不同配伍比例大黃-丹參有效成分溶出率及抗模型大鼠腎纖維化作用比較*

孟 穎，徐子寒，高儷原，韓 怡

（江蘇省張家港市中醫醫院，江蘇張家港 215600）

慢性腎臟?。–KD）是全球性公共衛生問題［1］，目前全球有6.98 億病例，中國患者達1.323 億［2］。腎纖維化是CKD 的標志，也是腎功能進行性改變和不可逆轉的重要原因［3］。相較于西藥，傳統中醫藥對CKD 具有獨特的治療優勢。大黃為瀉下良藥，具有逐瘀破結功效；丹參為活血化瘀良藥；兩藥配伍，為中醫臨床治療CKD 的高頻使用藥對［4-5］。近年來，含大黃-丹參藥對的中成藥如腎康注射液（大黃- 丹參，1∶1）［6］和腎衰寧膠囊（大黃-丹參，1∶1.75）［7］，臨床經驗方如抗纖靈沖劑（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，大黃-丹參，1∶1.25）［8］，固本泄濁飲（張家港市中醫醫院，大黃- 丹參，1∶2）［9］等廣泛用于臨床，療效均較好。已有研究多集中于大黃、丹參單味藥材或其單體成分治療CKD 腎纖維化［10-12］，藥對也僅限于1∶1 配伍［13-14］，兩藥不同配伍比例下的有效成分及療效未見研究。為此，本研究中探討了不同配伍比例大黃-丹參對有效成分溶出率及抗模型大鼠腎纖維化的作用?，F報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀，包括PDA2998 型檢測器（美國Waters 公司）；MS105 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司），7170A 型全自動生化分析儀（日本Hitachi公司），精度均為0.01 mg；SCQ - 250 型超聲波清洗器（上海聲彥超聲波儀器有限公司）；ST16R型低溫離心機（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥

蘆薈大黃素對照品（批號為PRF9022841，含量97.72%），大黃酸對照品（批號為PRF9083142，含量98.36%），大黃素對照品（批號為PRF8070501，含量99.44%），大黃酚對照品（批號為PRF8022726，含量99.67%），大黃素甲醚對照品（批號為PRF9031428，含量97.24%），均購于成都普瑞法科技開發有限公司；丹參酮ⅡA對照品（批號為MUST - 20121710，含量99.56%），丹酚酸B 對照品（批號為MUST - 21030110，含量98.60%），均購于成都曼斯特生物科技有限公司；磷酸、甲醇均為分析純，水為娃哈哈純凈水。大黃飲片（批號為210527010），丹參飲片（批號為210710010），均購于蘇州天靈中藥飲片有限公司，經張家港市中醫醫院余輝主任中藥師鑒定為正品。

1.3 動物

SPF級SD大鼠35只，雄性，7周齡，體質量（180±10）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證號SYXK（京）2022-0025。飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，室溫（23±2）℃，相對濕度（60±5）%，12 h 明暗交替，實驗期間大鼠自由進食飲水。本實驗經我院實驗動物倫理委員會批準（批件號：2020 倫申第1040號）。

2 方法與結果

2.1 有效成分溶出率研究

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ThermoHypersilBDSC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min時5%A，5～15 min時5%A →30%A，15～25 min時60%A，25～35 min 時60%A →75%A，35～45 min 時75%A，45～65 min時75%A →5%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

大黃混合對照品溶液：稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品各適量，精密稱定，分別置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成單一對照品溶液①- ⑤（質量濃度分別為0.996 7，0.946 2，0.938 7，1.521 0，0.958 8 mg / mL）。分別精密吸取740，740，660，1 400，660μL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，制成混合對照品溶液Ⅰ（質量濃度分別為73.756，70.019，61.954，212.940，63.281μg/mL）。

丹參混合對照品溶液：稱取丹酚酸B、丹參酮ⅡA對照品各適量，精密稱定，分別置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成單一對照品溶液⑥和⑦（質量濃度分別為1.312 2 mg/ mL 和1.366 6 mg/ mL）。分別精密吸取1 800μL 和940μL，置同一10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，制成混合對照品溶液Ⅱ（質量濃度分別為236.196μg/mL和128.460μg/mL）。

大黃、丹參單提液：分別取大黃飲片、丹參飲片樣品各適量，置陶瓷煲中，加水300 mL，武火煮沸后轉文火繼續煎煮30 min，濾過，除去藥渣，藥液濃縮并定容至100 mL，精密吸取藥液25 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，30 ℃下超聲（功率200 W，頻率45 kHz）提取10 min，冷卻至室溫，取上清液，經0.45μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

