超聲輔助提取墨江刺五加中多糖的研究

摘要：刺五加有提高免疫力、抗疲勞等作用，多糖是刺五加的主要成分，也是發揮其藥用價值的重要成分之一。為健全完善超聲輔助提取墨江刺五加中多糖的工藝，采用單因素實驗和響應面法分析，探究料液比、超聲時間、超聲溫度對提取率的影響，獲取最佳提取的因素。結果表明：超聲時間與超聲溫度對刺五加多糖的提取率影響最大，當料液比為1：27.53（g：mL）、超聲溫度為38.21℃、超聲時間為45min時，刺五加多糖的提取率最大，達到30.58%。

關鍵詞：墨江刺五加；多糖；超聲提取

中圖分類號：R284.2" " " 文獻標識碼：" A" " " 文章編號：2095-7734（2024）06-0022-08

刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms為五加科多年生植物，在中醫學中是一種重要的中藥，可以用來治病，而在生活中也可作為一種蔬菜食用，可謂藥食同源。[1][2]刺五加分布于中國各地，且各地栽培種植技術都比較成熟，植株多以綠色為主。云南省南部墨江哈尼族自治縣地處北回歸線，地理氣候環境獨特，當地出產的紫色的刺五加，當地人也稱“紫五加”，其嫩葉芽作為鮮食蔬菜，食用口感比綠色的刺五加更佳，受到喜好食療的人群所追捧。

目前，多糖的提取方法主要有超聲輔助提取法、熱水提取法、微波輔助法、酶輔助法等。其中，熱水提取法雖操作簡單，但實驗時間長、實驗溫度高、安全性不足；微波輔助法提取時間短、污染少，但微波升溫速度太快，容易使各物質失活；酶輔助法提取的不足是加入的酶溶液價格昂貴，提取成本較高；與之相比，超聲輔助提取法的提取速度較快、能源損耗少、操作簡單、效率高，且提取的植物多糖品質高，因而適用于各種植物多糖的提取。[3]

" 在現代醫學中，從刺五加中提取有效活性物質具有重要意義。[4]刺五加多糖中含有免疫功能的生物物質，它同大多數植物的多糖一樣無毒。刺五加多糖實踐于動物實驗中，結果表明刺五加多糖既可以促進驗動物的生長發育，還可增強動物機體的免疫力，調節機體的微生態系統。因此，有的學者認為可以用多糖來代替一些抗生素和生長素，從而防止耐藥性和藥品殘留產生的問題。[5]本文以墨江哈尼族自治縣的刺五加（紫五加）為研究對象，采用紫外分光光度法和苯酚-濃硫酸顯色法，[6]測定干燥后刺五加的多糖含量、多糖濃度、吸光度，以找出最佳提取策略的最優條件，以期為刺五加開發醫藥、保健品和功能性食品作出現實指導，同時也為進一步健全刺五加的產品開發提供科學的參考。[7][8]

1 研究材料、設備和方法

1.1研究材料和設備

材料選取墨江哈尼族自治縣購買的新鮮刺五加，分析純的葡萄糖標準品、濃硫酸、苯酚、乙醇等。設備使用UV762型紫外可見分光光度計、JW-100S型潔威創美超聲波清洗機、SC-3616型低速離心機、FA3204B型電子分析天平、DHG-9245A型鼓風干燥箱、XA-1型固體樣品粉碎機、76-1A型數顯恒溫玻璃水浴槽。

1.2研究方法

1.2.1原料預處理

" 把購買的新鮮刺五加曬干，隨后放入烤箱中干燥至恒重。將恒重的刺五加用粉碎機粉碎，通過60目篩進行篩選，并放置備用。

1.2.2標準曲線的繪制

" 用分析天平稱取葡萄糖標準品1.0000g，放入100mL容量瓶內并加水定容，然后放入冰箱中靜止存放，放置24h，放置后，準確吸取葡萄糖溶液1.00mL，然后轉移至100mL的容量瓶中，加水定容至100ml刻度，獲取的葡萄糖標準使用液放冰箱中保存。

