早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變患兒血清自噬標(biāo)志物水平的變化及臨床應(yīng)用價(jià)值

吳濤 丁蘇明 詹昶 崔雯雯 唐衛(wèi)華

九江市婦幼保健院眼科（江西九江 332000）

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP）是一種發(fā)生于早產(chǎn)兒的視網(wǎng)膜血管增生性疾病。ROP 發(fā)生的危險(xiǎn)因素可歸納為產(chǎn)前因素和產(chǎn)后因素。目前研究認(rèn)為ROP 相關(guān)的產(chǎn)前因素包括出生時(shí)低胎齡和低體質(zhì)量等，產(chǎn)后因素包括出生后暴露于較高的氧氣水平以及母胎間相互作用喪失等［1-2］。雖然ROP 的相關(guān)因素已有相關(guān)研究，但疾病確切的病理生理機(jī)制并不明確。隨著近些年新生兒學(xué)、圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，早產(chǎn)兒、低體質(zhì)量?jī)旱拇婊盥曙@著提高，隨之而來(lái)的ROP 發(fā)生率也不斷上升［3］。ROP 會(huì)導(dǎo)致視力減退、甚至喪失，已成為兒童致盲的首要原因。因此，研究ROP 的病理生理機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)疾病的診斷標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)。細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，生理狀態(tài)下細(xì)胞通過(guò)自噬清除衰老及損傷的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；在缺血缺氧、炎癥反應(yīng)、能力代謝障礙等病理因素的刺激下，適度自噬有利于細(xì)胞存活，過(guò)度自噬會(huì)加重細(xì)胞損傷、不利于細(xì)胞存活［4-5］。ROP 相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ROP 動(dòng)物模型視網(wǎng)膜中自噬水平降低，自噬激動(dòng)劑改善ROP 病情［6］，提示自噬水平降低與ROP 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。目前ROP 與自噬相關(guān)的研究主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，缺乏相關(guān)的臨床研究證據(jù)支持。基于此，本研究將以ROP 患兒為對(duì)象，分析血清自噬標(biāo)志物的變化及臨床應(yīng)用價(jià)值，旨在獲得自噬與ROP 關(guān)系的臨床證據(jù)、發(fā)現(xiàn)新的ROP 分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2020年1 月至2022年12 月期間在九江市婦幼保健院篩查ROP 的早產(chǎn)兒作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）出生胎齡＜32 周；（2）接受ROP 篩查；（3）臨床資料完整；（4）出生第3 天和1、2、3 周時(shí)留取血清樣本；（5）取得患兒家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并先天畸形；（2）其他眼部疾病引起的視力減退，如先天性白內(nèi)障、青光眼、真菌感染。共納入210 例早產(chǎn)兒，其中68 例符合ROP 診斷的早產(chǎn)兒作為ROP 組，其余142 例早產(chǎn)兒作為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：LLsc-2022-052）。

1.2 方法及觀察指標(biāo)ROP 的篩查由專門接受過(guò)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變?cè)\斷培訓(xùn)的眼科醫(yī)生進(jìn)行，在出生第4 - 6 周時(shí)采用Retcam3 數(shù)字化眼底廣域成像系統(tǒng)（美國(guó)科瑞醫(yī)療系統(tǒng)公司）進(jìn)行視網(wǎng)膜檢查，參照指南［7］、觀察到視網(wǎng)膜血管異常增生作為ROP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，具體分期如下：視網(wǎng)膜顳側(cè)周圍的無(wú)血管區(qū)、有血管區(qū)之間有分界線出現(xiàn)為Ⅰ期；眼底分界線有嵴樣的隆起改變?yōu)棰蚱冢谎鄣追纸缇€嵴樣病變的基礎(chǔ)上有視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張?jiān)鲋潮憩F(xiàn)，可伴有纖維組織增殖為Ⅲ期；增殖的纖維和血管引起牽拉性視網(wǎng)膜脫落，伴或不伴黃斑脫落為Ⅳ期。Ⅰ-Ⅱ期為輕度ROP、Ⅲ-Ⅳ期為重度ROP。

