共附生菌對綠潮滸苔作用的研究進展及應用

畢芳玲 趙爽，2 栗斌 李愛芹 張建恒，3，4 何培民，3，4

（1. 上海海洋大學海洋生態與環境學院，上海 201306；2. 福建技術師范學院海洋學院，福建 350300；3. 上海海洋大學水產遺傳資源開發利用教育部重點實驗室，上海 201306；4. 水域環境生態上海高校工程研究中心，上海 201306）

大型海藻作為一種重要的海洋生物資源，能夠為海洋附生生物提供必要的生存條件［1］，在維持海洋生物多樣性方面具有不可替代的作用［2］。然而，某些大型海藻在特殊環境條件下的暴發性增殖會形成有害藻華（harmful algal blooms, HAB）。近年來，由于氣候變暖和水體富營養化程度的加重，綠潮等HAB在全球范圍內頻繁發生［3］，且發生頻率、災害程度和影響范圍均呈上升趨勢［4-6］。自2007年以來，我國黃海連續暴發滸苔綠潮，綠潮的最大覆蓋面積約為1 764 km2［7］，最大分布面積約為60 594 km2［8］，其中，最大分布面積約占黃海面積的八分之一［9］。綠潮連年暴發不僅影響海洋生態系統的穩定性，而且還給我國江蘇和山東沿海造成了較大的經濟損失［10-11］。

滸苔（Ulva prolifera）隸屬于石莼屬（Ulva）、石莼科（Ulvaceae）、石莼目（Ulvales）、綠藻綱（Chlorphyceae）、綠藻門（Chlorophyta）［12］，為廣溫性和廣鹽性大型綠藻，具有繁殖快、生長快和環境適應性強等特點［13］，廣泛分布于潮間帶和入海河口混合水域［14］，具有有性繁殖、無性繁殖、單性繁殖和營養繁殖等多種繁殖方式［15］，且微觀繁殖體具有較強的抗逆性［16］。特別是氣囊狀藻體，經自然、人為等外力使其脫落入海后，易漂浮在水面，在適宜的水溫和富營養化環境條件下迅速增殖，從而引發綠潮［17］。HAB的研究主要集中在藻體自身特征分析、形成機制、影響因素和致因藻種溯源等方面。然而，近年來的研究表明，有許多細菌群落參與海洋藻類的生長和消亡等過程，一些附生菌可以分泌促生長物質［18］、參與氮代謝和藻體營養物質的吸收與利用過程［19］，從而促進藻類增殖，成為某種藻類暴發的關鍵誘因之一［20］。藻類（尤其大型海藻）與共附生菌之間存在復雜的互作關系，附生菌可以促進或抑制藻類生長。因此，藻-菌共生關系日益引起科學家和學者的關注。

海洋細菌與藻類之間存在復雜而密切的關系。不同藻類具有特殊的“藻際”（phycosphere）微環境［21］。一些細菌長期生活在植物組織中，與宿主協同進化，它們被稱為內生菌（endophyte）［22］；另一些細菌附著于藻體表面，并與藻類保持動態的互作關系，被稱為藻體的外生菌（epiphyte）［23］。藻類與共附生菌之間存在密切的互利共生關系，藻類為細菌提供棲息地、氧氣、多糖和其他碳水化合物；同時，共附生菌為藻類提供激素、二氧化碳等，甚至在藻體形態建成、防御免疫、孢子釋放和萌發等過程中發揮關鍵作用［24-25］。因此，有研究指出共附生菌在滸苔綠潮暴發的過程中起著重要的促進作用［20］。滸苔藻體內外均具有豐富的微生物群落，這些微生物在滸苔形態建成和生長過程中發揮著重要作用［26］。

本文針對綠潮優勢種滸苔的共附生菌，從藻際微生物對滸苔的生理生態適應性的影響出發，闡述了其對滸苔的形態、生理以及綠潮暴發的影響和主要研究進展，旨在為黃海滸苔綠潮暴發機制的解析和防控策略的制定提供新思路。

1 滸苔共附生菌分離技術與多樣性分析

大型海藻中含有豐富的共附生菌群落，分離、獲得純培養微生物和研究海藻共附生菌群落結構的多樣性是了解藻類與共附生菌互作關系的前提。目前關于滸苔共附生菌的室內研究主要集中在利用培養基進行分離培養和研究菌株對藻的作用機理等方面，室外研究主要針對海區綠潮暴發期間的藻體與水域環境微生物多樣性進行分析［20］。隨著分子生物學技術的發展，藻類微生物的分離純化和多組學測序等研究方法不斷進步，不斷加深對藻類微生物的認識。

