香卿止痛噴霧劑質量標準提升研究

殷麗寧，李金慈，盛 華，高 茗，蘇 華，湯 淏

（中國人民解放軍東部戰區總醫院，江蘇南京 210002）

香卿止痛噴霧劑由紅茴香和徐長卿兩味中藥以75%乙醇經浸漬、滲漉、濃縮等工藝提取，并加入冰片、月桂氮酮等經皮促滲劑開發制得。該制劑具有活血化瘀、消腫止痛功效，臨床主要用于治療跌打損傷、瘀血腫痛、風濕痹痛等［1-2］。若參考2020年版《中國藥典（一部）》［3］及地方標準［4］中徐長卿和紅茴香藥材的鑒別方法，制劑中冰片的揮發油成分會對結果造成干擾。乙醇體積分數及用量會顯著影響制劑中主要活性物質丹皮酚和槲皮苷的含量［2］，乙醇在制備過程中可能導致甲醇殘留，該情況不符合2020年版《中國藥典（四部）》中殘留溶劑規定［5］116-120，且甲醇對人體有強烈毒性，可致失明、肝損傷甚至死亡［6-8］，故需嚴格控制產品中的乙醇含量和甲醇殘留量。為此，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中紅茴香和徐長卿進行定性鑒別，并采用頂空氣相色譜（HS-GC）法測定制劑中乙醇、甲醇的含量，以提升香卿止痛噴霧劑的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7697A - 7890B 型頂空氣相色譜儀（美國Agilent Technologies 公司）；AE240 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；FA1204S 型分析天平（上海精密科學儀器有限公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

香卿止痛噴霧劑（醫院藥劑科制劑室自制，批號分別為20210406，20210410，20210414）；槲皮苷對照品（批號為111538-202007，含量93.5%），丹皮酚對照品（批號為110708-201908，含量99.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司，批號為20220721）；無水乙醇（分析純，上海振興化工一廠，批號為202011330）；正丙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號為20190820）；甲醇（色譜純，西隴科學股份有限公司，批號為B2103011）；其余試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

紅茴香：精密量取樣品10 mL，置蒸發皿中揮干，加水20 mL，加熱使溶解，用乙酸乙酯萃取3次，揮干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，即得供試品溶液。按香卿止痛噴霧劑處方及工藝制備缺紅茴香的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。取槲皮苷對照品適量，加甲醇溶解，制成質量濃度為1 ng/mL 的對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 項下TLC 法［5］59-60，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶6∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖1.Reference solution 2 - 4.Test solution（batch numbers：20210406，20210410 and 20210414，respectively） 5.Negative reference solution A.Illicium henryi B.Cynanchi Paniculati Radix et RhizomaFig.1 TLC chromatograms

徐長卿：供試品溶液制備方法同“紅茴香”。按香卿止痛噴霧劑處方及工藝制備缺徐長卿的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。取丹皮酚對照品適量，加甲醇溶解，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502項下TLC法［5］59-60，吸取上述溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯（3∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以鹽酸酸化的5%三氯化鐵乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent HP-5毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），固定液為5%二苯基- 95%二甲基聚硅氧烷；程序升溫（40 ℃維持2 min，以3 ℃/min 的速率升至65 ℃，再以25 ℃/min的速率升至200 ℃，維持15 min）；進樣器溫度為200 ℃；檢測器溫度為220 ℃；頂空分流進樣，頂空進樣量為1 mL（置20 mL 頂空進樣瓶中，密封測定），平衡溫度為85 ℃，恒溫時間為20 min，分流比為100∶1；定量環溫度為85 ℃，傳輸線溫度為110 ℃。

2.2.2 溶液制備

精密量取無水乙醇5 mL，置100 mL容量瓶中，精密加入正丙醇5 mL，加水定容，搖勻，作為乙醇對照品貯備液；精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得乙醇對照品溶液。精密量取甲醇1 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，作為甲醇對照品貯備液；精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得甲醇對照品溶液。精密量取樣品10 mL，置100 mL 容量瓶中，精密加入正丙醇5 mL，加水定容，搖勻；精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得乙醇供試品溶液。取樣品作為甲醇供試品溶液。以水為空白溶劑。

2.2.3 方法學考察

系統適用性與專屬性試驗：分別精密量取2.2.2項下5 種溶液各6 mL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果空白溶劑色譜圖中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明方法專屬性良好；理論板數按甲醇峰計大于10 000，分離度均大于1.5。詳見圖2。

圖2 氣相色譜圖1.Methanol 2.Ethanol 3.n - PropanolA，A'.Blank solvent B.Methanol reference solution B'.Ethanol reference solution C.Methanol test solutionC'.Ethanol test solutionFig.2 GC chromatograms

