長(zhǎng)鏈非編碼RNA DNAJC3-AS1、微RNA-214-3p在結(jié)腸癌組織、結(jié)腸腺瘤性息肉中的表達(dá)水平及臨床意義

曹志軍，張智偉，李志國(guó)，李碩

作者單位：北京市豐臺(tái)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)分泌科，北京 100072

結(jié)腸癌（colon cancer， CC）是一種消化道腫瘤，其發(fā)病率、病死率居高不下，防治結(jié)腸癌形式嚴(yán)峻［1-2］。因此，尋找可診治結(jié)腸癌、評(píng)估結(jié)腸癌病人預(yù)后的分子標(biāo)志物，對(duì)改善結(jié)腸癌病人預(yù)后有積極意義。研究發(fā)現(xiàn)，自噬、生活方式、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）表達(dá)失調(diào)、生活環(huán)境、微RNA（microRNA， miRNA）異常表達(dá)等均與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)［3-4］。lncRNA DNAJC3-AS1 是lncRNA 的一員，其在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，lncRNA DNAJC3-AS1 通過(guò)調(diào)節(jié)微RNA-214-3p（microRNA-214-3p， miR-214-3p）表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展，lncRNA DNAJC3-AS1 有望成為診治結(jié)腸癌的潛在靶標(biāo)［5］。結(jié)腸腺瘤性息肉作為結(jié)腸癌的癌前病變，lncRNA DNAJC3-AS1 在其組織中表達(dá)情況及l(fā)ncRNA DNAJC3-AS1 與miR-214-3p 的關(guān)系尚需進(jìn)一步探究。因此，本研究檢測(cè)lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p 在不同結(jié)腸疾病中的表達(dá)水平，分析lncRNA DNAJC3-AS1 在結(jié)腸癌中與miR-214-3p 的相關(guān)性，探究lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p 與結(jié)腸癌病人預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016 年5 月至2019 年1 月北京市豐臺(tái)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的結(jié)腸癌病人86例，其中男47 例，女39 例；年齡范圍為46～72 歲，年齡（59.73±10.34）歲；＜60 歲、≥60 歲各43 例；淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移分別54、32例；腫瘤長(zhǎng)徑＜5 cm、≥5 cm 分別50、36 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期57 例，Ⅲ～Ⅳ期29例；血管浸潤(rùn)23 例，血管未浸潤(rùn)63 例；分化程度：低分化25 例，中、高分化61 例。另納入同期經(jīng)病理學(xué)診斷為結(jié)腸腺瘤性息肉的病人53 例，男27 例，女26例；年齡范圍為46～72歲，年齡（58.44±10.12）歲。本研究獲得北京市豐臺(tái)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批號(hào)YLL059）。

結(jié)腸癌納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《NCCN 結(jié)腸癌臨床診療指南解讀）》［6］中結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）受試者對(duì)本研究均知情同意；（3）檢查資料完善，經(jīng)術(shù)后病理確診為原發(fā)性結(jié)腸癌；（4）術(shù)前未接受放化療、激素等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）隨訪資料缺失者；（2）病理診斷不確切者；（3）有嚴(yán)重肺、肝、心、腎功能不全者。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)庫(kù)檢索基本表達(dá)情況 使用lnCAR 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//lncar.renlab.org/#1st-screen），仔細(xì)檢索lncRNA DNAJC3-AS1 在不同結(jié)腸組織中的基本情況。

