植物次生代謝的區室化研究進展

關智晶 孫超

（1. 天津中醫藥大學，天津 301617；2. 中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193）

植物次生代謝產物不僅可以作為防御分子對抗自然環境中的生物和非生物脅迫，而且許多次生代謝產物具有顯著的生物活性，為醫藥、農業、化工、食品和化妝品等行業提供了寶貴原料，對人類的生產生活具有重要意義［1］。次生代謝途徑中一系列化學反應的順利完成需要特定的反應條件，區室化正是植物應對這一難題的巧妙方法。此外，植物次生代謝區室化過程中還需要轉運蛋白參與跨膜運輸。近年來，隨著單細胞轉錄組、空間轉錄組和質譜成像等新技術的出現，極大地提高了我們對于次生代謝空間分布的解析能力，區室化研究已經成為次生代謝研究領域里的一個新熱點。

1 植物次生代謝在不同水平上的區室化

植物次生代謝存在多層次的區室化現象，這些不同的區室構成了相互作用的區室系統，是植物為了生存和抵抗環境脅迫，長期適應性進化的結果，對植物生長發育具有重要意義。同時區室化策略還能為代謝工程和合成生物學研究提供新的思路［2］。例如，Shi等［3］發現人參皂苷合成的關鍵酶原人參二醇合酶（protopanaxadiol synthase, PPDS）在酵母中異源表達時定位于內質網膜上，而其底物達瑪烯二醇存在于脂滴當中。研究人員通過將PPDS靶向脂滴中，為酶反應建立了新的化學區室，從而顯著提高了人參皂苷的生產效率，底物轉化率達到86%。

1.1 分子水平的區室化

代謝區室（metabolon）是植物次生代謝中最小的區室，是由催化“級聯”反應的酶通過非共價作用聚合而成的瞬時多酶復合體。在代謝區室內可形成底物通道，防止不穩定中間產物的降解和副反應的發生，提高酶的催化效率。代謝區室的形成可以增強途徑反應，而代謝區室的解離可以下調途徑反應，通過代謝區室的聚合和解離，植物可以對代謝流進行動態調節［4］。目前，已發現多種次生代謝產物的合成過程中存在分子水平的區室化現象，包括苯丙素類、生氰糖苷、萜類和生物堿等［5］。例如，蜀黍氰甙（dhurrin）是一種由高粱合成的具有防御功能的生氰糖苷類化合物。在植物體內，細胞色素P450CYP79A1和CYP71E1、糖苷轉移酶UGT85B1能夠形成代謝區室，催化L-酪氨酸合成蜀黍氰甙（圖1-A）［6］。此外，苯丙素合成途徑中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）和肉桂酸-4-羥化酶（C4H）可以形成代謝區室，催化L-苯丙氨酸生成香豆酸［7］。

圖1 植物不同水平上的次生代謝區室化Fig. 1 Plant specialized metabolic compartmentalization on different levels

1.2 亞細胞水平的區室化

由于次生代謝途徑中的酶和中間產物往往會定位于不同細胞器中，所以次生代謝會在亞細胞水平上出現區室化現象。例如，抗癌藥物長春堿和長春新堿在長春花葉中的生物合成至少涉及5個亞細胞區室，分別是細胞質、液泡、內質網、葉綠體和細胞核［8］。硫代葡萄糖苷在植物體內的生物合成途徑分為3個階段：R側鏈的延伸、核心結構的合成和側鏈的修飾。首先，甲硫氨酸在胞質溶膠中發生由BCAT4催化的初始脫氨反應，隨后進入葉綠體中完成側鏈延伸，之后在內質網中形成脫硫硫苷，脫硫硫苷運輸至胞質溶膠中形成硫苷核心結構，最后繼續在胞質溶膠中進行側鏈修飾，形成硫代葡萄糖苷［9］（圖1-B）。有些化合物可以在多個亞細胞區室中產生，例如，所有萜類物質的共同前體異戊烯焦磷酸可以在細胞質中通過甲羥戊酸（MVA）途徑合成，也可以在質體中通過甲基赤蘚糖醇磷酸（MEP）途徑合成［10］。除了常規的細胞器之外，苯質體（phenyloplasts）和單寧體（tannosomes）分別是酚類和縮合單寧（高聚原花青素）的生產和儲存的特殊細胞器［11-12］。