首先，移取6份樣品溶液作為對照，6份對照樣品溶液分別為0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL和1.00mL，[9]再用6支容積為10.00mL的比色皿，然后將6份不同容積的對照樣品溶液分別滴入比色皿內，并進行定容，使比色皿內溶液達到1.00mL。隨后，依次滴入1.00mL6%占比的苯酚溶液和5.00mL的硫酸，滴入后進行快速搖勻，將比色皿移至鐵架臺上進行加熱，加熱20min，進行自然冷卻。最后，以濃度c為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制出標準曲線。

1.2.3刺五加多糖的提取及含量測定

稱取刺五加粉1.0000g，放入具塞錐形瓶中加入蒸餾水定容，用600W進行超聲，并在4000r/min的離心機上進行離心20min，放入恒溫水浴鍋浸提，吸取上清液，再用100mL容量瓶加入上清液和蒸餾水，用蒸餾水定容，并置于陰暗處待用。在使用苯酚－硫酸比色法測定刺五加多糖含量的實驗過程中，稱取lg刺五加粉末放入錐形瓶中，加入適量的蒸餾水后放入超聲提取器中進行提取，隨后進行離心并取上清液定容到100mL。再從定容的溶液中取1mL溶液至50mL容量瓶中進行稀釋并定容，得到供試液。最后，取1mL供試液到比色管中，加入1mL6%的苯酚，再迅速加入5mL濃硫酸，快速搖勻。放入沸水浴中加熱20min，取出冷卻至常溫，在波長為488nm的紫外分光光度計中測其吸光度A。根據以下公式計算出刺五加中多糖提取率。

多糖提取率=×100%

" 式中：c為質量濃度（μg·mL-1）；V為定容體積（mL）；n為稀釋倍數；m為樣品質量（g）。

1.2.4單因素實驗

結合目前比較常用的設備以及前人的研究，在對刺五加多指標綜合評價得出的結論中，認為刺五加多糖提取溫度為60℃，料液比1：40，提取時間50min為最佳條件，多糖一般在溫度超過60℃會逐漸溶解，選取溫度梯度為25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，料液比超過1：50會由于濃度太低導致提取率較低，因此選擇5個梯度的料液比作為變化點進行制圖，超聲時間超過75min則溫度較高導致多糖溶解，而超聲功率設置為600W則超聲波清洗機超聲效率最高，功率的恒定對單因素變化無影響。[10]具體單因素實驗設置如下：

（1）不同料液比的多糖提取率

" 分別稱取1.0000g樣品加入5個具塞容量瓶中，分別加入蒸餾水10.0mL、20.0mL、30.0mL、40.0mL、50.0mL，將超聲波清洗機的超聲溫度設置為35℃，超聲時間調節至45min，超聲功率設置為600W，分別將容量瓶置于超聲清洗儀中進行超聲，采用苯酚-硫酸比色法進行測定，計算不同料液比的多糖提取率。

（2）不同超聲溫度的多糖提取率

" 分別稱取1.0000g樣品加入5個具塞容量瓶中，加入蒸餾水30.0mL，超聲時間、超聲功率不變，分別為45min、600W，依次設定超聲溫度為25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，再將具塞容量瓶放在超聲波清洗儀中進行超聲，采用苯酚-硫酸比色法進行測定，即可計算出不同超聲溫度的多糖提取率。

（3）不同超聲時間的多糖提取率

" 分別稱取1.0000g樣品加入5個具塞容量瓶內，加入蒸餾水30.0mL，超聲時間作為實驗中的單因素變量，超聲溫度和超聲功率為不變量，分別把超聲溫度和超聲功率設置為35℃和600W，對超聲波清洗儀中的超聲時間依次為15min、30min、45min、60min、75min，再將具塞容量瓶置于超聲波清洗儀超聲，采用苯酚-硫酸比色法進行測定，即可計算不同超聲時間的多糖提取率。

1.2.5響應面法實驗

" 為了更加直觀和準確地獲取刺五加中多糖提取率的各項因素，借助Expert 8.0.6.1軟件，用A、B、C英文字母分別代表超聲溫度、超聲時間、料液比，A、B、C為自變量，刺五加多糖的提取率為響應值，制作響應曲面圖以及等高線圖，分析A、B、C與刺五加多糖提取率之間的變化，通過方差分析、模型的顯著性分析，最終獲取最優的因素。

