CC類趨化因子22、叉頭框蛋白P1在急性髓系白血病外周血中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

胡婕，劉瑞菡，王高翔，熊婷，黃欣，程利民

作者單位：1孝感市中心醫(yī)院，a血液內(nèi)科，b檢驗(yàn)科，湖北 孝感 432099；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院血液內(nèi)科，湖北 武漢 430030；3咸寧市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，湖北 咸寧 437199

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種常見的血液系統(tǒng)疾病，是白血病中發(fā)病率最高的類型［1］，近年來(lái)，其發(fā)病率和病死率均呈不斷上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響到病人的生活質(zhì)量和生命安全，導(dǎo)致病人5 年生存率降低［2］。該病可能由遺傳因素、化學(xué)因素以及環(huán)境因素等共同作用導(dǎo)致［3］，然而其具體發(fā)病機(jī)制仍未知。CC 類趨化因子22（C-C class chemokine 22，CCL22）作為一種趨化因子，可以趨化T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等，通過(guò)抑制機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展［4］。Wu等［5］研究發(fā)現(xiàn)，CCL22水平對(duì)AML病人的總體生存時(shí)間產(chǎn)生較大的威脅，有望成為潛在的預(yù)后標(biāo)志物。叉頭框蛋白P1（Forkhead box P1，F(xiàn)OXP1）屬于重要的叉頭轉(zhuǎn)錄因子，與心肌細(xì)胞發(fā)育、免疫細(xì)胞分化以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元多樣性等相關(guān)［6］。有研究報(bào)道，診斷時(shí)FOXP1基因表達(dá)升高的AML病人在強(qiáng)化誘導(dǎo)化療和自體干細(xì)胞移植后的總生存期明顯縮短，表明FOXP1 是AML 的不良預(yù)后標(biāo)志物［7］。但有關(guān)CCL20、FOXP1 兩者在AML 病人外周血中的表達(dá)情況及預(yù)后價(jià)值的臨床研究少之又少。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)AML 病人外周血中CCL22、FOXP1 的表達(dá)，探討兩者在AML 中的作用及關(guān)系，初步討論外周血中CCL22、FOXP1 表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系，以期為改善AML病人預(yù)后提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018 年5 月至2019 年5 月在孝感市中心醫(yī)院及華中科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，咸寧市中心醫(yī)院確診的68 例AML 病人設(shè)為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：病人經(jīng)臨床病理診斷確診為AML［8］；病人及其近親屬了解本研究并簽署知情同意書；首次確診并接受治療；研究對(duì)象入院前未進(jìn)行過(guò)手術(shù)、放療、化療等治療；研究對(duì)象隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：研究對(duì)象精神狀態(tài)異常，無(wú)法正常交流溝通者；合并其他部位腫瘤；有自身免疫性疾病、全身感染性疾病者；研究對(duì)象臨床信息不完整。收集整理病人年齡、性別、脾腫大、染色體預(yù)后、血紅蛋白（HGB）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）及病人的基因突變情況，主要包括FMS 樣酪氨酸激酶3-內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)基因（FLT3-ITD）、核仁磷酸蛋白基因1（NPM1）等臨床資料。觀察組中男性35 例，女性33 例；年齡范圍為20～76 歲，年齡（46.67±7.89）歲；FAB 分型：M1型11例、M2型40例、M3 型10 例、M4 型7 例；AML 危險(xiǎn)分層：低危組12例，中危組34 例，高危組22 例。另選取同期健康體檢者68 例為對(duì)照組，其中男性30 例，女性38 例；年齡范圍為22～75歲，年齡（46.11±8.09）歲。兩組性別（χ2=0.74，P=0.391）和年齡（t=0.41，P=0.683）比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 治療方案3 個(gè)中心的所有AML 病人入組后均接受以下標(biāo)準(zhǔn)治療方案，主要包括DA 方案，柔紅霉素+阿糖胞苷；IA 方案，去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷；MA 方案，米托蒽醌+阿糖胞苷；HA 方案，高三尖杉酯堿+阿糖胞苷，需根據(jù)病人的病情及自身耐受情況選擇合適的治療方案。