1.1 共附生菌分離技術建立

純培養物是研究微生物功能和機制的寶貴資源。早在1880年，Robert Koch首次采用平板法獲得單個菌落的炭疽菌（Bacillus anthraci），為細菌分類的初步研究奠定了基礎［27］。隨著藻類微生物學的發展，Selman Abraham Waksman于1934年從藻體中分離出純培養細菌［28］。長期以來，純培養菌株的獲得主要來源于平板分離法的不斷改進［29］。在純培養微生物分離法建立的初期，菌株分離技術主要是簡單的培養基培養法，包括玻璃珠振蕩稀釋平板涂布法和富集培養平板涂布法［30］。隨著分離培養技術的提高，進入21世紀，純培養微生物的分離獲取方法已經演變為機械研磨法［31］，采用不同介質研磨藻體，將混合菌液涂布固體培養基（如LB、2216E、R2A、CYTOPHAGA等），并連續分離，得到純培養菌株。目前，滸苔等大型海藻共附生菌的分離方法主要是研磨平板涂布法，即在無菌條件下，用無菌海水反復漂洗藻體，在冷凍離心機中加入2-3顆金屬研磨珠進行研磨處理，然后，再離心從上清液中獲得菌液，涂布于2216E等固體培養基上進行單一菌株的分離［32］。截至目前，對藻類微生物的研究集中在藻際微環境中共附生菌的統一分離和分析。

共附生菌分為內生菌和外生菌。其中，內生菌的概念最早由Henrich Anton de Bary提出，是指區別于附著在植物表面的外生菌，定殖在健康植物組織內部，并與宿主共生的微生物群落［33］。由于許多學者對這一概念有不同的看法，因此，植物內生菌尚無統一的定義。本文提出的滸苔等大型綠藻內生菌是指寄生于藻細胞內部的細菌群落。對內生菌的研究需要在徹底去除藻體表面附生細菌的基礎上才能實現，主要手段包括蝸牛酶（Snailase）、木瓜蛋白酶（Papain）等酶處理方法［34］，無水乙醇和UNSET緩沖液等化學方法［35］，以及機械研磨法［36］。雖然，已有報道的這些方法能在一定程度上去除藻體外生菌，但研究發現處理后的藻體存在部分細菌殘留和藻細胞被破壞等現象。Liu等［37］比較了體外去除藻體外生菌的各種方法，提出了在保持內生菌的同時最大限度地去除外生菌的最優方案：取0.03 g藻體，使用無菌海水多次漂洗，然后加入0.3 g無菌硅砂（125-250 μm），在3 200 r/min下渦旋處理30 min。這種硅砂渦旋法需要進一步改進和優化，目前仍然缺乏有效的實驗技術，可以將藻體內、外生菌群落完全分離。

1.2 共附生菌群落結構與多樣性分析

在大型海藻可培養微生物群落結構研究中，一般采用16S rDNA通用引物對分離獲得的單菌株進行PCR擴增和測序分析，16S rDNA序列因其既有保守區又有可變區，并且變異頻率緩慢而被廣泛應用。Singh等［23］和Alvarado等［38］通過PCR擴增與16S rDNA測序分析發現，石莼等大型海藻的共附生菌主要為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteriota）。Grueneberg等［39］從大型海藻硬石莼（U. rigida）的表面分離出50株變形菌門細菌、5株擬桿菌門（Bacteroidetes）細菌和1株厚壁菌門細菌。此外，劉杰等［5］從2008年青島沿岸暴發的綠潮滸苔共附生菌中分離鑒定出18株細菌，分屬于厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門。其中，變形菌門中的α-變形菌綱和γ-變形菌綱的菌株最為豐富。同樣，金柘［32］也分離出了16個屬的滸苔共附生菌，并發現變形菌門的玫瑰桿菌科（Rhodobacteraceae）細菌占絕大多數。

除了研究海藻中可培養細菌的種類外，還可以通過提取海藻相關共附生菌來研究藻類或海洋細菌在特定條件下的生理生化特性。其中，高通量技術被廣泛應用于滸苔等藻類共附生菌群落結構和功能的分析。Zhao等［40］利用高通量測序技術，研究了青島近岸海域綠潮暴發過程中海洋細菌和古生菌群落的變化。研究發現，在綠潮暴發和消亡過程中，黃桿菌目（Flavobacteriales）、紅桿菌目（Rhodobacterales）和海洋古菌（marine group II,MGII）菌群占優勢。武洪慶等［31］對采自浙江舟山和象山的滸苔共附生菌群落結構進行研究發現，只有假單胞菌（Pseudomonas）是兩地樣品共有的菌屬。蘇秀榕等［41］研究在浙江象山和朱家尖地采集的13種海藻共附生菌時也發現了微生物群落結構的多樣性。大多數證據表明，在溫度、潮間帶等不同環境條件下，海藻的微生物群落結構具有多樣性和特殊性［42］。因此，從滸苔等藻類共附生菌的優勢菌群變化和群落結構差異的角度，有望實現對海洋酸化和生態環境問題的動態監測。

