微RNA-204-5p、蛋白鋅指E盒結合同源盒蛋白1在新生兒肺炎血清中的表達

白彥紅，陳華，謝影，王少君

作者單位：張家口市婦幼保健院新生兒科，河北 張家口 075000

新生兒肺發育不完善，易受細菌和病毒感染而引發肺炎，近年來隨著技術水平的進步，新生兒肺炎（NP）發病率和病死率都有所降低，但NP 仍舊是全球范圍內影響新生兒健康的主要原因之一，尤其是在發展中國家［1-2］。肺炎經常表現為涉及多個器官系統的全身性惡化，新生兒常見的非感染性呼吸道并發癥常與肺炎并存并加重肺炎，若不能得到及時的針對性治療，可能引起病兒呼吸衰竭甚至死亡［3-4］。而及早評估病情對確認最佳治療方案至關重要。血清學檢查在評估NP 病情上的應用逐漸受到認可［5-6］，然而缺乏有效的預后預測標志物。研究顯示，微RNA-204-5p（miR-204-5p）在非小細胞肺癌組織高表達，隨病情加重而顯著降低［7］；蛋白鋅指E盒結合同源盒蛋白1（ZEB1）是一種鋅指轉錄因子，通過調節上皮鈣黏素和波形蛋白來誘導上皮-間質轉化［8］。另外，ZEB1是miR-204的直接靶標，在肺支氣管上皮細胞中miR-204/ZEB1 軸能夠促進EMT 和惡性轉化［9］。然而關于miR-204-5p、ZEB1 在NP 病兒血清中的表達情況及其在病情評估及預后預測中的價值目前尚無統一定論。本研究檢測NP 病兒血清中miR-204-5p 與ZEB1 的表達水平并分析其與病情嚴重程度的關系及預測NP 病兒預后的價值，期望為NP 病情評估及預后預測提供有價值的臨床生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2021 年10 月至2022 年5 月張家口市婦幼保健院收治的NP 病兒80 例為NP 組，其中男42 例，女38 例；順產50 例，剖宮產30 例；日齡范圍為4～28 d，日齡（16.50±6.38）d；胎齡范圍為35～40周。依據臨床肺部感染評分（CPIS）評分（總分12分）對NP 病兒進行分組，分為輕癥組（49 例，＜6 分）和重癥組（31 例，≥6 分）；根據病兒預后情況分為預后良好（58 例）和預后不良（22 例）兩個亞組。納入標準：（1）根據《實用新生兒學（第4 版）》中NP 的診斷標準［10］，結合病兒臨床表現、胸部X線和實驗室檢查確診為NP；（2）出生時間≤28 d；（3）監護人知曉研究過程并自愿配合。排除標準：（1）先天性支氣管疾病；（2）其他出生疾病如新生兒腦性疾病、全身炎癥、胎糞吸入綜合征及伴有出生窒息等；（3）伴其他影響血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）及C 反應蛋白（CRP）水平的疾病。另選取同期張家口市婦幼保健院出生的健康新生兒80 例作為對照組，其中男45 例、女35 例，順產55 例、剖宮產25 例，日齡范圍為3～28 d，日齡（16.51±6.89）d，胎齡范圍為36～42 周，兩組的性別、年齡、生產方式和胎齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 檢測方法實時熒光定量PCR 法檢測血清miR-204-5p 相對表達水平：取病兒空腹靜脈血3mL，離心后取上清液，分為兩份，置于無菌抗凝管中，保存待測。取其中一份，室溫解凍，依據Trizol試劑（Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher）所述操作步驟提取總RNA，并測定其濃度和純度，逆轉錄試劑盒（Takara 提供）逆轉錄合成cDNA，采用ABI 7500型qRT-PCR 儀（ABI 公司，美國）檢測血清中miR-204-5p相對表達水平，以U6為內參。各樣品重復3 次以減小實驗誤差，2-ΔΔCt法（Ct 表示循環閾值）計算目的基因miR-204-5p的相對表達量。

取另一份血清用于ZEB1、CK、CK-MB及CRP的檢測，ZEB1、CRP測定使用酶聯免疫吸附法（ELISA）法，試劑盒購自日本SHINO-TEST 公司；CK、CK-MB測定采用速率法，全自動生化分析儀和檢測用試劑盒均由美國GEM公司提供，依據試劑盒說明操作。

