高效液相色譜-電霧式檢測器法測定托吡酯片中主要成分及雜質含量

黃小琴，季大偉，仇雅靜，孫楓濤

（1. 江蘇省泰州市藥品檢驗院，江蘇泰州 225300； 2. 江蘇省泰州市中醫院，江蘇泰州 225300）

托吡酯為抗癲癇藥，屬γ- 氨基丁酸再攝取抑制劑［1］。臨床常用于治療單純部分性、復雜部分性發作和全身強直- 陣攣性發作及嬰兒痙攣癥，也可用于預防偏頭痛［2-5］。目前，多采用高效液相色譜-示差檢測器（HPLC - RID）法測定托吡酯片中主要成分的含量，但該方法存在靈敏度低，儀器平衡時間長，進樣量大等缺點［6-9］。電霧式檢測器（CAD）響應值取決于進樣時被檢測物的絕對質量，靈敏度較好，廣泛用于皂苷類、生物堿類、糖類、脂類化合物等無（或弱）紫外吸收組分的測定［10-16］。基于此，本研究中建立了測定托吡酯片中主要成分及雜質含量的HPLC-CAD 法，并與現行標準方法測定結果比較，為托吡酯片的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀、Corona Veo RS型電噴霧檢測器（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；KH - 400KDE 型高功率數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；XSE205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

托吡酯片（西安楊森制藥有限公司，批號分別為20200826，20200927，20210612）；托吡酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為101061 - 201902，含量99.9%）；乙腈為色譜純，鹽酸（HCl）、甲酸、氫氧化鈉（NaOH）、30%過氧化氫（H2O2）溶液均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFire C18柱（150 mm × 4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.2%甲酸水溶液（35∶65，V/V）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：35 ℃；霧化溫度：35 ℃；過濾常數：3.6 s；冪率：1.0；采樣頻率：10 Hz；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取托吡酯對照品約10 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加流動相適量，超聲（功率400 W、頻率40 kHz，下同）使溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液。取樣品20片，精密稱定，研細，稱取細粉適量（約相當于托吡酯25 mg），精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，定容，搖勻，即得供試品溶液。稱取上述樣品細粉適量（約相當于托吡酯250 mg），精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加流動相，超聲使溶解，定容，搖勻，作為雜質供試品溶液；精密量取1 mL，置500 mL 容量瓶中，用流動相稀釋，定容，搖勻，作為雜質自身對照溶液。以流動相作為空白對照溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性及專屬性試驗：精密量取2.2項下溶液各10μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰，雜質自身對照溶液相應吸收峰可較好反映有關物質供試品溶液中的檢測成分。理論板數以托吡酯峰計大于3 500，分離度均大于1.5，拖尾因子小于1.2，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.TopiramateA.Reference solution B.Test solution C.Blank reference solution D.Test solution of impurities E.Self - reference solution of impuritiesFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：稱取托吡酯對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并制成含托吡酯1 mg/mL 的溶液。精密量取適量，分別用流動相稀釋成約含托吡酯1.0，0.5，0.2，0.1，0.05 mg/mL 的系列對照品溶液。精密量取適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 1 247.514 4X+114.499 8（r=0.995 6，n=5）。結果表明，托吡酯質量濃度在0.05～1.0 mg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限考察：取質量濃度為0.05 mg/mL的對照品溶液適量，倍比稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以信噪比（S/N）約為10 和3 時的待測成分質量濃度為定量限和檢測限，結果分別為3μg/mL和1μg/mL。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果的RSD為0.51%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.01%（n= 4），表明供試品溶液室溫放置12 h內基本穩定。

破壞性試驗：取托吡酯對照品約10 mg，精密稱定，共5 份，分別置20 mL 容量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，分別進行以下操作。1）堿破壞，加入0.1 mol/mL NaOH 1 mL，室溫放置4 h，用0.1 mol/mL HCl 1 mL中和，用流動相稀釋，定容，搖勻。2）酸破壞，加入0.1 mol/mL HCl 1 mL，室溫放置4 h，用0.1 mol/ mL NaOH 1 mL 中和，用流動相稀釋，定容，搖勻。3）氧化破壞，加入30%H2O2溶液1 mL，室溫放置4 h，用流動相定容，搖勻。4）光照破壞，4 500 lx照度下光照4 h，用流動相定容，搖勻。5）高溫破壞，取托吡酯對照品置烘箱中105 ℃加熱4 h 后，加流動相適量使溶解，定容，搖勻。精密量取各破壞試驗溶液10μL，分別按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。各破壞試驗下產生的雜質峰均能與待測成分色譜峰達到有效分離，對測定無影響。詳見圖2。

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖1.TopiramateA.Oxidative damageB.High - temperature damage C.Acid damage D.Alkali damage E.Light damageFig.2 HPLC chromatograms of damage test

重復性試驗：取樣品（批號為20200826）細粉適量，共6 份，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果托吡酯的平均含量為98.42%，RSD為0.85%（n=6）。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20200826）細粉適量（約相當于托吡酯12.5 mg），共9 份，分別置50 mL 容量瓶中，再分別按比例精密加入相當于托吡酯含量80%，100%，120%的托吡酯對照品，再分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品及雜質含量測定

取3 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液和有關物質供試品溶液，各2 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，按外標法計算托吡酯含量，同時將測定結果與原國家食品藥品監督管理局國家藥品標準收載的HPLC-RID 法進行比較，結果見表2。按自身對照法計算雜質供試品溶液含量，結果見表3。

表2 樣品含量測定結果（%，n=2）Tab.2 Results of content determination of topiramate in samples（%，n=2）

表3 雜質含量測定結果（%，n=2）Tab.3 Results of content determination of impurities（%，n=2）

3 討論

3.1 流動相選擇

預試驗中考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈- 0.2%甲酸水溶液和乙腈- 0.1%三乙胺溶液4個流動相系統，發現托吡酯在酸性系統中響應值最大，在水中其次，在堿性系統中最小，故選擇乙腈- 甲酸溶液系統，根據響應值、基線等情況，最終選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動相。

3.2 CAD 參數的選擇

預試驗中分別考察了霧化溫度為55 ℃和35 ℃對檢測響應值的影響，結果表明，檢測靈敏度會隨著霧化溫度的提高而降低，故最終選擇35 ℃。冪率是CAD 所特有的線性校正參數，不同的化合物具有不同的最優冪率。分別考察了不同冪率（0.9，1.0，1.1）對線性的影響，結果發現，隨著冪率的增大，r也不斷增大，但響應值不斷降低，綜合考慮線性和響應值的影響，最終選擇冪率為1.0。

3.3 方法評價

本研究中建立的HPLC-CAD 法操作簡便，靈敏度高，結果準確可靠，適用性強，可用于托吡酯片的質量控制。