1.3 儀器與試劑全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)買于Thermo 公司（型號(hào)PerkinElme EnSpirer）；人CCL22酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒（貨號(hào)SP10226）購(gòu)買于武漢賽培生物科技有限公司，人FOXP1 ELISA 試劑盒（貨號(hào)JH-H10478）購(gòu)買于上海繼和生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1ELISA 法檢測(cè) 采集AML 病人初診時(shí)外周血與健康體檢者體檢當(dāng)日的空腹外周血5 mL，靜置30 min 后，3 000 r/min，離心10 min，收取上清液，分裝于無(wú)菌EP 管中，保存在-20 ℃冰箱定時(shí)統(tǒng)一檢測(cè)。采用ELISA 法檢測(cè)AML 病人與健康體檢者外周血中CCL22，F(xiàn)OXP1 表達(dá)情況，具體操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各樣本在450 nm 處的吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線計(jì)算兩組外周血CCL22，F(xiàn)OXP1水平。

1.4.2隨訪 所有病人出院后采用門診、電話等形式定期隨訪，隨訪截至2022 年5 月，終點(diǎn)事件為病人死亡。統(tǒng)計(jì)病人總體生存時(shí)間（OS），OS 為手術(shù)開始至末次隨訪或死亡的時(shí)間，計(jì)算3年總生存率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以±s描述，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；Pearson 法分析AML 病人外周血中CCL22 與FOXP1 表達(dá)的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier 生存法分析AML 病人術(shù)后OS，比較采用log-rank 檢驗(yàn)；采用Cox 回歸分析AML 病人預(yù)后死亡的影響因素。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血中CCL22，F(xiàn)OXP1 表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，觀察組初診時(shí)外周血中CCL22，F(xiàn)OXP1表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 急性髓系白血病68例與對(duì)照組外周血中CC類趨化因子22（CCL22）、叉頭框蛋白P1（FOXP1）的表達(dá)情況/（ng/L，± s）

表1 急性髓系白血病68例與對(duì)照組外周血中CC類趨化因子22（CCL22）、叉頭框蛋白P1（FOXP1）的表達(dá)情況/（ng/L，± s）

組別對(duì)照組觀察組t值P值例數(shù)68 68 CCL22 600.27±62.89 756.84±100.86 10.86＜0.001 FOXP1 56.02±13.68 103.06±22.16 14.90＜0.001

2.2 CCL22，F(xiàn)OXP1 表達(dá)與AML 病人臨床特征的關(guān)系為維持兩組樣本例數(shù)的一致性，本研究分別以CCL22，F(xiàn)OXP1 表達(dá)水平中位值753.39 ng/L，101.00 ng/L 為臨界值，將病人分為CCL22 高、低表達(dá)、FOXP1 高、低表達(dá)組，各34 例。CCL22，F(xiàn)OXP1表達(dá)水平與病人年齡、性別、染色體預(yù)后、HGB、PLT、FLT3-ITD、NPM1 突變無(wú)關(guān)（P＞0.05），與脾腫大、WBC有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 AML外周血中CCL22、FOXP1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系/例（%）

2.3 AML 病人外周血CCL22，F(xiàn)OXP1 的相關(guān)性Pearson 法分析結(jié)果顯示，AML 病人外周血中CCL22，F(xiàn)OXP1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.27，P＜0.05）。

2.4 AML 病人外周血CCL22，F(xiàn)OXP1 表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示AML 病人外周血CCL22高表達(dá)組和低表達(dá)組病人3年生存率分別為47.06%（16/34），70.59%（24/34），CCL22 高表達(dá)組OS 短于低表達(dá)組（χ2=4.39，P＜0.05）；FOXP1高表達(dá)組和低表達(dá)組病人3 年生存率分別為44.12%（15/34），73.53%（25/34），F(xiàn)OXP1 高表達(dá)組OS短于低表達(dá)組（χ2=6.50，P＜0.05）。

