食管癌組織微RNA-634、鋅指蛋白ZBTB20表達(dá)與食管癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

姜明澤，王磊，楊樹(shù)博

作者單位：1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院心胸外科，湖北 十堰 442008；2成都市第六人民醫(yī)院胸外科，四川 成都 610051；3海南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科，海南 海口 570102

食管癌是一種好發(fā)于上消化道的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤中高居第8 位［1］。而中國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病及病死率均處于全球較高水平［2］。目前食管癌的治療技術(shù)不斷提高，但依然存在預(yù)后較差的問(wèn)題［3］。因此，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)食管癌預(yù)后的科學(xué)可靠標(biāo)志物十分重要。微RNAs（microRNAs，miRNAs）在多數(shù)癌癥中存在表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象。miR-634已被證實(shí)在宮頸癌［4］、口腔鱗狀細(xì)胞癌［5］中存在表達(dá)降低的現(xiàn)象，與癌癥的進(jìn)展相關(guān)。鋅指蛋白類(lèi)型結(jié)構(gòu)不同，其具備的生物功能亦有所區(qū)別。鋅指蛋白已被證實(shí)參與食管癌的進(jìn)展過(guò)程［6-7］。ZBTB20 是鋅指蛋白家族的一員，其在肝細(xì)胞癌中表達(dá)升高，可能是潛在的肝癌基因［8］。Xu等［9］取乳腺癌病人的組織樣本，發(fā)現(xiàn)miR-634 表達(dá)水平降低，ZBTB20 表達(dá)水平升高，長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG8 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-634/ZBTB20 軸促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。但關(guān)于miR-634 與ZBTB20 在食管癌中的研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)食管癌組織中miR-634 與ZBTB20 的表達(dá)水平，探討兩者與食管癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018 年1 月至2019 年4 月湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院接收的行食管癌根治切除術(shù)的病人共102例，男56例，女46例；年齡范圍為40～75 歲，年齡（59.50±7.06）歲，＜60 歲者42例，≥60歲者60例；病理類(lèi)型：鱗癌64例，腺癌38例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期57 例、Ⅲ期45 例；腫瘤長(zhǎng)徑：＜5.0 cm 59 例，≥5.0 cm 43 例；發(fā)生及未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的各38、64例；浸潤(rùn)深度處于黏膜或黏膜下層、肌層或外膜的各49、53例；低分化及中、高分化的各56、46 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）食管癌Ⅰ～Ⅲ期病人；（2）手術(shù)中切除的癌組織經(jīng)病理檢查確認(rèn)為食管癌；（3）臨床資料可查無(wú)缺失；（4）術(shù)前無(wú)放療或化療；（5）愿意接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）食管癌Ⅳ期病人；（2）合并有其他惡性腫瘤病人；（3）伴有心肝腎等重要內(nèi)臟功能障礙病人；（4）認(rèn)知功能障礙病人。病人對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情并簽署書(shū)面知情同意書(shū)。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)201711150021）。

1.2 主要試劑與儀器Trizol 試劑盒（貨號(hào)15596026）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)RRO47AA）購(gòu)自日本Takara公司；熒光定量PCR 試劑盒（貨號(hào)Code No. RR420L）購(gòu)自日本Takara 公司；qRT-PCR 儀（型號(hào)CFX384）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；分光光度計(jì)（型號(hào)NanoDrop ND-12000）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 研究方法