收集早產(chǎn)兒的臨床資料，包括性別、分娩方式、出生體質(zhì)量、出生時(shí)胎齡，是否接受機(jī)械通氣治療及吸氧治療，參照指南判斷是否合并膿毒癥、支氣管肺發(fā)育不良。

出生第3 天及第1、2、3 周時(shí)，在生化采血管內(nèi)采集外周靜脈血約0.5～1.0 mL，靜置0.5 h 凝血后3 000 r/min 離心10 min，分離血清后統(tǒng)一放入-70 ℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)，統(tǒng)一取出血清樣本，由同一名人員按照采用LC3-Ⅱ（貨號(hào)ml063510）、Beclin-1（貨號(hào)ml060198）、P62（貨號(hào)ml061499）的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血清中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ、Beclin-1、P62 的水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，每份血清樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，兩組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，血清標(biāo)志物診斷ROP 的效能采用ROC曲線分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ROP 組與對(duì)照組臨床資料的比較ROP 組的出生體質(zhì)量、出生時(shí)胎齡均低于對(duì)照組，機(jī)械通氣治療比例、吸氧治療比例、膿毒癥比例、支氣管肺發(fā)育不良比例高于對(duì)照組（P＜0.05），性別、分娩方式與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 ROP 組與對(duì)照組臨床資料的比較Tab.1 Comparison of clinical data between ROP group and control group

表2 ROP 組與對(duì)照組血清中自噬標(biāo)志物的比較Tab.2 Comparison of serum autophagy markers between the ROP group and the control group ±s

表2 ROP 組與對(duì)照組血清中自噬標(biāo)志物的比較Tab.2 Comparison of serum autophagy markers between the ROP group and the control group ±s

自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周Beclin-1出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周P62出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周ROP組對(duì)照組t值P值30.48±5.81 27.90±4.19 26.50±3.90 28.09±3.69 32.09±6.73 31.00±6.11 32.26±5.82 32.86±6.27 1.693 3.778 7.400 5.806 0.092 0.001＜0.001＜0.001 107.31±25.83 90.42±20.70 87.58±20.37 92.17±20.43 113.12±25.48 108.46±22.22 111.03±21.94 112.24±22.09 1.536 5.649 7.408 6.310 0.126＜0.001＜0.001＜0.001 5.03±1.51 5.79±1.44 6.07±1.48 5.61±1.44 4.81±1.62 4.93±1.51 4.74±1.49 4.61±1.47 0.941 3.920 6.066 4.643 0.348 0.001＜0.001＜0.001

表3 ROP 組血清LC3-II 水平與臨床特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between serum LC3-II level and clinical features in ROP group ±s

表3 ROP 組血清LC3-II 水平與臨床特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between serum LC3-II level and clinical features in ROP group ±s

臨床特征機(jī)械通氣出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周否（n=9）是（n=59）t值P值吸氧否（n=12）是（n=56）t值P值膿毒癥否（n=18）是（n=50）t值P值支氣管肺發(fā)育不良否（n=38）是（n=30）t值P值28.05±9.59 30.85±5.44 1.036 0.304 33.73±7.68 27.01±3.85 3.432 0.001 30.56±8.12 25.88±3.52 2.524 0.015 32.35±8.58 27.44±3.24 2.761 0.008 29.03±9.57 30.79±5.51 0.645 0.520 32.38±8.14 26.94±3.74 2.803 0.007 33.78±8.72 24.94±3.61 4.590＜0.001 32.48±9.08 27.15±3.31 2.900 0.005 29.29±9.74 30.91±5.33 0.873 0.386 31.62±8.81 26.56±3.55 3.391 0.001 32.33±9.12 24.40±3.52 5.214＜0.001 31.45±9.34 26.88±3.40 2.984 0.004 29.96±6.12 31.14±5.62 0.818 0.416 30.31±5.32 24.85±3.52 4.843＜0.001 29.90±4.85 22.19±3.01 7.619＜0.001 31.90±5.01 23.27±2.89 8.389＜0.001

表4 ROP 組血清Beclin-1 水平與臨床特征的關(guān)系Tab.4 Relationship between serum Beclin-1 level and clinical features in ROP group ±s

表4 ROP 組血清Beclin-1 水平與臨床特征的關(guān)系Tab.4 Relationship between serum Beclin-1 level and clinical features in ROP group ±s

