皮膚外用桑白皮水提物安全性研究*

錢明明，楊 穎，王婷婷，王璽寧

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇連云港 222000）

桑白皮，系桑科桑屬植物桑Morus albaL. 除去栓皮的干燥根皮，始載于《神農本草經》，具有清肺平喘、利水消腫之功效［1］。近年來，有研究發現其提取物具有美白活性，在外用美白護膚品方面具備一定開發價值［2-3］，但目前尚未見皮膚外用相關提取物的毒理學安全性研究。對于桑白皮有效美白成分的提取，可通過甲醇、乙醇和水進行萃取［4-5］，但甲醇屬《化妝品安全技術規范（2015年版）》中的禁用物質，乙醇會溶解皮脂膜從而破壞皮膚的屏障功能。故本研究中選取去離子水作為提取溶劑，參照國家藥品監督管理局《中藥、天然藥物局部刺激性和溶血性研究的技術指導原則》，通過皮膚急性毒性試驗、皮膚致敏試驗、皮膚刺激性試驗系統評價桑白皮水提物的安全性，以期為其進一步應用提供依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：BS-600L型電子天平（上海友聲衡器有限公司，精度為0.1 g）；AWH-30-SA 型電子天平（上海英展機電企業有限公司，精度為0.1 g）。

試藥：薇婷脫毛膏（利潔時家化有限公司，批號為C160322003）；2，4-二硝基氯苯（山東西亞化學有限公司，批號為20220705）；水為去離子水。桑白皮藥材飲片（購于江蘇仟草堂藥業有限公司，產地安徽），由連云港市食品藥品檢驗檢測中心馬冬云主任中藥師鑒定為正品。

動物：健康豚鼠（體質量為250～300 g）、健康新西蘭兔（體質量約1.7 kg），雌雄各半，均購自邳州市東方養殖有限公司［實驗動物生產許可證號分別為SCXK（蘇）2022-0004、SCXK（蘇）2022-0005］。實驗動物雌雄分籠飼養于我中心動物房［實驗動物使用許可證號為SYXK（蘇）2020 - 0020］，溫度20～22 ℃，相對濕度50%～60%，自由進食（飼料購自邳州市小河科技發展有限公司）、飲水。

1.2 桑白皮水提物制備

稱取藥材飲片樣品2.4 g，置250 mL 圓底燒瓶中，加入去離子水50 mL，回流提取2 h 后，濾過，濾渣繼續提取2 h，合并濾液，濃縮至20 mL，稀釋制得質量濃度分別為6.0，12.0，24.0 mg/mL的水提液。

1.3 皮膚急性毒性試驗

完整皮膚：取健康豚鼠40 只，雌雄各半，隨機分為空白組（等體積水）及桑白皮水提物低、中、高劑量組（簡稱低、中、高劑量組，6.0，12.0，24.0 mg/mL 桑白皮水提物），各10只。試驗前24 h剪去動物背部兩側長毛，再用脫毛膏脫毛（面積約20 cm2）。各組脫毛區分別均勻涂抹相應水提物或水2 mL，用無菌紗布覆蓋，以無刺激性橡皮膠固定，24 h 后用溫水洗凈藥物。每日觀察豚鼠脫毛區皮膚局部變化及全身毒性反應，包括皮膚、毛發、眼睛、黏膜、飲食、排泄、四肢活動、呼吸、中樞神經系統等的變化，連續觀察14 d；記錄用藥前及用藥后7，14 d 豚鼠的體質量。若試驗過程中動物死亡，應立即進行解剖學檢查，必要時進行組織病理學檢查。

破損皮膚：取健康豚鼠40只，雌雄各半，動物分組、脫毛方法和脫毛面積同上，脫毛區皮膚用薄刀片作“#”形劃破，破口以滲血不傷及真皮為度，其余操作步驟同“完整皮膚”。

1.4 皮膚致敏試驗

致敏接觸：取健康豚鼠30 只，雌雄各半，隨機分為空白組（等體積水）、桑白皮水提物組（簡稱桑白皮組，6.0 mg/mL 桑白皮水提物）和陽性對照組（1%2，4-二硝基氯苯溶液激發給藥6 h），各10 只。試驗前24 h 剪去其背部兩側對稱位置長毛，再用脫毛膏脫毛，兩側脫毛（約3 cm × 3 cm）。各組豚鼠左側脫毛區分別涂相應藥物0.2 mL，覆蓋無菌紗布，用無刺激性橡皮膠固定，分籠飼養，6 h后用溫水洗凈藥物，并于首次給藥后7，14 d采用相同方法重復致敏。