線性關系考察：1）乙醇。精密量取無水乙醇5 mL，置100 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，即得5%乙醇；精密量取正丙醇5 mL，置100 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，即得5%正丙醇；精密量取上述5%乙醇0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，分別置100 mL 容量瓶中，精密加入5%正丙醇1.0 mL，加水定容，搖勻，作為乙醇系列對照品溶液。各精密量取6 mL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以乙醇體積分數（X，%）為橫坐標、乙醇/正丙醇峰面積值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y1=10.147 6X1- 0.001 6（R2= 1.000 0，n= 5）。結果表明，乙醇體積分數在0.025%～0.4%范圍內與乙醇/ 正丙醇峰面積值線性關系良好。2）甲醇。精密量取甲醇對照品貯備液0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，分別置50 mL 容量瓶中，均加水定容，搖勻，作為甲醇系列對照品溶液。各精密量取6 mL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以甲醇體積分數（X，%）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y2= 1 297.7X2-1.677 6（R2=0.999 2，n=6）。結果表明，甲醇體積分數在0.005%～0.16%范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：分別精密量取2.2.2 項下乙醇、甲醇對照品溶液各6 mL，按2.2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果乙醇/正丙醇峰面積值的RSD為1.09%（n=6），甲醇峰面積的RSD為1.35%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：分別精密量取2.2.2 項下乙醇、甲醇供試品溶液各6 mL，分別于室溫下放置0，2，4，6，8 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算體積分數。結果乙醇和甲醇體積分數的RSD分別為0.74%和10.91%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20210406）適量，共6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄體積分數。結果乙醇、甲醇平均體積分數分別為64.48%和0.008 4%，RSD分別為0.18%和5.66%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：1）乙醇。精密吸取已知乙醇體積分數（64.48%）的樣品（批號為20210406）5.0 mL，共9 份，置100 mL容量瓶中，精密加入正丙醇5.0 mL，分別精密加入無水乙醇2.0，3.5，5.0 mL，加水定容，搖勻；精密量取1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，分別精密量取6 mL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。2）甲醇。精密吸取已知甲醇體積分數（0.008 4%）的同一批樣品（批號為20210406）5.0 mL，置10 mL容量瓶中，精密加入2.2.2項下甲醇對照品溶液1.0 mL，加水定容，搖勻，平行6份，作為加樣供試品溶液。精密量取上述溶液各6 mL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（%）Tab.1 Results of the recovery test（%）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算乙醇、甲醇體積分數，平行2 次。結果批號為20210406，20210410，20210414 的樣品中，乙醇體積分數分別為64.21%，64.44%，65.49%，符合制劑質量標準要求的55%～75%［3］；甲醇體積分數分別為0.007 0%，0.008 0%，0.008 5%，均未高于《中國藥典（四部）》規定的0.05%［5］121。

3 討論

3.1 TLC 法建立

固定相選擇：香卿止痛噴霧劑由徐長卿和紅茴香兩味中藥組方，根據相關TLC 鑒別標準規范，紅茴香藥材的指標性成分為槲皮苷，采用聚酰胺作為固定相［3］；徐長卿藥材的指標性成分為丹皮酚，采用硅膠G 薄層板［4］。槲皮苷是黃酮類化合物的氧糖苷［9］，結構中含芳香核和共軛雙鍵；丹皮酚結構中含酚羥基。兩者在聚酰胺固定相中均可與聚酰胺形成氫鍵，產生較強的吸附作用，難以實現有效分離。而兩者極性相差較大，在極性吸附的硅膠G薄層板上均能實現良好分離，故采用硅膠G薄層板進行鑒別試驗。

展開劑優化：TLC 鑒別試驗中，紅茴香以正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5，V/V/V）為展開劑展開時，斑點拖尾嚴重。槲皮苷呈弱酸性（解離常數約為6.17）［9］，若展開劑pH ≥7 會增加其在展開劑中的解離度，易造成拖尾，故向展開劑中加入酸性物質進行優化［10-11］。比較石油醚-乙酸乙酯-甲酸（6∶4∶0.5，V/V/V）和二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶6∶1，V/V/V）的層析效果發現，后者可有效改善斑點的拖尾，且主斑點比移值適中。

供試品溶液制備方法優化：徐長卿藥材TLC 鑒別供試品溶液的制備采用乙醚振搖提取丹皮酚等揮發油成分［3］，但香卿止痛噴霧劑中加入冰片作為經皮促滲劑，其中的揮發油成分也可被乙醚萃?。?2］，后續難以分離。故利用冰片的水不溶性，將溶液于蒸發皿中蒸發、揮干后用熱水溶解，去除水不溶性的冰片后，再用乙酸乙酯萃取制備供試品溶液。優化后的供試品溶液制備方法有效去除了干擾斑點。

3.2 HS-GC 法優化

色譜柱篩選：參考相關標準［5］96-97，121和文獻［13-16］，綜合考慮待測組分甲醇、乙醇和正丙醇的沸點差異和極性差異，選擇2.2.1 項下毛細管柱（弱極性），結果甲醇峰和乙醇峰的分離度大于1.5，乙醇峰和正丙醇峰的分離度大于2.0，均實現良好分離。

進樣條件優化：甲醇和乙醇均屬揮發性有機化合物，為降低制劑中的水（強極性）對弱極性色譜柱的傷害，首選頂空進樣。比較不同進樣分流比（1∶1、10∶1、100∶1，V/V）發現，當進樣分流比為100∶1（V/V）時，甲醇峰和乙醇峰的分離度高，且峰形最佳。

3.3 方法評價

本研究中建立的TLC 法和HS-GC 法簡單可行、專屬性強、穩定性好，可分別從定性和定量兩方面對香卿止痛噴霧劑的質量標準進行完善和提升；同時可為其他含醇制劑檢查項研究，尤其是制劑中揮發性有機化合物檢測相關GC法的開發提供參考。