2 結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線

根據標準曲線的繪制步驟，繪制出葡萄糖溶液的標準曲線（如圖1）所示，標準曲線方程為y=0.0101x-0.0036（R2=0.9996），葡萄糖溶液的濃度同吸光度呈現正相關，且在0μg/mL-150μg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

2.2單因素實驗結果

2.2.1不同料液比刺五加多糖的提取率變化

當料液比值在1：10至1：30（g：mL）區間時，隨著濃度的不斷減小，刺五加多糖的提取率不斷增加，當料液比為1：30（g：mL）時，提取率為27.5%，達到了最高值。當料液比小于1：30（g：mL），濃度不斷降低后，刺五加多糖的提取率不斷下降，當達到1：50（g：mL）時，降至20.5%（如圖2）。結果表明：當料液比濃度不斷減小，刺五加多糖的提取率不斷增大到一定濃度后，繼續減小料液比的濃度，刺五加的提取率不斷減小。由此得出刺五加多糖的提取率最高的取料液比為1：30（g：mL）。

2.2.2不同超聲溫度刺五加多糖的提取率變化

當控制超聲溫度由25℃至65℃之間，溫度為35℃左右時，刺五加多糖的提取率最高，達到26.4%；當超聲溫度由35℃不斷增加至65℃時，刺五加多糖的提取率逐漸下降，當達到65℃時，多糖提取率最低（如圖3），也可能由于刺五加多糖的水解造成的，結果表明，刺五加多糖提取率最高的超聲溫度為35℃。

2.2.3不同超聲時間刺五加多糖的提取率變化

當超聲時間在15min至45min時，隨著超聲時間的增加，刺五加多糖的提取率不斷增加，當超聲時間為45min時，提取率最高為28.6%，超聲時間大于45分鐘之后，提取率逐漸降低，降低原因可能是隨著超聲時間的增加，雜質增加，多糖的提取率反而降低，結果表明：刺五加多糖提取的最佳超聲時間是45min。

2.3響應面法實驗結果

2.3.1響應面優化分析

" 使用Design Expert 8.0.6.1進行方差分析，得到刺五加多糖提取率的回歸方程式模型為：

Y=29.64+0.83A+0.90B-0.25C-0.95AB+1.15AC-1.45BC-1.47A2-6.42B2-5.12C2。（A為超聲溫度、B為超聲時間、C為料液比）實驗值與預測值有很好的擬合度（如表1、2、3）

結果表明模型有很好的可靠性，此次實驗設計具有科學性。

" 實驗模型中F為103.40；回歸方程達到顯著，P小于0.01，根據F值的分析，超聲時間、超聲溫度和料液比這三個因素對刺五加多糖提取率都有影響，且各個因素對多糖提取率都存在差異性，各因素的影響中，超聲時間影響最大，超聲溫度其次，料液比影響最小，即B＞A＞C。

2.3.2響應面圖分析

" 通過多元回歸方程制作響應曲面圖和等高線圖，得到交互影響多糖提取率的等高線圖與響應曲面圖。

超聲溫度和超聲時間對刺五加多糖的提取率具有重要作用，而且這兩個因素對刺五加多糖提取率存在交互作用，從等高線圖中發現，等高線圖具有兩個顯著的特征，即扁平且密集，這表明超聲溫度和超聲時間交互作用與多糖提取率顯著性較大，根據響應曲面圖的結果，曲面坡度較大（如圖5所示），結果表明：超聲溫度和超聲時間共同影響對刺五加多糖的提取率有顯著的作用。

超聲溫度和料液比對刺五加多糖提取率都具有作用，相互之間對刺五加多糖提取率形成交互作用，從等高線上來看，等高線圖呈現扁平，密集程度較低，可得出超聲溫度和料液比的交互下，刺五加多糖提取率的影響不明顯；從響應曲面圖來看，曲面坡度較小（如圖6所示），結果表明，超聲溫度和料液比對刺五加多糖的提取率的作用不顯著。

超聲時間和料液比對刺五加多糖提取率也具有重要作用，兩個因素對刺五加多糖提取率有交互作用，從等高線來看，等高線圖相對扁平且密度較大，在超聲時間和料液比的相互下，刺五加多糖提取率的變化明顯，從響應面圖來看，其曲面坡度較大（如圖7所示）。結果表明：超聲時間和料液比對刺五加多糖提取率的作用顯著。