臨床特征機(jī)械通氣出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周否（n=9）是（n=59）t值P值吸氧否（n=12）是（n=56）t值P值膿毒癥否（n=18）是（n=50）t值P值支氣管肺發(fā)育不良否（n=38）是（n=30）t值P值105.34±45.41 107.61±26.12 0.175 0.761 118.94±49.12 86.11±20.12 3.049 0.003 124.56±47.67 81.94±19.48 4.095＜0.001 118.59±49.19 88.14±20.71 2.769 0.007 104.65±62.38 107.88±27.12 0.286 0.776 109.65±57.13 86.30±19.45 2.504 0.015 113.57±47.68 82.01±18.95 3.810 0.001 111.96±51.32 87.93±19.12 2.770 0.007 108.48±48.49 106.89±26.75 0.154 0.870 102.11±44.38 86.21±19.12 2.073 0.040 104.55±41.12 81.47±18.94 3.169 0.002 107.25±43.38 86.74±19.32 2.703＜0.001 107.64±24.28 106.34±27.47 0.207 0.837 96.18±22.52 83.12±18.57 2.561 0.013 92.10±22.31 81.85±19.12 2.001 0.048 98.61±21.94 84.01±18.79 2.900 0.005

表5 ROP 組血清P62 水平與臨床特征的關(guān)系Tab.5 Relationship between serum P62 level and clinical features in ROP group ±s

表5 ROP 組血清P62 水平與臨床特征的關(guān)系Tab.5 Relationship between serum P62 level and clinical features in ROP group ±s

臨床特征機(jī)械通氣出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周否（n=9）是（n=59）t值P值吸氧否（n=12）是（n=56）t值P值膿毒癥否（n=18）是（n=50）t值P值支氣管肺發(fā)育不良否（n=38）是（n=30）t值P值4.83±2.44 5.06±1.44 0.310 0.758 4.48±2.61 5.99±1.39 2.126 0.037 3.84±2.19 6.41±1.40 3.769 0.001 3.84±2.29 5.88±1.54 2.840 0.008 4.94±2.51 5.05±1.49 0.203 0.840 4.43±2.35 6.08±1.62 2.942 0.004 4.29±2.31 6.45±1.62 3.871 0.001 4.12±2.24 5.93±1.67 3.201 0.002 4.81±2.46 5.11±1.44 0.620 0.537 4.76±2.42 6.16±1.65 2.711 0.009 5.15±2.19 6.40±1.59 2.568 0.012 4.55±2.41 5.99±1.59 2.852 0.006 4.93±1.65 5.16±1.84 0.542 0.589 5.36±1.77 6.33±2.14 2.046 0.045 5.56±1.73 6.72±1.84 2.670 0.010 4.95±1.35 6.45±1.94 3.766 0.001

表6 ROP 組中不同病情嚴(yán)重程度患兒血清中自噬標(biāo)志物的比較Tab.6 Comparison of serum autophagy markers in children with different severity of disease in ROP group

2.2 ROP 組與對(duì)照組血清中自噬標(biāo)志物的比較ROP 組與對(duì)照組出生第3 天時(shí)的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62水平比較差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ROP 組患兒出生第1、2、3 周時(shí)的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1 水平低于對(duì)照組，P62 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 血清LC3、Beclin-1、P62 水平診斷ROP 的效能出生第1、2、3 周時(shí)的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 單獨(dú)及聯(lián)合診斷ROP 的ROC 曲線分別見圖1- 3。出生第1周、2周、3周時(shí)LC3-Ⅱ診斷的靈敏度分別為64.08%、71.13%、61.97%，特異度分別為70.59%、75.00%、82.35%；Beclin-1 診斷的靈敏度分別為60.56%、68.31%、61.27%，特異度分別為76.47%、77.94%、79.41%；P62 診斷的靈敏度分別為52.11%、67.61%、59.19%，特異度分別為72.06%、77.94%、79.41%三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷的靈敏度分別為80.28%、91.55%、85.21%，特異度分別為95.59%、97.06%、92.65%。

圖1 出生第1 周血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 單獨(dú)及聯(lián)合診斷ROP 的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of serum LC3-Ⅱ，Beclin-1，P62 at the first week of birth alone and combined with ROP diagnosis

