p62/SQSTM1在非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲轉移中的作用

馬雪 周世輝

錦州醫科大學附屬第一醫院急診科（遼寧錦州 121001）

肺癌是全球范圍內最常見的癌癥死亡原因，占2018年所有癌癥相關死亡人數的18.4%，位列所有惡性腫瘤之首［1］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常見的病理類型，占所有確診肺癌病例的80%以上［2］。NSCLC的總體預后較差，這主要是由于大部分NSCLC 患者在發現時已處于晚期，失去了手術機會，而以鉑類藥物為基礎的化療也僅能將患者的5年生存率維持在15%左右［3］。因此，尋找新的NSCLC 治療靶點已成為目前研究的熱點。

自噬是一種細胞自我消化過程，在這個過程中，錯誤折疊和聚集的蛋白質以及受損的細胞器被稱為自噬小體的雙膜小泡所隔離。自噬小體被送到溶酶體形成自溶酶體后便會自行降解和回收。自噬既可以為癌細胞提供營養，也可以引起癌細胞死亡在動態平衡的條件下，自噬被認為是腫瘤進展所必須的［4-6］。自噬相關蛋白p62/SQSTM1 在選擇性自噬中扮演著重要的角色，其能夠結合泛素化蛋白質從而進入自噬小體內，降解功能異常的聚合蛋白和過剩的蛋白質以發揮作用［11］。研究顯示，在多種腫瘤中均發現了p62 聚集，提示了高水平的p62 可能與腫瘤的形成密切相關［12-13］。值得注意的是，UMEMURA 等［14］報道了p62 可以通過激活Nrf2 介導的通路參與肺細胞癌的發生發展。然而，目前尚無研究全面系統地闡述p62 在NSCLC 中的具體作用。本研究旨在通過檢測p62 在體內外NSCLC 中的表達和生物學功能，探究p62 在NSCLC 細胞增殖和侵襲轉移中的作用，為p62 成為NSCLC 新的治療靶點提供完整可靠的理論和實驗依據。

1 材料與方法

在獲得本院倫理委員會批準（倫理審查編號：KX2022037）和所有患者知情同意后開展本研究。

1.1 主要試劑及耗材正常人支氣管上皮細胞（NHBE）和NSCLC 細胞系（NCI-H661、A549、NCIH1688、NCI-H1299 和NCI-H446）購買自中國科學院上海細胞研究所；DMEM 培養基、10%胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA 購買自美國Gibco 公司；1%青霉素/鏈霉素購買自美國Hyclone 公司；TRIzol 細胞裂解液、RIPA 細胞裂解液、cDNA 逆轉錄酶和QuantiTect SYBR?Green PCR 試劑盒購買自美國Sigma 公司；Matrigel 基質膠和Transwell 小室購買自美國Becton 公司；CCK-8 試劑盒和BCA 蛋白濃度定量試劑盒購買自上海碧云天生物科技有限公司；ECL 增強化學發光試劑盒購買自北京安諾倫生物科技有限公司；si-p62 和si-NC 購買自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1 空載載體（pcDNA-NC）和p62 過表達載體（pcDNA-p62）購買自上海吉凱基因化學技術公司；p62、Bcl-2、Bax、ATG5、Becline1、GAPDH 一抗和HBR 標記的相應二抗購買自上海酶聯生物技術有限公司；LipofectamineTM3000 及其他常見分子生物學相關試劑與耗材購買自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臨床組織樣本和細胞培養選取本院經病理組織學確診的和臨床診斷為NSCLC 的30 例NSCLC患者手術切除的肺癌組織和正常癌旁組織。正常癌旁組織（NHBE）和肺癌組織細胞（NCI-H661、A549、NCI-H1688、NCI-H1299 和NCI-H446）均用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM/F12 細胞培養基進行培養。加濕培養箱條件為95%相對濕度，5% CO2和37 ℃。對數期生長的細胞被收集起來用于后續實驗研究。

1.2.2 細胞轉染與分組將p62 表達水平最高的A549 細胞作為轉染對象。對數期A549 細胞按照4 × 105個/孔的密度接種在6 孔板中，并隨機分為Control 組、pcDNA-NC 組、pcDNA-p62 組、si-NC 組和si-p62組。當A549細胞融合度達到80%以上時，利用脂質體3000 轉染試劑將pcDNA-NC、pcDNAp62、si-NC 和si-p62 質粒分別轉染到pcDNA-NC 組細胞、pcDNA-p62 組細胞、si-NC 組細胞和si-p62 組細胞，Control 組細胞不做任何處理。轉染48 h 后，RT-qPCR 用于檢測CYTOR 表達以驗證細胞轉染效率。