1.2.2采集標(biāo)本 于手術(shù)時(shí)或進(jìn)行腸鏡時(shí)采集受試者不同結(jié)腸組織或息肉，包括結(jié)腸癌組織、癌旁組織（距結(jié)腸癌腫瘤邊緣＞4 cm）或結(jié)腸腺瘤性息肉，而后以生理鹽水對(duì)采集到的樣本進(jìn)行仔細(xì)地清理，并立即放入液氮罐過(guò)夜，而后于-70 ℃冰箱存儲(chǔ)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測(cè)組織lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p表達(dá)水平 首先將樣本全部研碎，提取總RNA（TRIzol Reagent，上海信帆生物，A1084）、制備cDNA（M-MLV first strand cDNA Synthesis Kit，OMEGA，TQ2501-01）、擴(kuò)增cDNA（SYBR Green Realtime PCR Master Mix，南京賽泓瑞，QPK-201；熒光定量PCR 儀，ABI 公司，ViiA7）、得CT 值。擴(kuò)增數(shù)據(jù)設(shè)置：97.4 ℃ 9 min；96.3 ℃ 20 s，62.5 ℃ 40 s，60 ℃15 s，40 個(gè)循環(huán)。內(nèi)參選擇：GAPDH、U6，序列見表1。兩目的基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 lncRNA DNAJC3-AS1及其內(nèi)參GAPDH，miR-214-3p及其內(nèi)參U6引物序列

1.2.4生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)相關(guān)性 采用網(wǎng)站（https：//starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測(cè)lncRNA DNAJC3-AS1與miR-214-3p的可能相關(guān)性。

1.3 隨訪結(jié)腸癌病人進(jìn)行為期8～36 個(gè)月的隨訪，期間全面記錄其生存情況，以電話/門診為主要隨訪方式，此次隨訪的起點(diǎn)為手術(shù)次日，終點(diǎn)為2022年1月或死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s描述，兩組間比較行t檢驗(yàn)，三組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)水平與miR-214-3p 相關(guān)性以Pearson 法分析；結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p 表達(dá)水平與結(jié)腸癌病人預(yù)后的關(guān)系使用Kaplan-Meier生存曲線分析，行l(wèi)ogrank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 lnCAR 數(shù)據(jù)庫(kù)中正常結(jié)腸組織、結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)水平比較lnCAR 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，與正常結(jié)腸組織（4.00±0.36）相比，結(jié)腸癌組織（4.40±0.49）lncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)水平升高（t=3.62，P＜0.05）。

2.2 癌旁/結(jié)腸癌組織、結(jié)腸腺瘤性息肉中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p 表達(dá)水平比較結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)水平較癌旁、息肉中更高（P＜0.05），miR-214-3p 表達(dá)水平低于癌旁組織、結(jié)腸腺瘤性息肉（P＜0.05）；結(jié)腸腺瘤性息肉中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)水平較癌旁高（P＜0.05），miR-214-3p表達(dá)水平較癌旁低（P＜0.05）。見表2。

表2 癌旁/結(jié)腸癌組織、結(jié)腸腺瘤性息肉lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p表達(dá)水平比較/± s

表2 癌旁/結(jié)腸癌組織、結(jié)腸腺瘤性息肉lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p表達(dá)水平比較/± s

注：lncRNA DNAJC3-AS1為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）DNAJC3-AS1，miR-214-3p為微RNA-214-3p。①與癌旁組織比較，P＜0.05。②與結(jié)腸腺瘤性息肉比較，P＜0.05。

miR-214-3p 1.01±0.34 0.67±0.22①0.31±0.10①②177.31＜0.001組別癌旁組織結(jié)腸腺瘤性息肉結(jié)腸癌組織F值P值例數(shù)86 53 86 lncRNA DNAJC3-AS1 1.04±0.35 1.71±0.57①2.63±0.88①②130.32＜0.001

2.3 結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p 表達(dá)水平與病理特征關(guān)系分析以結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p 檢測(cè)結(jié)果均值（2.63、0.31）為界，低于均值為低表達(dá)組，lncRNA DNAJC3-AS1（42 例）、miR-214-3p（45 例），以高于或等于均值為高表達(dá)組，lncRNA DNAJC3-AS1（44例）、miR-214-3p（41 例）。結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p 表達(dá)水平在性別、年齡、腫瘤大小方面，分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)、TNM 分期方面，分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p表達(dá)水平與結(jié)腸癌病人臨床病理特征關(guān)系/例（%）