1.3 細胞水平的區室化

每個細胞都是一個單獨的區室，每種細胞類型都有自己的代謝活動，次生代謝途徑會在不同的細胞類型之間進行分工［13］。例如，長春花中長春堿的生物合成過程中涉及到的酶反應分布在4種不同的細胞類型當中，起始于韌皮部內薄壁細胞，中間產物馬錢苷酸從韌皮部內薄壁細胞轉移至表皮細胞當中，乳汁細胞和異形細胞是文多靈和其他單萜吲哚類生物堿合成的場所［14］（圖1-C）。罌粟中嗎啡的生物合成過程至少涉及韌皮部的3種細胞類型，分別是伴胞、篩管分子和乳汁細胞。嗎啡的兩種合成原料多巴胺和四羥基乙醛會在篩管分子中形成7-氧二氫蒂巴因，一部分7-氧二氫蒂巴因會在篩管分子中繼續生成蒂巴因（篩管分子中的途徑酶都是在伴胞中合成后轉移至篩管分子的），隨即蒂巴因會通過芐基異喹啉攝取通透酶（BUPs）家族轉移至乳汁細胞中完成嗎啡的合成；而另一部分7-氧二氫蒂巴會在BUPs家族的介導下直接轉移至乳汁細胞中合成最終產物［15］。

1.4 組織器官水平的區室化

植物體的器官是植物體內最大的區室，次生代謝產物的儲存常常集中在某種器官當中，例如青蒿素主要儲存在黃花蒿的葉片中，杜仲綠原酸主要存在于杜仲葉片中，人參皂苷主要存在于人參和三七的根中，這些積累的器官通常為藥用植物的“藥用部位”。盡管植物能在特定的器官積累次生代謝產物，但是積累的地點并不總是合成的地點。植物體內存在一個將“源”組織器官中合成的次生代謝產物運輸到“庫”組織器官中的轉運系統［13］。例如，木薯中產生的生氰糖苷在葉片中合成，最終會運輸到根部。黃連在根中產生小檗堿，隨后會轉移至根莖當中。擬南芥中硫代葡萄糖甙在運輸到種子之前在葉片和角果中產生。尼古丁是一種煙草屬的吡咯烷生物堿，主要在根組織中合成，隨即被運輸到地上部分并在葉中積累［16］（圖1-D）。

2 次生代謝產物的跨膜轉運

次生代謝的區室化必然伴隨著中間代謝產物的跨膜運輸，轉運蛋白在次生代謝產物的跨膜運輸過程中發揮著關鍵作用。目前已報道的參與植物次生代謝產物轉運的轉運蛋白來源于4個蛋白家族，分別是ATP結合盒轉運蛋白（ABC）、多藥和毒素外排家族蛋白（MATE）、硝酸鹽/多肽轉運家族蛋白（NPF）和嘌呤通透酶（PUP）。

2.1 ABC轉運蛋白對植物次生代謝物的轉運

ABC蛋白家族轉運蛋白是數量最多、功能最廣泛的超家族蛋白之一。高等植物中的ABC蛋白分為8個亞家族［1］，參與次生代謝轉運的轉運蛋白主要集中在ABC B、ABC C和ABC G 三個亞家族中，轉運的次生代謝產物包括生物堿、黃酮類化合物、萜類化合物、揮發性化合物和類胡蘿卜素等。目前已鑒定的ABC G亞家族轉運蛋白都是負責向胞外的跨細胞膜運輸；ABC C亞家族主要負責花青素類物質由胞質向液胞內的跨膜運輸；ABC B亞家族既可以向細胞內，也可以向細胞外運輸次生代謝產物。

2.2 MATE轉運蛋白對植物次生代謝物的轉運

MATE轉運蛋白家族成員幾乎存在于所有的植物中，含量豐富且具有各種各樣的功能，參與次生代謝產物和植物激素的運輸、外源性物質的解毒等［17］。據報道，MATE家族成員參與了生物堿、黃酮類和萜類化合物等次生代謝產物在不同區室之間的轉運。定位于液泡膜上的轉運蛋白負責向液泡內轉運次生代謝產物，定位于細胞膜上轉運蛋白向細胞外運輸次生代謝產物。

