血清半乳糖凝聚素-3、α-klotho表達與代謝相關(guān)脂肪性肝病糖脂水平及預后的關(guān)系

孫玉，南照林，張彥敏，秦維

作者單位：保定市人民醫(yī)院肝病科，河北 保定 071000

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球慢性肝病的主要原因，其發(fā)展機制復雜、影響因素眾多，2020 年正式更名為代謝相關(guān)脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）［1］。MAFLD 的病理范圍很廣，包括沒有肝損傷的單純性脂肪變性、伴有或不伴有可導致肝癌晚期纖維化和肝硬化的非酒精性脂肪性肝炎［2］。由于其多變的病理特點，很難確定與MAFLD病人預后不良相關(guān)的影響因素［3］。α-klotho 是一種多功能蛋白，主要由腎臟分泌，在抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)自噬，促進能量代謝，抑制炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用［4］。半乳糖凝聚素-3（galectin-3，Gal-3）是一種纖維化蛋白，研究表明Gal-3 在代謝性疾病中發(fā)揮著重要的作用，如非酒精脂肪性肝炎、糖尿病等［5-6］。

為進一步確定兩種因子在MAFLD 病人血清中的表達情況及與糖脂代謝、預后的相關(guān)性，本研究檢測并分析了α-klotho、Gal-3在MAFLD 病人血清中的表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020 年12 月至2021 年12 月來保定市人民醫(yī)院就診并確診為MAFLD 病人112例為研究對象，根據(jù)非酒精性脂肪性肝病肝纖維化評分（NAFLD fibrosis score，NAFLDFS）將病人分為肝纖維化危險組（n=46），其中男25 例，女21 例，年齡（46.33±11.62）歲。無肝纖維化組（n=66）其中男36例，女30例，年齡（45.66±9.65）歲。

納入標準：（1）符合亞太肝病研究學會代謝相關(guān)脂肪性肝病臨床診療指南（2020 版）中MAFLD 的診斷標準［7］；（2）病人年齡范圍為20～60歲。

排除標準：（1）合并嚴重心腦血管疾病、嚴重腎功能不全、感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤病人；（2）精神障礙、智力障礙者；（3）哺乳期、妊娠期婦女或近期準備妊娠者；（4）依從性差者；（5）不穩(wěn)定糖尿病、近3 個月內(nèi)應(yīng)用過節(jié)食減肥治療、近1 個月內(nèi)使用過降脂、降糖或降壓藥物者。按照年齡、性別隨機分層選取50例健康者為對照組，其中男30 例，女20 例，年齡（44.24±10.35）歲。肝纖維化危險組、無肝纖維化組、對照組性別構(gòu)成比、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，并獲得所有受試者的書面同意。

1.2 方法

1.2.1標本采集 病人于治療前，對照組于體檢當日抽取5 mL 空腹靜脈血，并于治療6 個月后采集病人空腹靜脈血5 mL。采用3 000 r/min 離心處理15min，取上層血清置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中α-klotho、Gal-3 水平 ELISA 法檢測α-klotho、Gal-3表達水平。試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，并嚴格根據(jù)制造商的實驗說明書進行檢測。

1.2.3肝纖維化程度評估及預后評估 肝纖維化程度評估：使用NAFLDFS，NAFLDFS=-1.675+0.037×年齡（歲）+0.094×身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（kg/m2）+1.13×糖尿病（是=1，否=0）+0.99×AST/ALT-0.013× 血小板（×109/L）- 0.66× 白蛋白（g/dL）；NAFLDFS＜-1.455 為無肝纖維化，≥-1.455 為肝纖維化危險［8］。

進行基礎(chǔ)治療6 個月之后（均采用相同藥物治療方案，服用脂肪肝顆粒），采用NAFLDFS評估病人預后情況，NAFLDFS 評分＜0.676，為肝纖維化程度較輕，納入預后良好組（n=74）；NAFLDFS 評分≥0.676，為肝纖維化程度較嚴重，納入預后不良組（n=38）［9］。

1.2.4觀察指標 收集所有研究對象臨床一般資料，包括性別、年齡，檢測病人BMI、空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、胰島素抵抗（HOMA-IR）、總膽固醇（total choles terol，TC）、三酰甘油（riacylglycerol，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）、血小板（platelets，PLT）、血清白蛋白（albumin，Alb）等生化指標。HOMA-IR計算公式為FBG×FINS/22.5。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布，以±s表示，兩組定量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)之間比較利用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料采用例（%）表示，進行χ2檢驗；采用Pearson 法分析α-klotho、Gal-3 表達的相關(guān)性，及兩者分別與糖脂代謝指標的相關(guān)性。采用受試者操作特征（ROC）曲線評估α-klotho、Gal-3 對MAFLD 病人預后不良的預測能力，確定α-klotho、Gal-3 評估MAFLD 病人預后不良的靈敏度和特異度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較與對照組相比，肝纖維化危險組與無肝纖維化組MAFLD 病人FBG、FINS、HOMAIR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT 水平升高，HDLc、PLT、Alb 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與無肝纖維化組，肝纖維化危險組病人GGT、FBG、FINS、AST、ALT 水平升高，PLT、Alb 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 代謝相關(guān)脂肪性肝病112例及健康者50例一般資料比較