不同配伍比例大黃- 丹參混提液（供試品溶液）：按大黃-丹參配伍比例1∶1、1∶1.25、1∶1.75、1∶2、1∶3、1∶4 分別稱取大黃飲片樣品粉末3.0 g（6 份）及丹參飲片樣品粉末3.0，3.75，5.25，6.0，9.0，12.0 g，精密稱定，分別提取并配伍制備，得供試品溶液①-⑥；按相同配伍比例分別稱取丹參飲片樣品粉末15.0 g（6份）及大黃飲片樣品粉末15.0，12.0，8.57，7.5，5.0，3.75 g，精密稱定，分別提取并配伍制備，即得供試品溶液⑦-○12。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：取上述對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，理論板數按丹酚酸B 峰計應不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Salvianolic acid B 2.Aloe - emodin 3.Rhein 4.Emodin 5.Tanshinone ⅡA 6.Chrysophanol 7.PhyscionA.Mixed reference solution Ⅰ B.Mixed reference solution Ⅱ C.Test solution ⑥ D.Extract of Rhei Radix et Rhizoma E.Extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et RhizomaFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.1.2項下單一對照品溶液①-⑦0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成系列單一對照品溶液。精密量取10μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果見表1。

表1 線性關系考察結果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度試驗：取2.1.2項下混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ，按2.1.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.61%，0.58%，0.46%，0.42%，0.79%，0.52%，0.44%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液⑥適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，16，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為1.01%，1.23%，0.99%，1.16%，0.92%，1.01%，1.23%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：稱取飲片樣品適量，精密稱定，各6 份，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.41%，0.39%，0.43%，0.35%，0.58%，0.38%，0.51%（n= 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的飲片樣品適量，共6 份，分別加入一定質量濃度的混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.1.4 樣品含量測定

取飲片樣品各適量，分別按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，計算樣品含量及溶出率。結果見表3、圖2。

表3 不同配伍比例大黃-丹參藥對中7個有效成分含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of seven active ingredients in Rhei Radix et Rhizoma - Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma drug pair with different compatibility proportions（mg/g，n=3）

圖2 不同配伍比例大黃-丹參藥對中7種有效成分溶出率折線圖Fig.2 Line graphs of dissolution rates of seven active ingredients in Rhei Radix et Rhizoma - Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma drug pair with different compatibility proportions

2.2 抗單側輸尿管梗阻（UUO）模型大鼠腎纖維化研究

建模、分組及給藥：將35只大鼠隨機分為假手術組（純凈水）、模型組（純凈水）、大黃組（大黃單提液）、丹參組（丹參單提液）、大黃-丹參（1∶1.25）組（1∶1.25 組）、大黃-丹參（1∶1.75）組（1∶1.75組）、大黃-丹參（1∶2）組（1∶2組）。大鼠禁食不禁飲12 h后，腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，左側腹切口，暴露并分離左側輸尿管，在腎盂開口處和輸尿管上1/3 處結扎，從2 個結扎點中間剪斷左側輸尿管，逐層縫合，并注射青霉素，以復制UUO 大鼠模型。各組灌胃純凈水或相應劑量煎液，按普通成人（體質量以60 kg 計）10 g/d 的中藥量計，大鼠劑量為1.042 g/ kg，每天1 次，持續2 周。假手術組大鼠僅腹腔游離左側輸尿管后縫合腹腔。

腎臟病理形態：取大鼠左側腎組織，將制得標本置4%多聚甲醛固定液中，脫水、包埋、切片，Masson 染色，觀察病理改變。結果表明，與假手術組比較，模型組腎間質藍色區域顯著增多，大量膠原纖維沉積，腎纖維化明顯；與模型組比較，各給藥組中膠原纖維沉積減少，腎臟纖維化程度降低，其中大黃組腎損傷改善作用更優。詳見圖3。

圖3 大鼠腎臟病理形態（Masson，×400）Fig.3 Pathological morphology of kidney in rats（Masson，× 400）

腎臟生化指標：用全自動生化分析儀檢測大鼠血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、24 h 尿蛋白（24 h -UTP）水平。與假手術組比較，模型組大鼠BUN 和SCr水平顯著升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠BUN，SCr，24 h-UTP 水平均顯著下降（P＜0.05）。但各給藥組組間無顯著差異（P>0.05），大黃組SCr 顯著優于丹參組。詳見表4。

表4 各組大鼠腎功能指標比較（±s，n=5）Tab.4 Comparison of renal function indexes in each group（±s，n=5）

表4 各組大鼠腎功能指標比較（±s，n=5）Tab.4 Comparison of renal function indexes in each group（±s，n=5）

注：與假手術組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05；與大黃組比較，△P ＜ 0.05。Note：Compared with those in the sham surgery group，*P ＜ 0.05.Compared with those in the model group，#P ＜ 0.05. Compared with those in the Rhei Radix et Rhizoma group，ΔP ＜ 0.05.