1.2.3 RT-PCR 實驗使用TRIzol 處理的轉染后的A549 細胞并提取總RNA。用cDNA 逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA。使用QuantiTect SYBR?Green PCR 試劑盒對目標mRNA 進行PCR反應。反應條件如下所示：在94℃下初始變性30 s，然后94 ℃ 6 s，60 ℃ 30 s，總共40 個循環。GAPDH 為參照基因，使用2-ΔΔCq方法計算p62 的相對表達水平。引物序列如下所示：p62，正向5′-CACCAGACCATGCTTCAGTGAGA-3′和反向5′-GTTGCATGGCTGTTCACAGGA-3′和GAPDH，正向5′-CACCAGACCATGCTTCAGTGAGA-3′和反向5′-GTTGCATGGCTGTTCACAGGA-3′。

1.2.4 CCK-8實驗將轉染后的各組A549細胞按5×103個/孔的密度接種于96 孔板中。這些細胞分別培養0、24、48 和72 h 后，再加入10 μL 的CCK-8溶液繼續混合培養2 h。用自動酶標儀檢測各孔細胞在450 nm 處的吸光度以反映細胞增殖能力。

1.2.5 劃痕實驗通過劃痕實驗評估細胞的遷移能力。將轉染后的A549 細胞按照2 × 105個/孔的密度接種在6 孔板中，37 ℃下過夜培養。當細胞形成大約90%的致密融合單層時，用200 μL 的無菌移液槍槍頭穿過細胞表面形成一條寬度＜1 mm的垂直傷口。加入1 mL 的不含胎牛血清的DMEM培養基繼續培養48 h。用倒置光學顯微鏡觀察0和48 h 后的細胞創面情況并拍照。

1.2.6 Transwell 實驗通過Transwell 小室檢測細胞的侵襲能力。將轉染后的A549 細胞置于不含胎牛血清的DMEM 培養基中饑餓處理12 h 并將其調整為密度為2 × 105個/mL 的細胞懸液備用。在已接種Matrigel 膠的上室中加入100 μL 的細胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM 培養基500 μL。隨后將細胞置于培養箱中進行常規培養。培養48 h 后，用4%多聚甲醛固定上室細胞后再用0.1%的結晶紫染色。最后在倒置光學顯微鏡下觀察細胞侵襲情況并計算細胞侵襲數量。

1.2.7 Western blot 實驗使用RIPA 細胞裂解液提取轉染后A549 細胞中的總蛋白然后通過BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取30～40 μg的蛋白樣品，經12% SDS-PAGE 分離后轉移到0.22 μm的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜中，置于5%的脫脂奶粉中封閉過夜。隨后將PVDF 膜一抗p62（1 000；ab91526；Abcam）、Bcl-2（1∶1 000；ab32124；Abcam）、Bax（1∶1 000；ab32503；Abcam）、ATG5（1∶1 000；ab78073；Abcam）、Becline1（1∶1 000；ab207612；Abcam）和GAPDH（1∶1 000；ab32124；Abcam）在4 ℃下過夜。隨后，與HBR 標記的二抗（1∶1 000；ab32124；Abcam）共孵育2 h。按照制造商說明書，通過ECL 增強化學發光試劑盒對蛋白條帶進行顯色并用Image J 軟件分析條帶灰度。以GAPDH 作為內參分析目標蛋白的相對表達。

1.2.8 裸鼠皮下成瘤實驗將10 只3～4 周齡的雄性裸鼠隨機分為sh-NC和sh-p62組，每組各5只。sh-NC 組和sh-p62 組小鼠分別在皮下注射由shRNA-NC 和shRNA-p62 慢病毒感染的A549 細胞（4 × 105個）。每隔7 d 觀察1 次并記錄裸鼠體質量和腫瘤大小。5 周后采用乙醚處死小鼠，剝離腫瘤，腫瘤組織經稱重后用甲醛固定，石蠟包埋用于后續研究。

1.3 統計學方法本實驗中所有實驗都至少進行了3 次。采用GraphPad Prism 8 軟件對實驗數據進行統計分析。所有數據均采用均值±標準差表示。單因素方差分析（ANOVA）用于多組數據間的比較，studentt檢驗用于兩組數據間的比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p62 在NSCLC 組織和細胞中高表達癌旁組織p62 表達低于肺癌組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組p62 表達情況Tab.1 Expression of p62 in two groups ±s