2.4 結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)水平與miR-214-3p的相關(guān)性生物信息學(xué)分析顯示，lncRNA DNAJC3-AS1與miR-214-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。

結(jié)腸癌組織中，經(jīng)Pearson 法分析，結(jié)果提示，lncRNA DNAJC3-AS1 與miR-214-3p 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.58，P＜0.05）。見圖1。

圖1 結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)水平與miR-214-3p的相關(guān)性

2.5 結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p 表達(dá)水平與結(jié)腸癌病人預(yù)后的關(guān)系隨訪全部結(jié)束后，86例結(jié)腸癌病人共死亡21例。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，lncRNA DNAJC3-AS1 低表達(dá)組生存期34.69 個(gè)月，95%CI：（33.37，36.02），長(zhǎng)于lncRNA DNAJC3-AS1 高表達(dá)組29.75 個(gè)月，95%CI：（27.01，32.49），log-rank 檢驗(yàn)顯示，累積生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.96，P=0.002）；miR-214-3p 低表達(dá)組生存期30.16 個(gè)月，95%CI：（27.51，32.80），短于高表達(dá)組34.37 個(gè)月，95%CI：（32.83，35.90），log-rank 檢驗(yàn)顯示，累積生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.52，P=0.011）。

3 討論

結(jié)腸癌是一種發(fā)生率較高的胃腸道腫瘤，多數(shù)結(jié)腸癌病人是由腺瘤性息肉發(fā)展而成，若在病變?cè)缙谶M(jìn)行干預(yù)治療，則可較好地改善結(jié)腸癌預(yù)后［7-8］。因此，積極尋找與結(jié)腸腺瘤性息肉、結(jié)腸癌相關(guān)，且可評(píng)估結(jié)腸癌預(yù)后的指標(biāo)，對(duì)延長(zhǎng)結(jié)腸癌病人生存期尤其重要。

lncRNA 可與miRNA 結(jié)合，并對(duì)miRNA 調(diào)控下游靶基因之過(guò)程產(chǎn)生作用［9-11］。近期報(bào)道顯示，lncRNA ROR1-AS1 在結(jié)腸癌中呈過(guò)表達(dá)，其可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，從而在結(jié)腸癌發(fā)展中起促進(jìn)作用［12］；另外，lncRNA 小核仁RNA 宿主基因12 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-15a 表達(dá)，進(jìn)而在結(jié)腸癌中發(fā)揮促進(jìn)作用，為治療結(jié)腸癌提供新靶點(diǎn)［13］。以上研究表明，lncRNA 可能參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。近期研究顯示，lncRNA DNAJC3-AS1 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，其通過(guò)調(diào)節(jié)miR-27b 表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)展，lncRNA DNAJC3-AS1 可能是治療肝細(xì)胞癌的潛在靶點(diǎn)［14］；Tang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DNAJC3-AS1 通過(guò)影響相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）發(fā)展，且其與CRC 病人預(yù)后有關(guān)，lncRNA DNAJC3-AS1 有望成為診治CRC的新靶點(diǎn)。本研究顯示，結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)水平高于癌旁組織、結(jié)腸腺瘤性息肉，與Han 等［5］的發(fā)現(xiàn)一致，且符合lnCAR 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索趨勢(shì)，提示lncRNA DNAJC3-AS1 可能與結(jié)腸癌病理變化關(guān)系密切，分析原因，lncRNA DNAJC3-AS1 可調(diào)節(jié)miRNA 表達(dá)，并在此過(guò)程中參與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及凋亡，因此發(fā)揮了一定的促癌作用；且結(jié)腸腺瘤性息肉中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)水平高于癌旁組織，提示lncRNA DNAJC3-AS1可能參與結(jié)腸腺瘤性息肉發(fā)生發(fā)展，測(cè)定結(jié)腸組織lncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)水平，可能有助于臨床判定病人病情。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)水平在不同分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)等情況下分布顯著不同，提示lncRNA DNAJC3-AS1 可能影響結(jié)腸癌疾病進(jìn)展，檢測(cè)結(jié)腸癌組織lncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)水平可輔助判斷結(jié)腸癌病人病情，有益于臨床制定針對(duì)性治療方案。此外，本研究中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1 高表達(dá)組結(jié)腸癌病人累積生存率低于lncRNA DNAJC3-AS1 低表達(dá)組，提示lncRNA DNAJC3-AS1與結(jié)腸癌病人預(yù)后密切相關(guān)，lncRNA DNAJC3-AS1有望成為評(píng)估結(jié)腸癌病人預(yù)后的標(biāo)志物。