2.2 各組MAFLD病人血清中α-klotho、Gal-3表達水平比較MAFLD 病人血清中α-klotho 表達水平低于對照組，其中肝纖維化危險組病人血清中α-klotho 表達水平低于無肝纖維化組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MAFLD 病人血清中Gal-3 表達水平高于對照組，其中肝纖維化危險組病人血清中Gal-3表達水平高于無肝纖維化組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 代謝相關(guān)脂肪性肝病112例及健康者50例血清中α-klotho、Gal-3表達水平比較/± s

表2 代謝相關(guān)脂肪性肝病112例及健康者50例血清中α-klotho、Gal-3表達水平比較/± s

注：Gal-3為半乳糖凝聚素-3。①與對照組相比，P＜0.05。②與無肝纖維化組相比，P＜0.05。

組別對照組無肝纖維化組肝纖維化危險組F值P值Gal-3/（μg/L）1.48±0.47 1.96±0.33①2.26±0.50①②40.95＜0.001例數(shù)50 66 46 α-klotho/（ng/L）268.15±82.13 215.51±70.33①140.49±45.16①②42.04＜0.001

2.3 代謝相關(guān)脂肪性肝病治療前后α-klotho、Gal-3表達水平及NAFLDFS評分比較肝纖維化危險組和無肝纖維化組病人治療前后血清中Gal-3、α-klotho水平及NAFLDFS 評分比較，均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 代謝相關(guān)脂肪性肝病治療前后α-klotho、Gal-3表達水平及NAFLDFS評分比較/± s

表3 代謝相關(guān)脂肪性肝病治療前后α-klotho、Gal-3表達水平及NAFLDFS評分比較/± s

注：Gal-3為半乳糖凝聚素-3。

組別肝纖維化危險組α-klotho/（ng/L）Gal-3/（μg/L）NAFLDFS/分例數(shù)46治療前治療后t值P值無肝纖維化組140.49±45.16 205.39±60.21 5.848＜0.001 2.26±0.50 1.86±0.39 4.278＜0.001 1.94±0.05 0.78±0.13 56.485＜0.001 66治療前治療后t值P值-1.81±0.38-3.01±0.97 9.358＜0.001 215.51±70.33 259.44±80.57 3.337 0.001 1.96±0.33 1.55±0.28 7.696＜0.001

2.4 代謝相關(guān)脂肪性肝病不同預后病人α-klotho、Gal-3 表達水平比較預后不良病人血清中Gal-3水平高于預后良好病人，α-klotho 水平低于預后良好病人，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 代謝相關(guān)脂肪性肝病不同預后病人血清中α-klotho、Gal-3表達水平比較/± s

表4 代謝相關(guān)脂肪性肝病不同預后病人血清中α-klotho、Gal-3表達水平比較/± s

注：Gal-3為半乳糖凝聚素-3。

組別預后不良組預后良好組t值P值Gal-3/（μg/L）2.31±0.51 1.97±0.35 4.15＜0.001例數(shù)38 74 α-klotho/（ng/L）135.89±45.67 209.78±67.33 6.08＜0.001

2.5 MAFLD 病人血清中α-klotho、Gal-3表達的相關(guān)性分析相關(guān)分析結(jié)果顯示，MAFLD 病人血清中α-klotho、Gal-3 表達呈顯著負相關(guān)（r=-0.49，P＜0.05）。

2.6 血清中α-klotho、Gal-3 表達與糖脂代謝指標的相關(guān)性分析Pearson 法分析結(jié)果顯示，MAFLD病人血清中α-klotho 表達與FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT 表達呈負相關(guān)，與HDL-c、PLT、Alb 表達呈正相關(guān)（P＜0.05）。Gal-3 表達與FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT表達呈正相關(guān)，與HDL-c、PLT、Alb表達呈負相關(guān)（P＜0.05）。見表5。

表5 血清中α-klotho、Gal-3表達與糖脂代謝指標的相關(guān)性分析

2.7α-klotho、Gal-3水平預測MAFLD 病人預后的ROC 分析ROC 曲線結(jié)果顯示，血清α-klotho、Gal-3 水平評估預后不良病人的曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）分別為0.83，95%CI：（0.75，0.89）；0.84，95%CI：（0.75，0.90），對應(yīng)的靈敏度分別為86.84%、80.90%，特異度分別為66.22%、82.02%。血清α-klotho、Gal-3 水平聯(lián)合評估預后不良病人的AUC 為0.93，95%CI：（0.87，0.97），靈敏度為86.84%，特異度為89.19%。