1.3.1樣品采集及保存 從手術(shù)標(biāo)本切取癌組織及癌旁正常組織（距離腫瘤≥5 cm），長(zhǎng)徑約1 cm，切除后立即置于液氮冷凍，-80 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)食管癌組織及癌旁組織中miR-634、ZBTB20 mRNA 的表達(dá)水平 按Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取各組樣品中總RNA。而后檢查總RNA 濃度、純度（分光光度計(jì)）。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，采用qRT-PCR 檢測(cè)樣本中miR-634、ZBTB20 mRNA 的表達(dá)水平（20 μL PCR 反應(yīng)體系：cDNA 模板0.5 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、2×Taq PCR master mix 6.5 μL，加dH2O 至20 μL），檢測(cè)條件：95 ℃15 min，1 個(gè)循環(huán)，然后在95 ℃變性15 s，65 ℃退火延伸45 s，共40 個(gè)循環(huán)。miR-634 和ZBTB20 mRNA 引物及U6 和β-actin 內(nèi)參引物由上海生工生物工程提供，引物序列見(jiàn)表1。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。使用2-ΔΔCt方法分析miR-634、ZBTB20 mRNA的表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4 隨訪從病人出院開(kāi)始，均接受復(fù)查、電話的隨訪方式隨訪，前2 年3 個(gè)月進(jìn)行一次隨訪，2 年后隔半年進(jìn)行一次，共進(jìn)行36 個(gè)月，最晚截止時(shí)間為2022 年5 月。以病人遷走或失去聯(lián)系定義為失訪，隨訪期間失訪0 例，隨訪率為100%。從病人出院日開(kāi)始，以發(fā)生轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)、死亡作為終點(diǎn)事件，隨訪結(jié)束。記錄病人術(shù)后發(fā)生事件（復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移）和死亡例數(shù)，計(jì)算無(wú)進(jìn)展生存率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 分析。所有連續(xù)變量均符合正態(tài)分布，采用±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)評(píng)估ZBTB20 mRNA 與miR-634 表達(dá)水平的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier 生存曲線和logrank 檢驗(yàn)分析ZBTB20 mRNA、miR-634 與預(yù)后的關(guān)系；采用Cox 回歸分析影響食管癌病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中miR-634、ZBTB20 mRNA 的表達(dá)水平與癌旁正常組織相比，食管癌組織中miR-634 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），ZBTB20 mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 食管癌不同組織中微RNA-634、鋅指蛋白ZBTB20mRNA的表達(dá)水平/± s

表2 食管癌不同組織中微RNA-634、鋅指蛋白ZBTB20mRNA的表達(dá)水平/± s

組別癌旁正常組織食管癌組織t值P值例數(shù)102 102 miR-634 1.02±0.06 0.69±0.15 20.63＜0.001 ZBTB20 mRNA 1.01±0.05 1.64±0.26 24.03＜0.001

2.2 食管癌組織中miR-634 與ZBTB20 mRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性Pearson 相關(guān)性提示，miR-634 與ZBTB20 mRNA 表達(dá)水平在食管癌病人組織中的檢測(cè)結(jié)果其水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.65，P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 食管癌組織中miR-634與ZBTB20 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

2.3 miR-634、ZBTB20 mRNA 表達(dá)水平與食管癌病人臨床特征的關(guān)系食管癌組織miR-634中位值為0.68，ZBTB20 mRNA 中位值為1.60。miR-634＜0.68為低表達(dá)，≥0.68為高表達(dá)；ZBTB20 mRNA＜1.60為低表達(dá)，≥1.60 為高表達(dá)。結(jié)果表明，兩者均與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3，4。

表3 微RNA-634表達(dá)水平與食管癌病人病理特征的關(guān)系/例（%）

表4 ZBTB20 mRNA表達(dá)水平與食管癌病人病理特征的關(guān)系/例（%）

2.4 miR-634、ZBTB20 表達(dá)水平與食管癌病人預(yù)后的關(guān)系3年隨訪結(jié)果顯示，102例食管癌病人中無(wú)進(jìn)展生存48 例，發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡54 例，無(wú)進(jìn)展生存率為47.06%。miR-634高表達(dá)組無(wú)進(jìn)展生存33 例（64.71%），低表達(dá)組無(wú)進(jìn)展生存15 例（29.41%）；ZBTB20 低表達(dá)組無(wú)進(jìn)展生存32 例（62.75%），高表達(dá)組無(wú)進(jìn)展生存16 例（31.37%）。Kaplan-Meier 生存曲線結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-634、ZBTB20高表達(dá)與低表達(dá)組無(wú)進(jìn)展生存率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.41、9.48，P＜0.001）。

2.5 Cox 回歸分析影響食管癌病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素以食管癌病人術(shù)后生存情況為因變量（0=無(wú)進(jìn)展生存，1=復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡），以表3，4中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量及miR-634、ZBTB20 為自變量（賦值見(jiàn)表5）進(jìn)行Cox 回歸分析。單因素Cox 回歸分析表明，TNM 分期（Ⅲ）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織低分化、ZBTB20 高表達(dá)、miR-634 低表達(dá)均是影響食管癌病人不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素；多因素Cox回歸分析表明，TNM 分期（Ⅲ）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-634 低表達(dá)、ZBTB20 高表達(dá)是影響食管癌病人不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表6。