1.3 統計學方法采用SPSS 25.0 進行數據處理，計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料各組血清中miR-204-5p、ZEB1等的表達水平以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，采用Pearson 法分析NP病兒血清miR-204-5p、ZEB1水平及其與臨床指標的相關性；應用受試者操作特征（ROC）曲線分析miR-204-5p、ZEB1 及二者聯合預測NP 不良預后的價值。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NP 組與對照組臨床指標的比較NP 組血清miR-204-5p 水平、血氧飽和度顯著低于對照組，血清ZEB1、CK-MB 及CRP 水平顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 新生兒肺炎（NP）組與對照組臨床指標比較/± s

表1 新生兒肺炎（NP）組與對照組臨床指標比較/± s

注：miR-204-5p為微RNA-204-5p，ZEB1為蛋白鋅指E盒結合同源盒蛋白1，CK-MB為肌酸激酶同工酶，CRP為C反應蛋白。

組別對照組NP組t值P值CRP/（mg/L）3.31±0.71 18.09±4.29 30.40＜0.001例數80 80 miR-204-5p 1.01±0.21 0.47±0.16 18.30＜0.001 ZEB1/（ng/L）2.15±0.36 4.76±0.71 29.32＜0.001血氧飽和度/%95.32±6.74 83.99±6.15 11.11＜0.001 CK-MB/（U/L）23.22±9.64 46.25±12.52 13.04＜0.001

2.2 不同病情NP病兒臨床指標比較重癥組血清miR-204-5p 水平、血氧飽和度顯著低于輕癥組，血清ZEB1、CK-MB 及CRP 水平顯著高于輕癥組（P＜0.05）。見表2。

表2 不同病情新生兒肺炎（NP）臨床指標比較/± s

表2 不同病情新生兒肺炎（NP）臨床指標比較/± s

注：miR-204-5p為微RNA-204-5p，ZEB1為蛋白鋅指E盒結合同源盒蛋白1，CK-MB為肌酸激酶同工酶，CRP為C反應蛋白。

組別輕癥組重癥組t值P值CRP/（mg/L）11.21±3.22 28.96±6.59 16.10＜0.001例數49 31 miR-204-5p 0.51±0.14 0.41±0.11 3.37 0.001 ZEB1/（ng/L）4.06±0.17 5.87±0.23 40.39＜0.001血氧飽和度/%87.52±6.34 78.41±5.85 6.45＜0.001 CK-MB/（U/L）35.28±9.28 63.59±10.81 12.46＜0.001

2.3 miR-204-5p、ZEB1 水平之間及二者與臨床指標的相關性血清miR-204-5p 水平與CPIS 評分、CK-MB 及CRP 水平呈負相關（r=-0.33、-0.30、-0.40，P＜0.05），與血氧飽和度呈正相關（r=0.41，P＜0.05）；血清ZEB1 水平與CPIS 評分、CK-MB 及CRP水平呈正相關（r=0.28、0.37、0.44，P＜0.05），與血氧飽和度呈負相關（r=-0.36，P＜0.05）。血清miR-204-5p水平與ZEB1水平呈負相關（r=-0.56，P＜0.05）。

2.4 不同預后NP病兒臨床指標比較預后不良組血清miR-204-5p 水平、血氧飽和度低于預后良好組（P＜0.05），血清ZEB1、CK、CK-MB 及CRP 水平均顯著高于預后良好組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同預后新生兒肺炎（NP）臨床指標比較/± s

表3 不同預后新生兒肺炎（NP）臨床指標比較/± s

注：miR-204-5p為微RNA-204-5p，ZEB1為蛋白鋅指E盒結合同源盒蛋白1，CK-MB為肌酸激酶同工酶，CRP為C反應蛋白。

組別預后良好預后不良t值P值CRP/（mg/L）11.37±2.35 35.81±4.83 30.39＜0.001例數58 22 miR-204-5p 0.52±0.14 0.35±0.11 5.12＜0.001 ZEB1/（ng/L）4.02±1.26 6.71±1.61 7.88＜0.001血氧飽和度/%87.63±5.74 74.39±7.23 8.56＜0.001 CK-MB/（U/L）34.00±8.56 78.54±21.47 13.35＜0.001