2.3 PUP轉運蛋白對植物次生代謝物的轉運

先前研究認為植物中的PUP轉運蛋白家族主要參與含嘌呤環化合物（腺嘌呤、胞嘧啶和細胞分裂素）和含吡啶環化合物（吡哆醇和吡哆醛）的運輸［1］。除此之外，現在已經有研究證明PUP蛋白及其同源物NUP1（主要介導尼古丁Nicotine轉運）和BUP1（主要介導芐基異喹啉類生物堿BIA轉運）也參與著植物中次生代謝產物——生物堿的運輸，這些轉運蛋白都定位于細胞膜上，參與生物堿向細胞內的跨膜運輸。

2.4 NPF轉運蛋白對植物次生代謝物的轉運

NPF是一個大的轉運蛋白家族，這些蛋白質最初被認為是一類在植物硝酸鹽吸收和運輸中具有獨特功能的轉運蛋白［18］，目前多項研究證明，NPF轉運蛋白也在次生代謝產物的轉運中發揮作用。高等植物中NPF家族分為8個亞家族NPF1-8［19］，其中已鑒定的參與次生代謝轉運的轉運蛋白主要集中在NPF1和NPF2兩個亞家族中，轉運的次生代謝產物包括硫代葡萄糖苷、生氰糖苷、黃酮醇苷和生物堿。NPF1蛋白負責向液泡外的跨膜運輸，NPF2蛋白大多向細胞內轉運次生代謝產物，也有少數向液泡外運輸（表1）。

表1 運輸植物次生代謝產物的轉運蛋白Table 1 Transport proteins that transport plant specialized metabolites

3 次生代謝區室化對植物產生的影響

次生代謝的區室化現象在植物界中廣泛存在，可以有效降低酶抑制效應、控制代謝流的大小和方向、減輕中間產物的細胞毒性、提高中間產物的穩定性、分散細胞的代謝負擔、防止不必要的代謝串擾，在植物的生長發育和脅迫響應中發揮著重要作用。

3.1 降低酶抑制效應

代謝產物可以抑制產生代謝產物的酶，這是一種在真核生物中普遍存在的現象，而區室化最大限度的減少了這種不可避免的酶抑制，并減輕了自我抑制對次生代謝的限制［72］。Alam 等［72］將酶定位到不同細胞器，來研究區室化對抑制劑網絡的影響，研究結果表明次生代謝是通過利用亞細胞區室減少酶的抑制作用。

3.2 減輕中間產物的細胞毒性

植物中所產生的次生代謝產物一般以低濃度形式存在，因為某些次生代謝產物的濃度升高會產生細胞毒性［1］。而為了避免這種自身毒性，植物中已經進化出存在各種各樣的解毒機制。例如，細胞外排、液泡隔離、囊泡運輸、胞外生物合成以及以無毒形式積累代謝產物等［73］。可以看出，區室化作用在這些解毒機制中占了很大的比例。例如在長春堿合成過程中，參與單體縮合反應的酶，即異胡豆苷合酶和過氧化物酶，定位在液泡中，這表明細胞將產生的有害終產物隔離在液泡中，從而保護細胞免受自身毒性［74］。

3.3 提高中間產物的穩定性

區室化可以將次生代謝途徑中不能穩定存在的中間體轉化為穩定的中間體。如L-酪氨酸經過由3種酶（細胞色素P450酶CYP79A1和CYP71E1、葡萄糖苷轉移酶UGT85B1）組成的代謝區室最終合成dhurrin。在這個過程中，L-酪氨酸先通過CYP79A1和CYP71E1轉化為氰醇，氰醇在細胞質基質中不穩定，之后通過UGT85B1酶可以轉化為穩定的氰苷［4］。