表5 Cox回歸分析中自變量賦值表

表6 Cox回歸分析影響食管癌病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討論

目前醫(yī)學(xué)界對(duì)于食管癌的治療已經(jīng)取得很大的進(jìn)步，但病人出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)依然較高［3］，食管癌病人早期治療預(yù)后效果較好。本研究分析食管癌病人預(yù)后可能影響因素，發(fā)現(xiàn)TNM 分期（Ⅲ）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均對(duì)病人預(yù)后造成不良影響，這與鄧偉明等［10］的研究結(jié)果一致。臨床仍需不斷探究預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物，以實(shí)現(xiàn)靶向治療與改善預(yù)后的目的。

miRNA 已被證實(shí)能夠通過(guò)調(diào)控多種癌基因或抑癌基因的表達(dá)參與食管癌的發(fā)生發(fā)展［11-13］。本研究證實(shí)，miR-634 在食管癌病人取下的組織中的表達(dá)水平高于其在癌旁組織樣本中的水平，表明其對(duì)食管癌具有腫瘤抑制作用。國(guó)外研究表明，miR-634 的過(guò)表達(dá)可直接靶向與線粒體穩(wěn)態(tài)、抗凋亡細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、抗氧化劑清除和自噬相關(guān)的基因，并能增強(qiáng)化療誘導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞毒性［14］。Tran 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，靶向細(xì)胞凋亡蛋白1（cIAP1）基因能夠通過(guò)抑制半胱天冬酶活性作為凋亡細(xì)胞的內(nèi)源性抑制劑，過(guò)表達(dá)miR-634 可抑制cIAP1，進(jìn)而誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌SAS 和Ca9-22 細(xì)胞的凋亡。對(duì)胰腺癌模型小鼠靜脈注射含有miR-634的脂質(zhì)納米粒能夠?qū)iR-634 有效輸送至胰腺癌細(xì)胞中，抑制其生長(zhǎng)［15］。以上結(jié)果證實(shí)，miR-634 是一種有用的抗癌治療劑。miR-634 表達(dá)越低可能預(yù)示著食管癌病人預(yù)后越不良，與徐曉義等［16］在肝癌中的研究結(jié)果一致，說(shuō)明miR-634 低表達(dá)病人出現(xiàn)不良預(yù)后的可能性更大。

與miR-634 相反，本研究中食管癌組織ZBTB20表達(dá)水平高于癌旁組織。ZBTB20與PPARG 相互作用，上調(diào)WNT/CTNNB1 信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，被認(rèn)為是肝癌的潛在致癌基因［8］。Sun等［17］通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)證明，ZBTB20能夠抑制CD8 T細(xì)胞的免疫代謝，造成CD8 T 細(xì)胞對(duì)腫瘤的記憶分化和抗腫瘤作用減弱。ZBTB20 可促進(jìn)TGFBR2 的表達(dá)激活TGF-β 信號(hào)通路和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［18］。本研究中，ZBTB20 與食管癌病人出現(xiàn)預(yù)后不良情況有關(guān)，這與劉欽成［18］的研究具有相似的趨勢(shì)，即在癌組織中ZBTB20 高水平預(yù)示較差的預(yù)后。

Pearson結(jié)果提示，miR-634與ZBTB20表達(dá)在食管癌病人中負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-634 可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控ZBTB20 在食管癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能通過(guò)參與多種細(xì)胞通路在食管癌中發(fā)揮作用。同時(shí)兩者的表達(dá)亦可用于病人TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度的輔助評(píng)估，也進(jìn)一步表明兩者參與食管癌的病情進(jìn)展過(guò)程。在乳腺癌中，LncRNA SNHG8 海綿化miR-634 增加ZBTB20 的表達(dá)水平，從而進(jìn)一步加重乳腺癌的惡性程度［9］，證實(shí)miR-634、ZBTB20 可在癌癥中共同發(fā)揮作用。查詢國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，尚未見(jiàn)到有關(guān)于兩者在食管癌中共同作用的相關(guān)報(bào)道，筆者會(huì)時(shí)刻關(guān)注相關(guān)研究，為后續(xù)研究的進(jìn)行提供依據(jù)。

綜上所述，食管癌病人癌組織中miR-634 表達(dá)顯著降低，ZBTB20 表達(dá)顯著升高，兩者與食管癌TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度均有關(guān)，且其異常表達(dá)可能預(yù)示病人不良預(yù)后。兩者可能共同參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。但本研究亦存在較多不足之處，首先本研究屬小樣本分析研究，且并未對(duì)miR-634、ZBTB20 自食管癌中的具體作用機(jī)制進(jìn)行研究，后續(xù)一方面擴(kuò)大樣本數(shù)量，另一方面可通過(guò)設(shè)計(jì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)研究，從靶向基因與信號(hào)通路方面對(duì)兩者在食管癌中的具體作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。