圖2 出生第2 周血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 單獨(dú)及聯(lián)合診斷ROP 的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of serum LC3-Ⅱ，Beclin-1，P62 at the second week of birth alone and combined with ROP diagnosis

圖3 出生第3 周血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 單獨(dú)及聯(lián)合診斷ROP 的ROC 曲線Fig.3 ROC curve of serum LC3-Ⅱ，Beclin-1，P62 at the third week of birth alone and combined with ROP diagnosis

2.4 ROP 組血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 水平與臨床特征的關(guān)系ROP 組中不同臨床特征患兒出生第3 天時(shí)的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），接受機(jī)械通氣治療、吸氧治療以及合并膿毒癥、支氣管肺發(fā)育不良患兒出生第1、2、3 周時(shí)的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1 水平低于未機(jī)械通氣治療、吸氧治療以及未合并膿毒癥、支氣管肺發(fā)育不良患兒，P62 水平高于未機(jī)械通氣治療、吸氧治療以及未合并膿毒癥、支氣管肺發(fā)育不良患兒（P＜0.05）。

2.5 ROP組中不同病情嚴(yán)重程度患兒血清中自噬標(biāo)志物的比較ROP 組中重度患兒出生第3 天和1、2、3 周時(shí)的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1 低于輕度患兒，P62 水平高于輕度患兒（P＜0.05）。

3 討論

ROP 的發(fā)病分為兩個(gè)階段，第1 階段是早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜血管發(fā)育不良，第2 階段是缺血缺氧刺激視網(wǎng)膜新生血管及纖維組織大量增生［8-9］。因?yàn)镽OP 發(fā)病的第1 階段缺乏特異性表現(xiàn)，所以臨床實(shí)踐中根據(jù)第2 階段的臨床特征進(jìn)行ROP篩查。目前篩查ROP 的時(shí)機(jī)通常為出生后第4 -6 周、篩查手段是眼底檢查，此時(shí)ROP 已發(fā)展至第2 階段、出現(xiàn)了視網(wǎng)膜血管新生和纖維組織增生，無(wú)法早期診斷疾病成為目前限制ROP 臨床診療的主要因素［10-11］。根據(jù)ROP 發(fā)病的病理生理特點(diǎn)，研究疾病發(fā)病第1 階段、即視網(wǎng)膜血管發(fā)育不良的分子生物學(xué)特征，有助于發(fā)現(xiàn)ROP 早期的特異性分子標(biāo)志物，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)疾病的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。細(xì)胞自噬是一種高度保守的細(xì)胞分解代謝過(guò)程，受損或過(guò)剩的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分被隔離在雙膜自噬體中，而后轉(zhuǎn)移到溶酶體中形成自噬溶酶體并發(fā)生降解和再循環(huán)。在缺血缺氧、炎癥刺激、能力代謝障礙等病理?xiàng)l件下，自噬激活有助于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增強(qiáng)細(xì)胞在病理?xiàng)l件下的存活能力。有研究報(bào)道，血清自噬標(biāo)志物Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62 對(duì)腦缺血、膿毒癥等疾病的病情和預(yù)后具有評(píng)估價(jià)值［12-14］。

本研究對(duì)血清自噬標(biāo)志物作為ROP 診斷及病情評(píng)估標(biāo)志物的價(jià)值展開分析。以未發(fā)生ROP的早產(chǎn)兒為對(duì)照，ROP 患兒出生第3 天時(shí)的血清自噬標(biāo)志物無(wú)顯著變化，出生第1、2、3 周時(shí)的血清Beclin-1、LC3-Ⅱ水平降低，P62水平增加。Beclin-1、LC3-Ⅱ參與自噬溶酶體的形成，對(duì)自噬起促進(jìn)作用；P62 阻礙自噬溶酶體的形成，對(duì)自噬起抑制作用。本研究的血清檢測(cè)結(jié)果表明在ROP 發(fā)病的第1 周起出現(xiàn)了自噬變化，表現(xiàn)為自噬水平的降低。ROP 相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ROP 乳鼠視網(wǎng)膜中Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)水平降低，P62 的表達(dá)水平增加，與本研究的血清檢測(cè)結(jié)果一致，提示自噬水平降低與ROP 的發(fā)病相關(guān)。本研究進(jìn)一步對(duì)血清自噬標(biāo)志物診斷ROP的效能進(jìn)行了分析，出生第1、2、3 周時(shí)的血清Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62 均對(duì)ROP具有診斷價(jià)值，其中出生第2 周時(shí)三項(xiàng)血清自噬標(biāo)志物聯(lián)合診斷ROP 的效能最理想、靈敏度和特異度分別達(dá)到。