2.5 AML 病人預(yù)后的影響因素分析以AML 病人預(yù)后情況為因變量（賦值1=死亡，0=存活），以病人外周血CCL22，F(xiàn)OXP1 水平為自變量進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，顯示外周血CCL22，F(xiàn)OXP1 是影響AML病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表3。

表3 Cox回歸分析急性髓系白血病預(yù)后的影響因素

3 討論

AML 是一種髓系造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，以骨髓和外周血中的原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞異常增生為主要特征［9］。AML的臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，大部分表現(xiàn)為貧血、出血、發(fā)熱、畏冷、各臟器的浸潤(rùn)及全身器官代謝異常等等。盡管現(xiàn)在醫(yī)療技術(shù)已不斷完善，AML 病人可以通過(guò)治療減輕痛苦，但是該疾病易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并且治療效果存在明顯的個(gè)體差異，導(dǎo)致病人的5 年生存率較低［10-11］。因此，尋找AML 有效的臨床診斷指標(biāo)，對(duì)提高病人生存狀況有積極意義。趨化因子CCL20，轉(zhuǎn)錄因子FOXP1 是學(xué)者們研究的新熱點(diǎn)基因，但是兩者在AML 病人中的作用鮮有報(bào)道。本研究主要探討AML 病人外周血CCL22，F(xiàn)OXP1 的表達(dá)水平及預(yù)后價(jià)值，以期為改善AML病人預(yù)后提供新的方向。

CCL22 基因定位于人染色體16q21，屬于趨化因子家族，對(duì)單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和活化的T 淋巴細(xì)胞具有明顯趨化作用，并且趨化因子CCL22 在器官發(fā)育和白細(xì)胞遷移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。研究報(bào)道，CCL2 作為CC 趨化因子家族的一員，與AML 進(jìn)程密切相關(guān)［12］。靶向趨化因子可能影響AML 對(duì)化療的敏感性，并有助于開發(fā)治療AML 的新型方法。張彬彬等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中CCL22 高表達(dá)，并且CCL22 高表達(dá)者3 年總體生存率明顯低于CCL22 低表達(dá)者，這提示CCL22高表達(dá)與宮頸癌病人預(yù)后不良有關(guān)。在低氧條件下巨噬細(xì)胞分泌CCL22 可促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移［14］。目前，CCL22 在AML 中的研究較少，CCL22基因在AML 中發(fā)揮何種功能呢？本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者（對(duì)照組）相比，AML 病人初診時(shí)外周血中CCL22 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；CCL22 表達(dá)水平與病人年齡、性別、染色體預(yù)后、HGB、PLT、FLT3-ITD、NPM1 突變無(wú)關(guān)（P＞0.05），與脾腫大、WBC 有關(guān)（P＜0.05）。這提示，CCL22 的表達(dá)在AML中被增強(qiáng)，其在AML 的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定的促進(jìn)作用。王曉龍等［15］研究發(fā)現(xiàn)，CCL22 在胃癌病人外周血中表達(dá)增高，CCL22 對(duì)胃癌細(xì)胞具有趨化作用，CCL22 可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。并且有研究報(bào)道，CCL22 是一種重要的新型適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)因子，靶向CCL22 與其受體的相互作用可能代表一種有效且潛在危害較小的免疫治療策略，該策略對(duì)惡性腫瘤和炎癥具有重要的影響［16］。由此可見，CCL22在癌癥和炎癥中的作用并不單一，值得進(jìn)一步地探討。