表1 兩組p62 表達情況Tab.1 Expression of p62 in two groups ±s

組別癌旁組織肺癌組織t值P值p62 1.01±0.08 2.81±0.17 52.474＜0.001

2.2 敲低和過表達p62 對A549 細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響將siRNA 和pcDNA 轉染到A549 細胞中以下調和上調p62 的表達。p62 在si-NC、si-p62、pcDNA-NC、pcDNA-p62 組的表達水平分別為1.02±0.03、0.62±0.07、1.03±0.01、2.69±0.12。與si-NC 組細胞比較，si-p62 組細胞中的p62表達顯著降低（P＜0.05）。與pcDNA-NC 組細胞比較，pcDNA-p62 組細胞中的p62 表達顯著升高（P＜0.05）。接下來，分別通過CCK-8、劃痕和Transwell實驗檢測p62 對A549 細胞增殖，遷移和侵襲能力的影響，結果見圖1、圖2 和表2、表3。轉染si-p62后細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著降低（P＜0.05），而轉染pcDNA-p62 后細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著升高（P＜0.05）。

圖1 抑制和促進p62 表達對A549 細胞遷移的影響Fig.1 Effect of inhibition and promotion of p62 expression on A549 cells migration

圖2 抑制和促進p62 表達對A549 細胞侵襲的影響（結晶紫染色，× 200）Fig.2 Effect of inhibition and promotion of p62 expression on A549 cells invasion（Crystal violet staining，× 200）

表2 抑制和促進p62 表達情況Tab.2 Effect of inhibition and promotion of p62 expression ±s

表2 抑制和促進p62 表達情況Tab.2 Effect of inhibition and promotion of p62 expression ±s

組別si-NC組si-p62組t值P值組別pcDNA-NC組pcDNA-p62組t值P值p62 1.02±0.03 0.62±0.07 28.768＜0.001 p62 1.03±0.01 2.69±0.12 75.507＜0.001

表3 抑制和促進p62 表達對A549 細胞增殖、遷移和侵襲的影響Tab.3 Effect of inhibition and promotion of p62 expression on A549 cells proliferation，migration and invasion ±s

表3 抑制和促進p62 表達對A549 細胞增殖、遷移和侵襲的影響Tab.3 Effect of inhibition and promotion of p62 expression on A549 cells proliferation，migration and invasion ±s

組別侵襲細胞數/個si-NC組si-p62組t值P值48 h 0.48±0.06 0.34±0.04 10.634＜0.001 72 h 0.86±0.03 0.67±0.04 20.813＜0.001 87.12±5.01 42.76±10.01 21.706＜0.001組別侵襲細胞數/個pcDNA-NC組pcDNA-p62組t值P值OD值（450 nm）24 h 0.37±0.05 0.22±0.04 12.831＜0.001 OD值（450 nm）24 h 0.31±0.04 0.41±0.05 8.554＜0.001 48 h 0.55±0.02 0.71±0.06 13.856＜0.001 72 h 0.98±0.02 1.23±0.04 30.619＜0.001 85.22±4.54 124.29±8.21 22.810＜0.001

2.3 敲低和過表達p62 對A549 細胞自噬和凋亡蛋白的影響轉染si-p62 后，抗凋亡蛋白Bcl-2 自噬相關蛋白ATG5 和Becline1 表達水平明顯降低，而促凋亡蛋白Bax 表達水平明顯升高（P＜0.05）。而轉染pcDNA-p62 后，Bax 蛋白水平降低，而Bcl-2、ATG5 和Becline1 表達水平明顯升高（P＜0.05）。見表4。

表4 抑制和促進p62 表達對A549 細胞自噬和凋亡蛋白的影響Tab.4 Effect of inhibition and promotion of p62 expression on A549 autophagy and apoptosis ±s

表4 抑制和促進p62 表達對A549 細胞自噬和凋亡蛋白的影響Tab.4 Effect of inhibition and promotion of p62 expression on A549 autophagy and apoptosis ±s

組別si-NC組si-p62組t值P值組別pcDNA-NC組pcDNA-p62組t值P值Bcl-2蛋白0.58±0.01 0.31±0.04 35.867＜0.001 Bcl-2蛋白0.63±0.04 0.79±0.07 10.870＜0.001 Bax蛋白0.21±0.03 0.59±0.07 27.329＜0.001 Bax蛋白0.18±0.02 0.12±0.02 11.619＜0.001 ATG5蛋白0.68±0.02 0.48±0.02 38.730＜0.001 ATG5蛋白0.65±0.03 0.93±0.07 20.137＜0.001 Becline1蛋白0.58±0.07 0.37±0.03 15.103＜0.001 Becline1蛋白0.71±0.02 0.96±0.04 30.619＜0.001

2.4 敲低p62 抑制A549 細胞在小鼠體內的生長與sh-NC 組比較，sh-p62 組小鼠的移植瘤質量明顯減小（P＜0.05），見表5。體內實驗結果表明，下調p62 表達后可以有效抑制A549 細胞在小鼠體內的生長。

