血清微RNA-34a在多發性骨髓瘤中的表達及其臨床意義

馮麗倩，王友君，李棟梁，李卿，潘志蘭

作者單位：石家莊市人民醫院，a血液內科，b老年醫學科，河北 石家莊 050000

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種血液系統惡性腫瘤，占所有血液系統惡性腫瘤約10%［1］。MM 臨床表現多樣化，包括不同程度的貧血、骨痛、高鈣血癥、腎損害等［2］。該病早期誤診率高，確診時多處于中晚期，臨床多采用蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑等聯合治療，近年來以硼替佐米為基礎的化療方案在臨床被廣泛應用，能提高近期療效和生存率，但有部分病人療效較差［3］，嚴重影響預后。因此，臨床上需要尋找影響MM 化療效果的因素，以便指導臨床干預，進一步改善預后。近年來，越來越多的研究開始關注微RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤中的作用，發現miRNA 與腫瘤的發生、發展及腫瘤的耐藥等有一定的關系［4-6］。miRNA是一類對基因的轉錄、翻譯、分子的編碼代謝等過程具有調控作用的微RNA，miRNA-34a（miR-34a）是miRNA 家族中的一員，有研究發現，miR-34a 在肺癌、肝癌等惡性腫瘤中表達異常，與惡性腫瘤的發生、進展、預后密切相關［7-8］，但miR-34a 在MM 中的表達水平及其與化療效果的關系尚少有研究報道。鑒于此，本研究檢測miR-34a 在初診MM 病人中的表達水平，探討其與MM 病人化療效果的關系，旨在為臨床指導提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取石家莊市人民醫院2017 年3月至2021 年5 月收治的102 例初診MM 病人作為疾病組，另同期選取100例性別、年齡匹配的健康體檢者作為對照組。納入標準：疾病組均為新診斷的MM，均符合《中國多發性骨髓瘤診治指南》［9］中的診斷標準；疾病組均采用以硼替佐米為基礎的化療方案進行治療；對照組經體檢均確認健康；受試者均簽署知情同意書。排除標準：既往有化療、放療及其他腫瘤治療史者；精神、認知功能異常者；合并白血病等其他血液疾病者；合并肝、腎、腦等臟器嚴重損害者；合并其他惡性腫瘤者。對照組男51 例，女49 例；年齡范圍為46～72 歲，年齡（63.54±11.67）歲。疾病組男52例，女50例；年齡范圍為47～74歲，年齡（62.59±14.35）歲；免疫分型：免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）型59 例、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）型21 例、輕鏈型17 例、其他類型5 例；國際分期系統（international staging system，ISS）分期：Ⅱ期24 例、Ⅲ期78 例；修訂版國際分期系統（revised international staging system，R-ISS）分期：Ⅱ期56 例、Ⅲ期46 例；FISH 篩查結果：p53 缺失/突變21例、1q21 擴增49 例、t（4；14）18 例、t（14；16）5 例、t（14；20）2 例、t（11；14）13 例。兩組性別、年齡比較，均差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 血清指標檢測血清miR-34a 的檢測對照組于體檢當天、疾病組于入院后第2 天采集5mL 空腹靜脈血，離心后提取血清，于-80 ℃超低溫保存，委托德諾瑞爾生物科技有限公司檢測血清miR-34a 表達水平：采用Trizol 試劑盒（美國Invitorgen 公司）提取血清總RNA，選用FQD-96A 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）儀進行逆轉錄成cDNA。反應條件：95 ℃變性35 s，60 ℃退火30 s，循環40 次，70 ℃延伸10 s。用2-ΔΔCt計算miR-34a 的相對表達量，其中引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

另采用BC-1800血常規檢測儀檢測疾病組血紅蛋白水平，采用LX20 全自動血生化分析儀檢測疾病組血鈣和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平。

1.3 化療方法采用以硼替佐米為基礎的化療方案，包括PTD、PAD、RVD 方案。PTD 方案：硼替佐米（江蘇豪森藥業集團有限公司，批號H20173306）1.3mg/m2，于第l、4、8、11天靜脈注射；地塞米松（河南科倫藥業有限公司，批號H41023597）40 mg，于第1、2、4、5、8、9、11、12 天靜脈注射；沙利度胺（常州制藥廠有限公司，批號H32026129）100 mg/d，每晚睡前口服。PAD 方案：硼替佐米和地塞米松用法用量同PTD 方案，多柔比星（常州金遠藥業制造有限公司，批號H20123273）9 mg/m2，于第1～4 天靜脈滴注。RVD：硼替佐米和地塞米松用法用量同PTD 方案；來那度胺（正大天晴藥業集團股份有限公司，批號H20193006）25 mg/d，每晚睡前口服。21 d 為1 個治療周期，連續治療4個周期。