FOXP1 定位于染色體3p14.1，是叉頭框（Forkhead box，F(xiàn)OX）轉(zhuǎn)錄家族的成員，在早期發(fā)育到成年的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。FOXP1 在人體組織中廣泛表達(dá)，參與調(diào)節(jié)大腦、心臟、肺、免疫系統(tǒng)和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育。李永良［17］研究報(bào)道，與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織中FOXP1 基因表達(dá)水平上調(diào)，F(xiàn)OXP1 陽(yáng)性表達(dá)病人存活率顯著低于陰性表達(dá)病人。白娟等［18］研究報(bào)道，上皮性卵巢癌病人癌組織FOXP1 呈異常高表達(dá)，且與分化程度、臨床分期、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。也有研究報(bào)道，F(xiàn)OXP1高表達(dá)與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的病理進(jìn)展及預(yù)后惡化有關(guān)［19］。在復(fù)發(fā)難治型急性淋巴細(xì)胞白血病病人中Foxp3+Tregs水平明顯升高［20］，這提示該疾病可能與FOX 家族的調(diào)控作用有關(guān)。目前，F(xiàn)OXP1 在AML 中的研究報(bào)道較少，其在AML 中扮演何種角色還未可知。本研究結(jié)果顯示，與健康體檢者相比，AML病人初診時(shí)外周血中FOXP1表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OX 家族與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［21］。FOXP1 在糖尿病視網(wǎng)膜病變病人玻璃體中普遍高表達(dá)，沉默F(xiàn)OXP1 可抑制高糖刺激下的VEGF/PEDF信號(hào)通路，也降低了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管能力［22］。這進(jìn)一步證明FOXP1 作為癌基因在癌癥和炎癥中發(fā)揮作用。并且本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP1 表達(dá)水平與病人年齡、性別、染色體預(yù)后、HGB、PLT、FLT3-ITD、NPM1突變無(wú)關(guān)（P＞0.05），與脾腫大、WBC 有關(guān)（P＜0.05）。這提示，F(xiàn)OXP1 可能參與AML 的病理進(jìn)展，外周血FOXP1 水平或許能成為評(píng)價(jià)AML 惡化程度的檢測(cè)指標(biāo)。

趙敏伊等［23］研究發(fā)現(xiàn)，CCL22 和FOXP3 在宮頸組織中過(guò)表達(dá)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，可引起腫瘤微環(huán)境的免疫失衡。研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞與CCL22 均呈高表達(dá)，并且CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分別與FOXP3、CCL22 呈正相關(guān)［24］，這提示CCL22 和FOXP3 共同作用時(shí)可增強(qiáng)免疫抑制作用，加劇局部免疫失衡。那么，AML 病人外周血中CCL22 與FOXP1 的表達(dá)是否存在相關(guān)性？又是否影響AML 病人預(yù)后呢？本研究通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AML病人外周血中CCL22與FOXP1表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。對(duì)病人進(jìn)行了3 年隨訪結(jié)果顯示，AML 病人外周血CCL22 高表達(dá)組病人3 年生存率為47.06%，低于低表達(dá)組70.59%（P＜0.05）；FOXP1 高表達(dá)組病人3 年生存率為44.12%，低于低表達(dá)組病人73.53%（P＜0.05），提示檢測(cè)CCL22 及FOXP1 水平有助于指導(dǎo)AML 病人的預(yù)后情況。分析其影響預(yù)后原因，可能與CCL22、FOXP1 高表達(dá)組病人脾腫大、WBC 數(shù)量多有關(guān)。logistic 分析結(jié)果顯示，CCL22，F(xiàn)OXP1 是影響AML 病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果表明CCL22，F(xiàn)OXP1 在AML 的發(fā)生發(fā)展中作為致癌基因發(fā)揮作用，且CCL22 與FOXP1高表達(dá)與AML 不良預(yù)后存在密切聯(lián)系，CCL22，F(xiàn)OXP1 可能是影響AML 病人預(yù)后的分子生物標(biāo)志物，或許為AML新藥開發(fā)提供新的研究方向。

綜上所述，AML 病人外周血中CCL22，F(xiàn)OXP1均呈高表達(dá)，CCL22，F(xiàn)OXP1 高表達(dá)與AML 病人預(yù)后不良有關(guān)，是影響病人預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，二者有望成為預(yù)測(cè)AML 病人預(yù)后的生物標(biāo)志物，同時(shí)也為AML的靶向治療提供了新思路。