表5 抑制p62 對裸鼠腫瘤生長的影響Tab.5 Effect of inhibition of p62 expression on tumor growth in tumor-bearing mice ±s

表5 抑制p62 對裸鼠腫瘤生長的影響Tab.5 Effect of inhibition of p62 expression on tumor growth in tumor-bearing mice ±s

注：與sh-NC比較，*P＜0.05

組別Control組sh-NC組sh-p62組腫瘤質量（g）2.41±0.14 2.50±0.12 1.12±0.08*抑制率（%）--55.20

3 討論

p62 作為一種自噬接頭蛋白，其在腫瘤進展中的表達模式和具體作用尚不清楚。在本研究中，我們發現p62 在NSCLC 細胞和腫瘤組織中高表達。體外細胞功能實驗結果表明下調p62 的表達能有效抑制A549 細胞增殖、遷移、侵襲和自噬，而誘導細胞凋亡。同時，上調p62的表達則對A549細胞的生長具有相反的生物學效應。此外，體內移植瘤小鼠實驗結果表明沉默p62 能顯著抑制小鼠體內腫瘤生長。這些結果揭示了p62可能作為致癌基因通過調控細胞自噬促進NSCLC 細胞生長。

之前多項研究表明，多功能蛋白p62 在多種腫瘤細胞中異常高表達并發揮促進腫瘤生長的作用［15-17］。例如，p62 在食管鱗狀細胞癌中異常高表達，且p62 敲除后有效抑制了腫瘤細胞的惡性行為［15］。在結腸癌細胞中，沉默p62 能通過抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和自噬，緩解腫瘤細胞生長［16］。值得注意的是，臨床研究已證實p62 在肺腺癌患者腫瘤組織樣本中高表達，且高表達p62 的肺腺癌患者預后相對較差［17］。此外，DURAN 等［18］研究報道了在p62 敲除的小鼠中，肺腺癌細胞體內生長速度受到明顯抑制，同時細胞內ROS 和凋亡水平顯著升高，肺腺癌的發生率明顯下降。在本研究中，p62 在NSCLC 組織和細胞中的表達顯著升高，抑制p62 表達能有效抑制NSCLC 細胞的惡性行為，而過表達p62 表現出相反的效果，說明p62 在NSCLC 細胞的發生發展中發揮了重要的促癌作用。然而，p62 是通過什么途徑來影響NSCLC 細胞行為，目前尚不明確。綜合p62 的文獻調研結果，本研究進一步從細胞自噬的角度對p62 在NSCLC 中的調控機制進行了相應的研究與探討。

自噬在癌癥的發病機制中起著重要作用，既可以作為腫瘤抑制途徑，也可以作為腫瘤促進途徑［19-20］。研究顯示，在自噬缺陷的動物模型中，抑制自噬可以通過調控染色體的不穩定性來抑制腫瘤進展［21］。因此，自噬可以通過保護細胞內穩態防止腫瘤惡性轉化［22-23］。然而，自噬也可以通過維持暴露在細胞內環境壓力下的腫瘤細胞增殖，來促進腫瘤的生長和發展［24-25］。p62 是自噬的主要參與者，也是mTORC1 和Keap1-Nrf2 等多條重要信號轉導通路的樞紐。研究顯示，p62 蛋白泛素化后可以通過干擾UBA 結構域的聚化而啟動選擇性自噬。在選擇性自噬中，p62 不僅可以作為泛素化蛋白的接頭蛋白，也可以作為底物被自噬過程所降解［26］。在前列腺癌中，p62 可以通過誘導選擇性自噬受損促進腫瘤細胞的上皮間質轉化，進而增強細胞遷移和侵襲的能力［27］。最近的一項研究［28］發現，抑制p62 表達能夠調控PDCD10 的選擇性自噬降解而促進乳腺癌細胞的增殖轉移能力。在NSCLC中，自噬可以通過調控細胞凋亡在NSCLC進展中發揮促進和抑制兩種作用。一般來說，抑制自噬在多數情況下會限制NSCLC 腫瘤細胞維持穩態的能力［29］。本研究表明，與大多數情況保持一致，沉默p62 能通過抑制自噬來緩解NSCLC 細胞的惡性生長，而過表達p62 能通過上調自噬相關蛋白水平促進NSCLC 細胞的生長。

綜上所述，敲除p62 能通過抑制A549 細胞的保護性自噬來發揮抑癌作用，本研究結果將有助于更好地理解p62 在NSCLC 發生中的作用機制，為其成為肺癌診斷和治療的潛在靶點提供科學合理的依據。

【Author contributions】MA Xue performed the experiments and wrote the article.ZHOU Shihui performed the experiments.MA Xue and ZHOU Shihui revised the article.MA Xue designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.