評分顯著高于KL Ⅲ級和KL Ⅱ級（q=6.68，P＜0.001；q=9.86，P＜0.001 和q=3.84，P=0.021；q=7.36，P＜0.001），KL Ⅲ級病人評分顯著高于KL Ⅱ級（q=3.51，P=0.038 和q=3.69，P=0.027）；KLⅣ級病人的HSS 評分顯著低于KL Ⅲ級和KL Ⅱ級（q=5.88，P＜0.001 和q=10.35，P＜0.001），KL Ⅲ級病人評分顯著低于KL Ⅱ級（q=4.75，P=0.003）。見表5。

表5 病情嚴重程度不同的OA病人的VAS評分、HSS評分以及WOMAC評分比較/（分，± s）

表5 病情嚴重程度不同的OA病人的VAS評分、HSS評分以及WOMAC評分比較/（分，± s）

注：VAS 為視覺模擬評分，HSS 為美國特種外科醫院膝關節評分，WOMAC為西安大略和麥馬斯特大學骨關節炎指數可視化量表，KL為膝關節骨性關節炎。①與KL Ⅱ級比較，P＜0.05。②與KL Ⅲ級比較，P＜0.05。

WOMAC評分60.12±7.12 64.56±7.25①68.88±7.66①②13.62＜0.001組別KL Ⅱ級KL Ⅲ級KL Ⅳ級F值P值例數34 42 44 VAS評分4.89±0.45 5.21±0.56①5.78±0.63①②25.72＜0.001 HSS評分72.19±7.34 66.66±7.11①60.25±7.02①②27.18＜0.001

2.5 OA 病人血清lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p表達水平與VAS 評分、HSS 評分以及WOMAC 評分的相關性分析相關性分析顯示，OA 病人血清lncRNA MIR22HG 的表達水平與VAS 評分、WOMAC 評分均呈正相關（P＜0.05），與HSS 評分呈負相關（P＜0.05）；miR-9-3p 表達水平與VAS 評分、WOMAC 評分均呈負相關（P＜0.05），與HSS 評分呈正相關（P＜0.05）。見表6。

表6 OA病人血清lncRNA MIR22HG和miR-9-3p表達水平與VAS評分、HSS評分以及WOMAC評分的相關性分析

2.6 ROC 曲線分析血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 對OA 的診斷價值ROC 曲線顯示，lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p診斷OA 發生的ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）分別為［0.89，95%CI：（0.84，0.94）］和［0.84，95%CI：（0.81，0.91）］，靈敏度分別為87.50%和85.80%，特異度分別為78.30%和91.70%。兩者聯合診斷AP 的AUC 為［0.95，95%CI：（0.92，0.98）］，其靈敏度、特異度分別為89.50%和77.30%，其中二者聯合診斷的AUC 高于lncRNA MIR22HG、miR-9-3p 單獨診斷的AUC 值（Z=2.22，P=0.012；Z=1.43，P=0.025）。

3 討論

OA 是人類最常見的關節疾病，臨床表現為疼痛、活動受限和不同嚴重程度的炎癥，宏觀上表現為關節軟骨的逐漸退化［11-12］。OA 以軟骨完整性退行性喪失和關節間隙狹窄為典型，是全世界范圍內導致疼痛、殘疾和縮短工作壽命的主要原因［13］。不幸的是，目前還沒有有效的治療方法可以改變疾病的進展。因此，尋找對OA 疾病診斷以及治療的生物標志物具有重要的意義。

研究表明lncRNA 與OA 的發病密切相關，與正常的骨關節相比，在OA 關節異常表達的lncRNA 大約有1 700～4 700 種［14］。lncRNA 可以調節軟骨細胞功能、軟骨基質代謝、滑膜細胞功能和周圍血管增生，在OA 的發病過程發揮重要的作用［15］。研究表明在OA 病人血清中lncRNA MIR22HG 顯著高表達，lncRNA MIR22HG 的抑制可降低細胞凋亡和軟骨基質降解，表明lncRNA MIR22HG 在OA 發病機制中發揮了重要作用［16］。MIR22HG在OA關節軟骨中過表達，可能是OA進展的重要因素，MIR22HG通過PTEN/AKT 通路促進骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨分化［17］。本次研究發現，OA 組的血清中lncRNA MIR22HG 的表達水平顯著高于對照組；KLⅣ級血清lncRNA MIR22HG的表達水平、VAS評分、WOMAC評分顯著高于KL Ⅲ級和KL Ⅱ級，KL Ⅲ級顯著高于KL Ⅱ級；KL Ⅳ級病人的HSS 評分顯著低于KL Ⅲ級和KL Ⅱ級，KL Ⅲ級病人評分顯著低于KL Ⅱ級，提示VAS 評分、WOMAC 評分越高、HSS 評分越低，OA 病人病情越嚴重，lncRNA MIR22HG 的表達水平與OA 嚴重程度有關，MIR22HG 的表達水平越高，OA影像KL分級就越重，關節癥狀體征越明顯；OA 病人血清lncRNA MIR22HG 的表達水平與VAS 評分、WOMAC 評分均呈正相關，與HSS 評分呈負相關；提示lncRNA MIR22HG 與OA 病人的病情嚴重程度存在聯系，可以作為評估OA 病情的潛在生物學指標。

MicroRNAs是一種小的、高度保守的RNA，被認為可以快速調節細胞對環境條件變化的反應，如細胞分化、癌癥發展、炎癥或缺氧應激［18］。miRNAs 與OA 的發病過程，如骨代謝、炎癥以及軟骨內穩態有關［19］。研究表明miR-140、miR-9和miR-146a在骨骼發育過程中發揮重要的作用，與正常的組織相比，在OA 病人軟骨組織中，miR-140、miR-9 和miR-146a的表達量是減少的［20］。目前的研究中，發現miR-9通過成纖維細胞樣滑膜細胞中的NF-κB1-RANKL通路抑制關節炎，除此之外，MIR22HG 還通過miR-9-3p/ADAMTS5 通路參與調節細胞增殖、凋亡和軟骨基質退變［21］。本次研究表明，OA組miR-9-3p的表達水平顯著低于對照組；KL Ⅳ級血清miR-9-3p的表達水平顯著低于KL Ⅲ級和KL Ⅱ級，KL Ⅲ級表達水平顯著低于KL Ⅱ級，提示miR-9-3p 的表達水平越低，OA影像KL分級就越重，關節癥狀體征越明顯；miR-9-3p表達水平與VAS 評分、WOMAC 評分均呈負相關，與HSS 評分呈正相關，表明miR-9-3p在一定程度上參與OA 的發生，miR-9-3p 表達與病情嚴重程度密切相關。

研究結果顯示，OA 組病人血清中lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的表達水平呈負相關關系，表明二者共同參與OA 的發生，二者聯合診斷的AUC高于單獨診斷值，推測lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p對OA的診斷具有一定的價值。

綜上所述，OA 病人血清中lncRNA MIR22HG 表達水平顯著增加，而miR-9-3p 表達水平顯著降低，二者表達呈負相關，二者與病情嚴重程度密切相關。由于OA 的作用機制比較復雜，研究結果有待更加深入的研究來證實。