激發接觸：末次接觸致敏14 d 后于右側脫毛區，采用與“致敏接觸”相同的方法給藥，激發6 h 后洗凈藥物，然后分別于0，24，48，72 h 時觀察并記錄豚鼠皮膚紅斑、水腫，以及站立不穩、呼吸困難和過敏性休克等全身性癥狀發生情況。

致敏反應評價［6］：無紅斑、輕度紅斑、中度紅斑、重度紅斑、水腫性紅斑分別計0分、1分、2分、3分、4分；無水腫、輕度水腫、中度水腫、重度水腫分別計0分、1分、2分、3 分。致敏反應平均分=（紅斑形成總分+水腫形成總分）/動物總數。致敏率（%）=發生致敏反應動物數/受試動物總數×100%。皮膚致敏性評價中，致敏率為0～10%、11%～30%、31%～60%、61%～80%、81%～100%分別評定為無致敏性、輕度致敏性、中度致敏性、高度致敏性、極度致敏性。

1.5 皮膚刺激性試驗

單次給藥：采用自身對比法。取健康新西蘭兔8只，雌雄各半，隨機分為完整皮膚組和破損皮膚組。試驗前24 h 剪去兔背部兩側對稱位置長毛，再用脫毛膏脫毛（約3 cm×4 cm）。完整皮膚組脫毛區皮膚無損傷；破損皮膚組脫毛區皮膚用薄刀片作“#”形劃破，破口以滲血不傷及真皮為度。自身對照側皮膚均涂抹水0.5 mL（作為完整皮膚空白組和破損皮膚空白組），另一側均涂抹6.0 mg/mL 桑白皮水提物0.5 mL（作為完整皮膚桑白皮組和破壞皮膚桑白皮組），用單層無菌紗布和單層蠟紙覆蓋，再用無刺激性橡皮膠固定，4 h 后用溫水洗凈，并于洗凈后1，24，48，72 h 觀察涂抹部位皮膚刺激反應并記錄相應評分。

多次給藥：取健康新西蘭兔8只，雌雄各半，動物分組、脫毛面積和皮膚處理及給藥步驟與單次給藥時試驗相同，連續用藥7 d，清除藥物后1，24，48，72 h觀察涂抹部位皮膚刺激反應并記錄相應評分。

皮膚刺激性反應評價［7］：紅斑，無紅斑、輕微紅斑（勉強可見）、明顯紅斑、中重度紅斑、嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成分別計0分、1分、2分、3分、4分；水腫，無水腫、輕微水腫（勉強可見）、輕度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）、中度水腫（皮膚隆起約1 mm）、重度水腫（皮膚隆起超過1 mm）分別計0分、1分、2分、3分、4分。每天每只動物皮膚刺激性反應平均分= 紅斑和水腫總分/（受試動物數×刺激天數）。皮膚刺激強度評價中，平均分為0～0.49 分、0.50～1.99 分、2.00～5.99 分、6.00～8.00 分分別評定為無刺激性、輕刺激性、中刺激性、強刺激性。

1.6 統計學處理

采用SPSS 20.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 皮膚急性毒性試驗

試驗期間，各組豚鼠均正常生長，口、耳、鼻及眼未見異常分泌物，皮膚、毛發、呼吸、飲水、飲食及大小便均無異常，未出現驚厥、痙攣、運動失調等神經系統反應，破損皮膚處結痂正常，且未見死亡。各組豚鼠用藥前及用藥后7，14 d的體質量均無顯著差異（P>0.05），結果見表1。

表1 皮膚急性毒性試驗中各組豚鼠體質量比較（±s，g，n=10）Tab.1 Comparison of body mass of guinea pigs in each group after acute skin toxicity test（±s，g，n=10）