2.5 miR-204-5p、ZEB1 預測NP 不良預后的價值miR-204-5p 對NP 不良預后預測的AUC 為0.89，截斷值為0.47，其靈敏度、特異度分別為95.12%、72.41%；ZEB1 對NP 不良預后預測的AUC 為0.92，截斷值為5.16，其靈敏度、特異度分別為87.80%、86.21%；二者聯合對NP 不良預后預測的AUC 為0.99，明顯高于二者單獨診斷，其靈敏度、特異度分別為97.56%、94.83%。

3 討論

與兒童和成人相比，新生兒先天免疫系統未成熟，肺等呼吸系統發育不健全，抵御肺部感染的能力有限［11］。一般輕癥NP 癥狀輕、治療有效、預后良好，而重癥NP 起病急、不易治療、并發癥多，預后較差［12］，因此尋找NP 病情評估及預后預測標志物對提升病兒預后非常重要。

真核生物體內存在多種miRNA，是一類高度保守性的長度約13-27 個核苷酸非編碼RNA，可以與下游靶基因的3'-非翻譯區結合，抑制翻譯或降解mRNA，進而對疾病進展起到調控作用［13］。相關研究表明，miR-204-5p 與肺部疾病如非小細胞肺癌關系密切，引入miR-204-5p 及其靶標對于肺癌的治療及預后改善具有積極作用［14］。而降低miR-204-5p會逆轉上皮細胞的上皮-間質轉化、增殖和遷移過程［15］。在本研究中，NP病兒血清miR-204-5p水平顯著低于健康新生兒，與Luo 等［9］研究結果相似，表明miR-204-5p 與NP 的發生有關。重癥組血清miR-204-5p 水平顯著低于輕癥組，且血清miR-204-5p 水平與CPIS 評分、CK-MB 及CRP 水平呈負相關（r=-0.33、-0.30、-0.40），與血氧飽和度呈正相關（r=0.41），提示miR-204-5p 水平與NP 病情嚴重程度密切相關，miR-204-5p 可能參與了NP 病情的發生發展。機體缺氧時心肌細胞受損嚴重，心肌損害是導致NP 病兒死亡的重要原因之一，NP 病兒均有不同程度的心肌損傷，且NP 病兒心肌損傷隨病情加重而加重［16-17］；而CPIS評分是評估NP病兒臨床感染程度的指標。結合本研究相關性分析結果，推測miR-204-5p可能參與NP病兒肺部感染致心肌損害進程，然而其機制不清楚。本研究還顯示，預后不良組血清miR-204-5p 水平低于預后良好組，miR-204-5p 對NP不良預后預測的AUC為0.89，靈敏度較高但特異度不高，對NP不良預后具有一定的預測價值。

ZEB1參與多種肺部疾病如肺癌［18］、肺纖維化［19］等進展。有證據表明，ZEB1可介導人肺泡上皮Ⅱ型細胞的EMT，并向潛在成纖維細胞發出信號，促進肺纖維化的發展［10］。在本研究中，NP 病兒血清ZEB1水平高于健康新生兒，提示ZEB1與NP的發生有關，且病情越嚴重ZEB1 水平越高，說明NP 病兒的病情進展過程中可能有ZEB1 的參與。而血清ZEB1 水平與CPIS 評分、CK-MB 及CRP 水平呈正相關（r=0.28、0.37、0.44），與血氧飽和度呈負相關（r=-0.36），說明ZEB1 對NP 病情起負向調控作用。另外，NP 病兒血清miR-204-5p 水平與ZEB1 水平呈負相關，這與網站預測的miR-204-5p 與ZEB1 存在靶向關系相一致，推測miR-204-5p 可能通過調節ZEB1 共同參與NP 病情調節。進一步分析顯示，預后不良組血清ZEB1 水平高于預后良好組，ZEB1 對NP 不良預后預測也具有一定價值，而miR-204-5p、ZEB1 聯合對NP 不良預后預測的AUC 為0.99，明顯高于二者單獨診斷，其靈敏度、特異度分別為97.56%、94.83%，說明二者聯合對NP 不良預后具有較高的預測價值，有望成為預測NP 預后評估的血清指標。

綜上所述，miR-204-5p 在NP 病兒血清中低表達，ZEB1 在NP 病兒血清中高表達，二者均與NP 病情嚴重程度有關，miR-204-5p、ZEB1 聯合對NP 不良預后具有較高的預測價值。但本研究納入樣本量相對較少，關于miR-204-5p 與ZEB1 參與NP 病情進展的具體機制仍需深入探索。