60Co-γ 射線輻照對利咽含漱液中木犀草苷含量的影響*

施崇精，李 萍，王 雋，蒲秋易，李 瑞，肖佳佳

（四川省成都市中西醫結合醫院，四川成都 610095）

利咽含漱液由錦燈籠、冰片、硼砂、赤石脂、兒茶、甘草組方，有清熱利咽、消腫止痛、涼血止血、收斂生肌功效，可用于治療口咽部腫痛、潰瘍、急慢性扁桃體炎等。輻照滅菌是利用γ射線，電子加速器產生的高能電子束，或者X 射線殺滅中藥中微生物的方式，可降低藥品生產過程中的微生物負載［1-4］。60Co-γ射線輻照是常用的藥品滅菌方法［5-6］，為此，本研究中建立了高效液相色譜（HPLC）法測定方中君藥錦燈籠藥效成分木犀草苷的含量［7-9］，并進一步考察了不同劑量60Co-γ射線輻照對含量測定結果的影響。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；BP -211D 型電子天平（賽多利斯科學儀器＜中國＞有限公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

木犀草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111720-201810，含量93.5%）；利咽含漱液（醫院制劑室提供，批號分別為210501，210701，210702，210703）；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/ V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：350 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇，制成質量濃度為47.385 μg / mL 的對照品溶液。精密量取樣品2 mL，置5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按利咽含漱液的處方及工藝制備缺錦燈籠的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性及專屬性試驗：取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰，理論板數按木犀草苷峰計大于5 000，分離度均大于1.5，基線分離良好，且陰性對照無干擾，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.LuteolosideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取對照品溶液（質量濃度為47.385 8 μg/ mL），加甲醇稀釋成質量濃度分別為1.895 4，4.738 6，18.954 3，28.431 5，47.385 8μg/mL的系列對照品溶液。精密量取10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=31.13X-15.793（r=0.999 7，n=5）。結果表明，木犀草苷質量濃度在1.895 4～47.385 8 μg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限考察：取2.2 項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為3∶1 和10∶1 時的進樣量作為檢測限及定量限。結果分別為0.2 ng和0.4 ng。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄木犀草苷峰面積。結果的RSD為0.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，2，3，6，9，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄木犀草苷峰面積。結果的RSD為1.26%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為210501）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果木犀草苷平均含量為19.857 0μg/mL，RSD為0.87%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的樣品（批號210501）1 mL，共9 份，分別置5 mL 容量瓶中，精密加入對照品溶液0.5，1，1.5 mL，各3 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定（輻照前后）

取3批樣品，采用60Co-γ射線分別以6 kGy和10 kGy的劑量輻照，平行2次，即得輻照后的利咽含漱液樣品。取輻照前（0 kGy）后樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算木犀草苷含量。結果見表2，可見，輻照后樣品中木犀草苷含量明顯減少，且減少程度與輻照劑量呈正相關。考慮批間差異、藥材差異等的影響，利咽含漱液中木犀草苷的含量限度暫定為20μg/mL。

表2 輻照前后樣品含量測定結果（μg/mL，n=2）Tab.2 Results of content determination of luteoloside in samples before and after irradiation（μg/mL，n=2）

3 討論

隨著藥品監管力度的加強，醫院制劑質量控制要求日益提升，逐步從定性分析提升到定量分析，在保證藥品質量方面起到了積極作用［10-12］。利咽含漱液組方中，錦燈籠清熱解毒、利咽，為君藥；冰片清熱止痛、消腫［13］，硼砂清熱解毒，共為臣藥；赤石脂收斂生肌［14］，兒茶收斂生肌、止血［15］，共為佐藥；甘草清熱解毒，緩急止痛，且能調和諸藥，為使藥。現代藥理學研究顯示，錦燈籠含生物堿、甾體類、黃酮及其苷類等多種成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等生物活性［16-17］。

木犀草苷為錦燈籠的藥效成分，多采用HPLC 法進行含量測定。臣藥冰片難溶于水，且受熱易揮發，本工藝將冰片兌入冷卻的水煎液后混懸使用，不涉及提取轉移率的質量控制，后期擬采用薄層色譜法進行鑒別。臣藥硼砂多采用滴定法測定含量，但制劑測定存在顏色干擾；佐藥赤石脂無明確指標成分；佐藥兒茶、使藥甘草用量占比較小，且有效成分在水提液中轉移率較低，在本色譜條件下難以有效測定，故均暫未納入指標成分測定。

預試驗中還分別對色譜柱、柱溫、流速、檢測波長、流動相進行了耐用性試驗考察。色譜柱考察了Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Agilent Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）；柱溫考察了28，30，32 ℃；流速考察了0.9，1.0，1.1 mL / min；檢測波長考察了345，350，355 nm；流動相比例考察了乙腈- 0.1%磷酸水溶液（19∶81、20∶80、21∶79，V/V）。結果木犀草苷含量的RSD均小于3%，表明該方法耐用性良好。

綜上所述，本研究中建立的HPLC 法精密度高、重復性好、專屬性強，適用于測定利咽含漱液中木犀草苷含量。但其含量經60Co -γ射線輻照后會大幅下降，對制劑的有效性影響較大，宜考慮其他滅菌方法。