3 討論

最近，MAFLD 正成為最常見的肝病，影響全球約25%的人口［10］。其發(fā)病率會隨著年齡的增長而增加，如果不加以治療，會發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，大約20%的非酒精性脂肪性肝炎病人會進展為纖維化。大約20%的纖維化病人會發(fā)展為肝硬化，這最終會導致肝臟失代償，并可能增加患肝細胞癌的風險［11-12］。大部分病人在經(jīng)過治療后會預后較好，但因為該疾病的發(fā)病機制及發(fā)病原因較為復雜，仍然有部分病人存在預后不良，嚴重影響人們的生活質(zhì)量［13］。因此，尋找可靠的分子生物標志物來評估MAFLD病人預后迫在眉睫。

Gal-3 是一種β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，是14 種哺乳動物凝集素家族碳水化合物結(jié)合蛋白之一，它在包括細胞黏附和生長在內(nèi)的多種生物過程中發(fā)揮作用。有大量關(guān)于Gal-3 在許多疾病中的文獻，包括纖維化疾病、心血管疾病、心力衰竭、神經(jīng)退行性疾病和各種癌癥［14-15］。研究表明在健康的肝臟中，只有巨噬細胞和膽管細胞表達Gal-3，而在肝硬化病人中，肝細胞是這種蛋白的主要來源［16］。此外何婷等［17］研究表明Gal-3 參與糖代謝異常的發(fā)生，其作用對肥胖、糖尿病、血脂異常等疾病的防治提供了新線索。在本研究中MAFLD病人血清中Gal-3表達水平高于健康者，且隨著MAFLD 病人肝纖維化的發(fā)生而升高。預后不良病人血清中Gal-3 水平高于預后良好病人，提示Gal-3 表達升高與MAFLD 疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能預示MAFLD 病情越嚴重以及預后不良。與健康者相比，MAFLD 病人血清中FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT 表達水平均升高，HDL-c、PLT、Alb 表達水平均降低，這與王艷等［18］研究結(jié)果相一致。相關(guān)性分析顯示Gal-3 在MAFLD 病人血清中的表達與FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT 表達呈正相關(guān)，與HDL-c、PLT、Alb 表達呈負相關(guān)，表明MAFLD 病人肝臟糖脂代謝均發(fā)生異常，可能通過破壞機體代謝平衡參與疾病發(fā)展進程。本研究發(fā)現(xiàn)，血清Gal-3 水平評估預后不良病人的AUC 為0.84，對應(yīng)的靈敏度為80.90%，特異度為82.02%。提示Gal-3水平在MAFLD病人預后判斷中有一定價值，對病人制定適宜的治療方案具有重要意義。

Klotho基因家族，包括α-、β-和γ-Klotho，在調(diào)節(jié)人類衰老和與年齡相關(guān)的疾病發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［19］。其中α-Klotho 蛋白是一種130 kDa 的單跨膜蛋白，其表達已在腎臟和甲狀旁腺中得到證實［20］。聶禮強等［21］研究表明α-Klotho可能通過引起糖脂代謝紊亂等導致腎臟炎癥反應(yīng)參與2型糖尿病腎病的病情進展。在本研究中MAFLD 病人血清中α-klotho 表達水平低于健康者，且隨著肝纖維化以及預后不良的發(fā)生而逐漸降低，進一步通過相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)α-klotho 與Gal-3 表達呈負相關(guān)，提示α-klotho與Gal-3之間可能存在負反饋調(diào)節(jié)機制，共同參與MAFLD 的發(fā)生、發(fā)展過程。此外α-klotho 與糖脂代謝指標均存在相關(guān)性，表明α-klotho 表達與糖脂水平密切相關(guān)，提示可通過調(diào)節(jié)病人血清中α-klotho表達水平，控制病人體內(nèi)糖脂代謝水平，并進一步改善病人預后。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血清α-klotho 水平評估預后不良病人的AUC 為0.83，對應(yīng)的靈敏度為86.84%，特異度為66.22%。血清α-klotho、Gal-3 水平聯(lián)合評估的AUC 為0.93，靈敏度為86.84%，特異度為89.19%，提示α-klotho、Gal-3 二者聯(lián)合應(yīng)用于MAFLD 病人預后評估的臨床價值優(yōu)于單一指標。

綜上所述，α-klotho 在MAFLD 病人血清中表達降低，Gal-3表達升高，二者與MAFLD 病人糖脂水平和預后密切相關(guān)，可為MAFLD 疾病進展和預后評估提供參考依據(jù)，α-klotho、Gal-3可能是一種新型的MAFLD 血清生物標志物，具有重要的臨床意義。但本研究尚未探討其中的作用機制，未來將進一步揭示α-klotho、Gal-3在MAFLD中的具體機制。