1.4 疾病組化療效果判定化療4 個周期結束后，參照國際骨髓瘤工作組制定的療效標準對各種化療方案效果進行評價，包括完全緩解、非常好的部分緩解、部分緩解、疾病穩定、疾病進展。統計化療有效率，總有效率=完全緩解率+非常好的部分緩解率+部分緩解率。

1.5 多發性骨髓瘤病人血清miR-34a 水平與化療效果的關系分析收集病人的臨床資料，包括性別、年齡、免疫分型、ISS分期、R-ISS分期、血紅蛋白、血鈣、LDH 水平、熒光原位雜交（FISH）篩查有無細胞遺傳學高危［參照mSMART 分層系統將合并p53缺失/突變、1q21 擴增、t（4；14）、t（14；16）、t（14；20）定義為高危，將合并t（6；14）、t（11；14）或無異常定義為非高危［10］］、血清miR-34a 表達水平等。將其作為自變量，將MM 病人化療效果記為因變量，分析自變量與因變量的關系，其中變量賦值結果見表2。

表2 多發性骨髓瘤病人變量賦值

1.6 統計學方法采用SPSS24.0軟件檢驗，計量資料若不符合正態分布則采用中位數（第25、75 百分位數），即M（P25，P75）描述，采用非參數秩和檢驗；計量資料若符合正態分布，以±s描述，兩組比較采用t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析和SNKq檢驗；計數資料用例（%）描述，采用χ2檢驗；采用logistic 多元回歸分析法分析探討血清miR-34a 表達水平與疾病組化療效果的關系。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 疾病組與對照組血清miR-34a 表達水平比較疾病組血清miR-34a 水平低于對照組，差異有統計學意義（0.63±0.10 比1.45±0.23，t=32.97，P＜0.05）。

2.2 疾病組不同臨床病理特征病人miR-34a 表達水平比較疾病組中ISS 分期Ⅲ期、R-ISS 分期Ⅲ期、免疫分型IgG 型、FISH 篩查高危病人血清miR-34a 表達水平均低于ISS 分期Ⅱ期、R-ISS 分期Ⅱ期、免疫分型IgA、輕鏈型和其他類型、FISH 篩查非高危病人（P＜0.05）。見表3。

表3 多發性骨髓瘤不同臨床病理特征病人miR-34a表達水平比較/± s

表3 多發性骨髓瘤不同臨床病理特征病人miR-34a表達水平比較/± s

注：ISS為國際分期系統，R-ISS為修訂版國際分期系統，FISH 為熒光原位雜交。

臨床病例特征性別例數miR-34a t（F）值1.82 P值0.071男女年齡52 50 0.65±0.12 0.61±0.10 0.86 0.389≤60歲＞60歲免疫分型40 62 0.64±0.12 0.62±0.11（7.37）＜0.001 IgG IgA輕鏈型其他ISS分期59 21 17 5 0.59±0.08 0.69±0.13 0.68±0.12 0.68±0.12 4.96＜0.001Ⅱ期Ⅲ期R-ISS分期24 78 0.72±0.14 0.60±0.09 3.16 0.002Ⅱ期Ⅲ期FISH篩查56 46 0.66±0.12 0.59±0.10 2.90 0.005非高危高危26 76 0.69±0.15 0.61±0.11

2.3 疾病組血清miR-34a 表達水平與化療效果的關系分析疾病組中分別有49 例接受PTD 化療方案、29 例接受PAD 化療方案、27 例接受RVD 化療方案，化療4 個周期后總有效率為75.49%（77/102），其中PTD、PAD、RVD 化療方案總有效率分別為69.39%（34/49）、75.00%（21/28）、88.88%（22/25）。疾病組化療無效組和化療有效組性別、年齡、免疫分型、LDH 水平和治療方案比較差異無統計學意義（P＞0.05）；化療無效病人血紅蛋白水平、血清miR-34a 水平低于化療有效病人（P＜0.05），血鈣水平和ISS 分期Ⅲ期、R-ISS 分期Ⅲ期、FISH 篩查高危占比均高于化療有效病人（P＜0.05）。見表4。

表4 多發性骨髓瘤病人化療無效組和化療有效組一般資料比較

將表4 中統計學檢驗P＜0.10 的變量納入到logistic 回歸分析模型中，模型0 為未校正任何變量，模型1為校正ISS分期和R-ISS分期，模型2在模型1基礎上校正血紅蛋白、血鈣水平和FISH篩查高危比例。結果顯示，在未調整任何因素下MM 病人血清miR-34a 水平降低化療無效危險是正常水平病人的4.575 倍（P＜0.05），在全因素校正后是1.933 倍（P＜0.05）。見表5。