表1 皮膚急性毒性試驗中各組豚鼠體質量比較（±s，g，n=10）Tab.1 Comparison of body mass of guinea pigs in each group after acute skin toxicity test（±s，g，n=10）

類別完整皮膚組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組空白組低劑量組中劑量組高劑量組給藥前263.9±6.3 268.3±6.8 264.0±7.1 262.7±5.8 267.1±5.8 269.7±7.0 264.5±6.1 263.4±6.0給藥后7 d 292.9±6.7 296.8±6.7 292.4±7.5 291.4±5.5 295.6±6.1 298.2±6.8 293.6±7.0 292.1±5.8給藥后14 d 320.0±6.4 324.9±6.9 320.7±7.2 319.5±5.7 323.5±6.2 326.3±7.3 321.3±6.2 321.2±5.4破損皮膚

2.2 皮膚致敏試驗

致敏后72 h，桑白皮組豚鼠未出現局部皮膚紅斑、水腫或站立不穩、呼吸困難和過敏性休克等全身性癥狀，其致敏反應各項評分均為0分（致敏率為0）；陽性對照組致敏后0，24，48，72 h 時的平均分分別為1.8 分、2.0 分、1.2 分、1.0 分，致敏率為100%，結果見表2和圖1。

圖1 豚鼠皮膚致敏試驗72 h觀察結果A.Blank group B.Positive control group C.Mori Cortex groupFig.1 Results of guinea pigs′ skin sensitization test for 72 h

表2 各組豚鼠皮膚致敏試驗結果比較Tab.2 Results of skin sensitization test of guinea pigs in each group

2.3 皮膚刺激性試驗

單次給藥4 h 后，完整皮膚桑白皮組和破壞皮膚桑白皮組試驗兔1，24，48，72 h 內均未出現紅斑、焦痂或水腫，皮膚形態與相應空白組相同（見圖2），單次與多次皮膚刺激性試驗中，兩組皮膚過敏反應評分均為0，表明其皮膚刺激強度均為無刺激性。詳見圖3。

圖2 試驗兔單次給藥皮膚刺激性試驗72 h觀察結果A.Intact skin - blank group B.Intact skin - Mori Cortex group C.Damaged skin - blank group D.Damaged skin - Mori Cortex groupFig.2 Results of single - dose skin stimulation test for 72 h in test rabbits

圖3 試驗兔多次給藥皮膚刺激性試驗72 h觀察結果A.Intact skin - blank group B.Intact skin - Mori Cortex group C.Damaged skin - blank group D.Damaged skin - Mori Cortex groupFig.3 Results of multiple - dose skin stimulation test for 72 h in test rabbits

3 討論

酪氨酸酶為含銅多酚氧化酶，廣泛存在于動植物、微生物及人體中，是合成黑色素的關鍵代謝酶。桑白皮水提物含有黃酮類、苷類及其他化合物［8-9］，具有良好的清除超氧陰離子自由基及抑制酪氨酸酶作用［10］。本課題組前期研究發現，當桑白皮水提物質量濃度增至6.0 mg / mL 時，其抑制能力趨于平穩，故本研究中以6.0 mg/ mL 作為臨床最低質量濃度，外用于試驗動物局部皮膚進行系統安全評估。

皮膚急性毒性實驗中發現，對完整、破損皮膚的豚鼠涂抹各劑量桑白皮水提物，未產生急性毒性反應，與空白組比較，各劑量組豚鼠體質量無顯著差異，脫毛區皮膚形態基本一致，均未出現全身毒性反應和死亡的情況。皮膚致敏試驗中發現，陽性對照組豚鼠皮膚均出現不同程度的紅斑或水腫（均致敏），而其余組豚鼠局部皮膚均無致敏表現，表明桑白皮水提物作用下皮膚無過敏反應。單次、多次皮膚刺激性試驗中發現，完整及破損皮膚桑白皮組試驗兔均未出現紅斑、焦痂或水腫，皮膚形態與相應空白組基本相同，平均反應分均為0分，顯示無皮膚刺激性。

綜上所述，皮膚局部外用質量濃度不超過24 mg/mL桑白皮水提物的試驗動物未出現相應皮膚急性毒性、致敏性及刺激性反應，表明其安全性良好。