3.4 防止不必要的代謝串擾

區室化可以有效防止次生代謝途徑之間的相互干擾［75］。例如，異戊二烯是所有萜類物質的前體，植物可以通過細胞質中的MVA途徑和質體中的MEP途徑合成異戊二烯，細胞質中合成的異戊二烯主要用于倍半萜和三萜的合成，而質體中的異戊二烯主要用于單萜和二萜的合成，從而有效避免了不同萜類物質合成之間的相互干擾。

4 植物次生代謝區室化及相關轉運蛋白的應用研究

對植物次生代謝區室化的深入研究為通過生物技術提高次生代謝產物含量提供了新的思路和策略。利用生物技術將代謝途徑限制在質體和線粒體等亞細胞區室內，可以有效提高酶和底物的濃度，減少支路代謝和復雜調控網絡的干擾，提高目標產物的產量。例如，Wu等［76］通過將法尼基焦磷酸合酶與紫穗槐二烯合酶定位到煙草葉綠體上，使得紫穗槐二烯的產量提高了1 000倍以上。植物次生代謝轉運蛋白的發現為轉運工程和合成生物學研究提供了新的靶點。通過刪除一些有毒或有害物質的轉運蛋白基因可以降低植物組織中相應物質的積累，提高農作物或其他經濟作物的品質。例如，Nour-Eldin等［77］通過突變刪除油菜的GTR轉運蛋白基因，可以使油菜種子中的抗營養性物質硫代葡萄糖苷的含量下降了60%-70%。

在天然產物合成生物學研究中，通過在底盤細胞中表達植物轉運蛋白或改造底盤細胞的轉運體系，可以將合成的次生代謝產物轉運到培養基中或隔離到細胞器中，降低產物對細胞的毒性，并減輕產物對酶的反饋抑制作用，從而增加次生代謝產物的產量。例如，Yamada等［78］在大腸桿菌中導入番荔枝堿生物合成途徑的基礎上，再轉入具有番荔枝堿轉運活性的擬南芥轉運蛋白AtDTX1發現，番荔枝堿的產量增加了11倍。通過模擬植物細胞水平的區室化，微生物的模塊化共培養工程將代謝途徑劃分成不同的模塊，在不同的細胞中表達，可以有效減輕細胞的代謝負擔，減少產物的反饋抑制，從而提高目標產物的產量。例如，Zhou等［79］通過大腸桿菌和釀酒酵母的共培養系統成功合成了氧化紫衫烷類物質，產量可達33 mg/L。

5 總結與展望

隨著多組學技術的快速發展，植物次生代謝產物的合成與調控研究取得了巨大進步，長春堿和諾斯卡品等一些重要天然藥物的生物合成途徑相繼得到解析。但是目前對于植物次生代謝的研究主要集中在途徑相關酶和轉錄因子的發掘和鑒定方面，對于大多數次生代謝途徑的關注和認知還停留在級聯的酶促反應階段。但是在植物中次生代謝途徑往往具有復雜的空間組織結構，代謝中間產物需要在不同區室之間進行運輸，這種空間分布會對次生代謝流的方向和大小產生重要影響。雖然對于次生代謝空間分布的研究還比較匱乏，但是隨著單細胞轉錄組、空間轉錄組和質譜成像等新技術的出現，為次生代謝空間分布研究提供了有力的工具。例如，本研究團隊利用單細胞轉錄組技術成功對長春堿生物合成的空間分布進行了研究，表明單細胞和空間多組學技術在研究次生代謝空間分布方面具有巨大的應用潛力。

植物次生代謝的區室化在植物中普遍存在，對其進行深入研究可以為代謝工程和合成生物學研究提供新的策略和思路。目前，已經有研究人員利用區室化策略，通過質體工程、轉運蛋白工程和共培養等方式，在原植物或微生物底盤中高效合成目標天然產物。但是區室化策略在合成生物學中的應用還有許多亟待探索的問題。例如，植物次生代謝產物轉運蛋白在微生物底盤系統中的亞細胞定位和轉運活性是否與植物中相同；如何構建非天然的代謝區室以提高代謝途徑的反應效率；在底盤系統中如何通過多個轉運蛋白的協同作用控制代謝流的大小和方向；以及如何通過多層次的區室化協同提高目標產物的產量等。