目前自噬相關(guān)的研究認(rèn)為炎癥、缺氧等是自噬上游的調(diào)控因素，本研究對(duì)ROP 發(fā)病過(guò)程中影響自噬的因素進(jìn)行了初步探索。ROP 相關(guān)的臨床研究認(rèn)為導(dǎo)致ROP 病情加重的臨床因素包括機(jī)械通氣及吸煙治療、合并膿毒癥及支氣管肺發(fā)育不良［15-16］，本研究對(duì)ROP 相關(guān)因素與血清自噬標(biāo)志物的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：接受機(jī)械通氣及吸煙治療、合并膿毒癥及支氣管肺發(fā)育不良與ROP患兒產(chǎn)生后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清Beclin-1、LC3-Ⅱ水平降低，P62 水平增加有關(guān)，提示抑制細(xì)胞自噬可能是機(jī)械通氣及吸煙治療、合并膿毒癥及支氣管肺發(fā)育不良等臨床因素導(dǎo)致ROP 發(fā)生發(fā)展的潛在生物學(xué)機(jī)制，但相關(guān)臨床因素與自噬之間的關(guān)系仍需要更多的基礎(chǔ)研究來(lái)驗(yàn)證。

自噬對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有積極意義，在缺血缺氧、炎癥刺激等病理?xiàng)l件下自噬激活有利于細(xì)胞存活、減輕病理?xiàng)l件對(duì)細(xì)胞和組織的損傷。在ROP 的發(fā)病過(guò)程中自噬水平減弱會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，不利于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在缺血缺氧狀態(tài)下存活，進(jìn)而導(dǎo)致ROP 的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：自噬激動(dòng)劑改善ROP 乳鼠的視網(wǎng)膜血管異常迂曲、視盤周圍無(wú)灌注［5，17］，表明自噬激活在ROP 的發(fā)生發(fā)展中起保護(hù)。本研究對(duì)ROP 患兒病情與自噬標(biāo)志物的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：與輕度ROP 患兒比較，重度ROP 患兒出生第3 天和1、2、3 周時(shí)的血清Beclin-1、LC3-Ⅱ水平降低，P62 水平增加，表明ROP 發(fā)病過(guò)程中自噬水平降低與病情加重有關(guān)，這與自噬激活改善ROP 病情的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

綜上所述，ROP 患兒出生第1 周期血清自噬標(biāo)志物水平發(fā)生顯著變化，Beclin-1、LC3-Ⅱ水平降低，P62 水平增加，血清三項(xiàng)自噬標(biāo)志物對(duì)疾病具有診斷效能；機(jī)械通氣及吸煙治療、合并膿毒癥及支氣管肺發(fā)育不良是導(dǎo)致ROP 發(fā)病后自噬水平變化的臨床因素，自噬水平降低與ROP 病情加重有關(guān)。本研究的以上結(jié)果為今后臨床診斷ROP 提供了血清標(biāo)志物，早期準(zhǔn)確診斷ROP 有助于指導(dǎo)臨床治療、降低疾病的致盲風(fēng)險(xiǎn)。本研究的主要不足之處在于ROP 的樣本量較小，雖然比較了輕度與重度ROP 患兒自噬標(biāo)志物的差異，但受限于樣本量、無(wú)法得到自噬標(biāo)志物診斷輕度與重度ROP的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，今后需要在臨床實(shí)踐中繼續(xù)收集ROP 患兒、擴(kuò)大樣本量并深入探索自噬在ROP 中的作用及機(jī)制。

【Author contributions】WU Tao collected clinical data，detected the contents of LC3-Ⅱ，Beclin-1，P62 in serum and wrote the article.DING Suming collected clinical data.ZHAN Chang and CUI Wenwen performed the data analysis.TANG Weihua designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.