表5 多發性骨髓瘤病人多因素logistic回歸分析

3 討論

MM 是一種漿細胞惡性腫瘤，其主要由于漿細胞的無限增殖，從而導致多器官、組織損害等臨床癥狀，且因其存在多因素性、多基因性及臨床癥狀繁多等特性，易出現誤診、導致診斷率不高，故確診時常處于中晚期［11］。目前臨床針對MM 常采用以硼替佐米為基礎的化療方案進行治療，雖明顯提高了病人的生存率和完全緩解率，仍有不少病人化療效果不佳，預后較差［12］。因此，需要探討影響初診MM病人化療效果的相關因素，以提高化療療效，改善病人預后。

本研究結果顯示，疾病組血清miR-34a 表達水平低于對照組，說明初診MM 病人血清miR-34a 表達水平異常降低，提示血清miR-34a 可能參與MM的發生。miRNA 對基因具有調控作用，miRNA 功能失調或表達失調在多種疾病中發揮重要作用，特別是在腫瘤疾病中可作為抑癌基因或促癌基因參與腫瘤的發生發展過程［13］。郝志明等［14］報道miR-34a在胰腺癌中表達降低，這與本研究結果一致，均證實了miR-34a 與腫瘤的發生有關。本研究還發現，疾病組中ISS 分期Ⅲ期、R-ISS 分期Ⅲ期、免疫分型IgG 型、FISH 篩查高危病人血清miR-34a 表達水平均低于ISS 分期Ⅱ期、R-ISS 分期Ⅱ期、免疫分型IgA、輕鏈型和其他類型、FISH 篩查非高危病人，表明血清miR-34a 表達水平與MM 臨床病理特征有一定的關系，可能在腫瘤進展過程中具有重要意義。在MM 中，致癌基因突變和免疫球蛋白重鏈易位激活相關致癌基因被認為是MM 發生的重要機制。p53 是一種對腫瘤具有抑制作用的轉錄因子，能夠誘導修復基因表達，在基因復制錯誤時阻止細胞周期，清除癌細胞。相關研究［15］報道，miR-34可與p53啟動子區域結合，抑制促癌基因MYC蛋白和細胞周期蛋白依賴性磷酸化酶的表達，進而影響MM 的發生、發展。

本研究觀察以硼替佐米為基礎的化療方案對初診MM 的療效，發現化療4 個周期后總有效率為75.49%，其中PTD、PAD、RVD 化療方案總有效率分別為69.39%、75.00、88.88%，與楊寧等［16］報道結果相近，提示仍有部分初診MM 病人化療效果差。本研究發現化療無效病人血紅蛋白水平、血清miR-34a 水平低于化療有效病人，血鈣水平和ISS 分期Ⅲ期、R-ISS 分期Ⅲ期、FISH 篩查高危占比均高于化療有效病人，提示以上指標均與MM 病人化療效果密切相關。由于骨髓瘤細胞惡性增殖、浸潤骨髓破壞紅細胞生成，導致血紅蛋白水平降低，相關研究［17-18］報道，MM 病人血紅蛋白水平與骨髓瘤細胞浸潤骨髓程度、腫瘤負荷呈負相關，對評估病情、化療效果和預后具有重要意義；血鈣過高會引起高鈣血癥，損傷腎功能，IgG 過量會造成骨髓瘤管型阻塞腎小管，二者均可對腎臟吸收、代謝化療藥物造成嚴重影響，降低化療敏感度［19］；ISS 分期和R-ISS 分期是評估MM化療療效和預后的重要指標，其中R-ISS分期在ISS 分期基礎上基于LDH 水平和FISH 篩查分子遺傳學高危分層對預后進行評估，分期越晚，療效越差［20-21］，且腫瘤進展至后期時，癌細胞可能會學習如何修復由某類化療藥物引起的DNA 斷裂，并形成使藥物失活的機制，影響化療效果［22］。本研究采用logistic 回歸分析，在未調整任何因素下MM 病人血清miR-34a 水平降低化療無效危險是正常水平病人的4.575 倍，在全因素校正后是1.933 倍，表明血清miR-34a 水平降低是MM 化療無效的危險因素。有研究［23］發現，miR-34a 過表達可抑制M2 型巨噬細胞極化，進而減弱癌細胞的增長和遷移，增強細胞對化療藥物的敏感性。另外，miR-34a可降低MM細胞周期蛋白D1 和抗凋亡蛋白表達，阻滯細胞周期，誘發細胞凋亡，從而提高藥物敏感性［24］。因此，可通過上調miR-34a 水平，抑制腫瘤細胞生長，增加MM 腫瘤細胞對化療藥的敏感性，進而提高療效，改善預后。

綜上所述，MM 病人血清miR-34a 水平降低，其中化療無效病人血清miR-34a 水平更低，是MM 病人化療無效的危險因素，提示可通過上調血清miR-34a 水平來提高MM 病人化療敏感性以幫助改善預后。