miRNA 可參與血管生成，與結(jié)腸癌的細(xì)胞增殖有關(guān)，并且參與了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）的控制，與胃癌、結(jié)腸癌病理發(fā)展相關(guān)［16-18］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-214-3p 作為miRNA 的一員，其在肝細(xì)胞癌中低表達(dá)，miR-214-3p 可與靶基因結(jié)合進(jìn)而在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用［19］；另外，miR-214-3p 在CRC 中表達(dá)下調(diào)，其靶向結(jié)合有關(guān)基因，進(jìn)而抑制CRC 的惡性行為，miR-214-3p可能是CRC 的治療靶點(diǎn)［20］。本研究中癌旁組織、結(jié)腸腺瘤性息肉、結(jié)腸癌組織的miR-214-3p 檢測(cè)結(jié)果逐步降低，類似于與Han 等［5］的發(fā)現(xiàn)，提示miR-214-3p 或許與結(jié)腸癌的初步病變有關(guān)，推測(cè)低水平miR-214-3p 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用減弱，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡能力降低，從而影響結(jié)腸癌發(fā)展。為探究其與病理的關(guān)系進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌病人處于低分化、TNM 后期（Ⅲ～Ⅳ期）、有血管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)下時(shí)miR-214-3p 低表達(dá)比例更高，因此miR-214-3p 除與結(jié)腸癌發(fā)病有關(guān)外還可能與進(jìn)展有關(guān)，此結(jié)果提示miR-214-3p 可能用于結(jié)腸癌的診治及嚴(yán)重程度輔助判斷。此外，本研究中miR-214-3p 低表達(dá)結(jié)腸癌病人累積生存率更低，提示結(jié)腸癌病人組織中miR-214-3p 檢測(cè)結(jié)果越低，則預(yù)后也越差，檢測(cè)結(jié)腸癌組織miR-214-3p 表達(dá)水平有利于評(píng)估結(jié)腸癌病人預(yù)后情況。

經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA DNAJC3-AS1與miR-214-3p 具有結(jié)合位點(diǎn)。為驗(yàn)證本研究與網(wǎng)站的一致性，進(jìn)行了進(jìn)一步的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，二者水平呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能共同影響結(jié)腸癌發(fā)生及病理進(jìn)展過(guò)程，推測(cè)二者可靶向結(jié)合，進(jìn)而協(xié)同影響結(jié)腸癌疾病過(guò)程，但其機(jī)制后期將結(jié)合基礎(chǔ)研究，進(jìn)行深入探討。

綜上，癌旁組織、結(jié)腸腺瘤性息肉、結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1 表達(dá)依次上調(diào)，miR-214-3p表達(dá)依次下調(diào)，結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA DNAJC3-AS1表達(dá)水平與miR-214-3p 呈負(fù)相關(guān)，且二者均與部分病理特征如分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)、TNM分期等及病人預(yù)后相關(guān)，臨床上可為結(jié)腸癌的輔助診治及疾病進(jìn)展程度提供一定的參考且可為結(jié)腸癌的預(yù)后預(yù)測(cè)發(fā)展新策略。但本研究屬小樣本分析，下一步將利用大規(guī)模樣本驗(yàn)證lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p與結(jié)腸癌病人預(yù)后的關(guān)系。