24 h-UTP（mg）5.26±1.10 14.90±2.29*8.13±0.70#9.07±1.29#8.59±0.85#8.51±1.41#8.94±0.70#組別假手術組模型組大黃組丹參組1∶1.25組1∶1.75組1∶2組BUN（mmol/L）5.98±0.69 16.01±1.29*9.65±1.27#11.72±0.74#10.71±1.58#10.58±1.16#11.57±1.02#SCr（μmol/L）22.99±3.29 56.03±6.60*36.41±4.91#46.50±3.52#△42.50±4.59#43.44±4.82#44.41±4.65#

3 討論

3.1 大黃-丹參藥對現代藥理學

大黃通腑泄濁，具有推陳致新、清泄濁毒之功效?，F代藥理學研究發現，大黃具有抗炎、抗菌、通便、抗癌等藥理作用，大黃提取物具有改善腎損傷、抑制腎組織細胞凋亡和炎性因子釋放等功效［15］。丹參活血化瘀，具有祛瘀生新、通行血脈之效?，F代藥理學研究發現，丹參提取物具有減輕腎臟炎性反應，修復腎損傷，改善腎功能等功效［16-17］。王宏等［14］發現，大黃- 丹參藥對可減輕慢性腎衰竭模型大鼠腎間質炎性細胞浸潤、纖維化程度和結腸上皮屏障結構損傷程度，從而有效保護模型大鼠腎功能。大黃- 丹參藥對也可顯著抑制UUO模型大鼠腎組織中miR - 21/PTEN/Akt 信號通路，從而發揮對腎纖維化的改善作用［13］。

3.2 大黃-丹參藥對配伍比例選擇

2020年版《中國藥典（一部）》規定大黃的用量為3～15 g，丹參的用量為10～15 g；臨床以大黃治療腎病的常用劑量為6～30 g［18］，丹參為10～37.3 g［19］。結合大黃丹參湯、抗纖靈沖劑、固本泄濁飲等含大黃-丹參藥對的中藥復方對腎臟疾病的臨方遣藥經驗［20-22］，本研究中選擇了大黃-丹參藥對臨床使用較多的6 種配伍比例，研究大黃-丹參混提液中7個有效成分溶出率的變化規律。

3.3 不同配伍比例對大黃- 丹參藥對中7 個主要有效成分溶出率的影響

從溶出率測定結果可知，大黃-丹參混提液中7個有效成分含量均低于大黃、丹參單提液；大黃中5 個游離蒽醌的溶出率隨著與丹參配伍比例改變的變化規律不一致，當大黃-丹參配伍比例為1∶2時，5個游離蒽醌的總溶出率最高（72.22%）；丹參中2 個有效成分總量隨著丹參配伍比例的增大總體呈上升趨勢，當大黃-丹參配伍比例為1∶2 時，丹酚酸B 和丹參酮ⅡA的總溶出率最高為91.35%；從7個有效成分總量來看，在大黃-丹參配伍比例為1∶2 時的溶出率最高（79.61%）。綜合考慮，選取溶出率相對較高的大黃-丹參3種不同配伍比例（1∶1.25、1∶1.75、1∶2）及大黃、丹參單提液共5 組進行藥效學最佳配伍比例研究。

3.4 不同配伍比例對UUO 模型大鼠腎纖維化的影響

由藥效學實驗結果可見，給藥后大黃、丹參及其配伍均能顯著提升模型大鼠的BUN，SCr，24 h - UTP 水平，大黃- 丹參配伍后在抗腎纖維化作用方面未產生協同作用，其中大黃單提液藥效表現最佳，其余配伍比例無顯著差異。病理學檢測結果與藥效一致，各給藥組大鼠腎臟纖維化程度均明顯降低，其中大黃單提液改善腎纖維化作用更優。

3.5 方法評價

所建立的含量測定方法可用于大黃-丹參藥對中7 個主要有效成分的含量測定；大黃-丹參不同比例配伍后有效成分溶出率均小于單提液；大黃-丹參配伍后在抗腎纖維化作用方面未產生協同作用，大黃單提液抗腎纖維化作用最佳。