" 綜上所述，根據響應曲面圖和等高線圖分析可知，三個因素通過交互作用對刺五加中多糖的提取率，按照影響大小排列順序依次為超聲時間、超聲溫度、料液比，實驗結果與回歸方程的方差分析表結果一致。

2.4驗證實驗

" 通過Design-Expert8.0.6.1軟件進行分析，分析出最大的響應值的最佳條件。把料液比、超聲時間以及超聲溫度這3個因素調節到多糖提取率的最佳條件，結果因素驗證為料液比為1：27.53（g： mL）、超聲時間為45min、超聲溫度為38.21℃。再驗證響應面法最佳提取率結果的準確度，重復三次實驗，刺五加多糖提取率均為最高，提取率達到30.58%。

3 結論

" 墨江哈尼族自治縣是云南省普洱市下轄縣之一，地處云貴高原西南部，最高海拔2278m，北回歸線穿城而過，境內山高谷深，河流縱橫，日照充足，是動植物棲息的天堂，也是農作物生長的重要場所，充沛的降雨和日照孕育出的植被生長旺盛，為此實驗的順利開展奠定了基礎，對云南南部的熱帶亞熱帶氣候生長出的植物開展科學研究提供了借鑒。

" 通過超聲時間、超聲溫度、料液比的研究，分析影響墨江刺五加中多糖提取率最高的因素，實驗依托超聲輔助法、單因素實驗法、響應面實驗法等途徑，通過實驗和計算發現：墨江刺五加多糖提取率達到最高的期望值時，3個影響因素設置為：料液比1：27.53（g：mL）、超聲時間45min、超聲溫度38.21℃，在此特定條件下，刺五加多糖提取率達到最優值為30.58%。本次實驗對刺五加多糖提取工藝進行了優化，增加了刺五加多糖的提取率，為墨江刺五加多糖的提取提供了借鑒和參考的價值。

" 研究中使用超聲波技術和苯酚—硫酸法檢測墨江刺五加多糖，實驗的可操作性較強，具有實驗成本低、實驗時間較短、可操作性強等特點。但在操作過程應注意藥品的安全性和藥品使用的時效性，如要特別注意濃硫酸的安全使用，實驗過程中，加入濃硫酸和苯酚時要迅速，以及苯酚溶液必須現配現用，不可使用放置時間長的藥品。各項藥品、設備在操作中必須規范操作，否則影響墨江刺五加多糖的提取率和影響因素的精準度。

" 隨著提取方法的不斷更新，超聲波、微波輔助提取、酶法提取等方法的不斷涌現，實驗方法具有一定的創新性。在多糖和黃酮的提取實驗中，越來越多實驗人員應用超聲輔助的方法，方法的更新能夠提升多糖等提取工藝的提取效率，但從單因素分析和最佳提取條件的實驗研究中，超聲輔助的響應面法和單因素實驗仍具有較大的優勢，具備效率高和準確性高的特點。隨著實驗科學性的不斷發展，多糖提取率將取得更大進步。

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[10] 王鏡雯.刺五加多指標綜合評價[D].吉林農業大學，2023.

Research on Polysaccharide Extraction from Moringa Using

Ultrasonic-Assisted Method

MA Xiaoling

（College of Biology and chemistry，Pu′er University，Pu'er 665000，Yunnan，China）

Abstract：Acanthopanax senticosus has effects such as improving immunity and resisting fatigue. Polysaccharide is the main component of Acanthopanax senticosus and also one of the important components for exerting its medicinal value. In order to improve and perfect the process of ultrasonic-assisted extraction of crude polysaccharides from Mojiang Acanthopanax senticosus， single-factor experiments and response surface methodology analysis were applied to explore the effects of solid-liquid ratio， ultrasonic time and ultrasonic temperature on the extraction rate and obtain the optimal extraction factors. The results show that ultrasonic time and ultrasonic temperature have the greatest impact on the extraction rate of Acanthopanax senticosus polysaccharides. When the solid-liquid ratio is 1：27.53 （g：mL）， the ultrasonic temperature is 38.21 °C， and the ultrasonic time is 45 minutes， the extraction rate of Acanthopanax senticosus polysaccharides is the highest， reaching 30.58%.

Keywords： mojiang acanthopanax senticosus;polysaccharide;ultrasonic assisted extraction