大型海藻表面附生菌的群落結構在物種水平上表現出明顯的特異性［43］。99%以上的海洋細菌無法培養和鑒定［44］，但隨著不依賴于分離培養的宏基因組DNA序列分析技術的發展，許多“未培養”的微生物物種信息被揭示出來［45］。Tyson等［46］利用酸性礦山排水生物膜的宏基因組數據，通過改良培養基提高微生物的可培養性，成功分離出一株參與固氮的鉤端螺旋菌（Leptospirillum）。Li等［47］將培養組學和宏基因組學結合，擴展了高質量宏基因組組裝基因組（high-quality metagenome-assembled genomes, hqMAGs），為全面了解沙漠單個微生物基因譜系和功能奠定了基礎。這種基于培養組學的宏基因組學（culturomics-based metagenomics, CBM），為進一步挖掘和探究未知微生物群落樣本提供了新的視角。此外，微生物群落結構的研究還涉及克隆文庫、DNA指紋圖譜、熒光原位雜交等分子生物學技術。目前，對滸苔共附生菌的宏基因組研究主要集中在綠潮暴發期間調查該海域滸苔共附生菌的群落變化，而CBM的應用以及結合代謝網絡和多組學分析對菌株作用機制的研究還比較少。

2 共附生菌對綠潮滸苔的作用

綠潮遷移會對相關藻類的生物量和覆蓋度產生顯著影響，進而導致其光合色素含量、氣囊結構和分枝結構等生理生態特征發生改變［48］。由于某些細菌可以為藻類提供礦質元素［49］，釋放促進藻類生長和形態建成的因子［50］，藻類學家普遍認為綠潮的遷移和暴發與細菌群落結構的變化密切相關［20］。目前的研究結果證實，滸苔共附生菌不僅可以參與藻類的生理活動，還可以在一定程度上促進綠潮的暴發。

2.1 共附生菌對滸苔形態建成的影響

共附生菌對滸苔等大型綠藻的形態建成具有積極作用［51］。一些大型藻類在缺少天然藻際微生物的情況下，并沒有發育成正常形態。Provasoli和Pintner［52］研究發現，在無菌培養條件下滸苔屬幼苗生長異常，發育成細長的管狀藻。石莼目的尖種礁膜（Monostroma oxyspermum）在自然環境條件下呈葉狀，而在無菌條件下，其形態變為松散的細胞團［53］。這一現象表明，石莼等大型海藻獨特的形態結構與海洋細菌的定殖密切相關。目前，關于大型海藻共附生菌對藻類形態影響的研究主要分為兩個方面。

2.1.1 無菌滸苔的培養 由于藻類對抗生素敏感［54］，大多數的無菌石莼是通過抗生素共培養獲得的（表1）。在無菌滸苔的培養中，Chen等［55］利用含有0.1 g/L青霉素G、0.1 g/L硫酸新霉素和0.03 g/L多黏菌素B的混合抗生素培養液獲得了無菌滸苔；王瑜［56］、金柘［32］等聯用含有青霉素G、氯霉素、諾氟沙星、鏈霉素和卡那霉素的培養液對滸苔孢子進行培養，成功構建了滸苔的愈傷組織。Spoerner等［60］在易變石莼（U. mutabilis）生殖細胞的無菌培養中也發現了這種類愈傷組織表型。該類愈傷組織是由細胞壁異常和未分化細胞組成的細胞團［26,61］。無菌培養方法的發展和完善無疑為進一步研究共附生菌對藻體形態建成和生長發育的影響奠定了重要基礎。

表1 不同石莼屬綠藻的無菌培養方法Table 1 Different aseptic culture methods of Ulva sp. green algae

2.1.2 純培養菌株對無菌藻體形態的影響 健康滸苔形態發育的定性特征是藻體長度正常、無細胞壁突起和有分化的假根［60］。有研究發現，在去除一些特殊細菌的情況下，滸苔會發育成類愈傷組織形態（圖1），但隨著必要共附生菌的加入，其整個形態可以恢復正常［62］，這種現象也存在于幾種大型海藻中，如緣管滸苔和扁滸苔（U. compressa）［58,63］。大量與宿主形態發育有關的共附生菌附著在石莼科海藻表面［64］。Matsuo等［57］研究發現，由噬纖維菌屬（Cytophaga）、黃桿菌屬（Flavobacter）、擬桿菌屬（Bacteroides）細菌組成的CFB細菌復合體，是參與石莼屬綠藻形態建成的重要功能類群。此外，有研究表明，達到一定數量級（108-109個/mL）的玫瑰桿菌科、黃桿菌科、芽孢桿菌科細菌在誘導滸苔愈傷組織形態建成中發揮關鍵作用［32］。對其他石莼屬藻類共附生菌研究，成功建立了U. mutabilis的三方共生關系，篩選出的菌株玫瑰桿菌（Roseobacter sp. MS2）和噬纖維菌（Cytophaga sp. MS6）可以協同促進藻體形態的恢復［60］。細菌衍生質可以控制藻類的假根、細胞壁和葉狀體的發育［57］。迄今為止，由海桿菌（Maribacter spp.）釋放的細菌半萜烯類化合物Thallusin是唯一已知并分離出的形態發育促進因子［65］。

圖1 無菌滸苔（a）和正常滸苔形態（b）Fig. 1 Morphology of sterile U. prolifera（a）and normal U. prolifera（b）

由于藻際微生物的特異性，劉曉杰等［63］推測，漂浮滸苔可能具有特殊的共附生菌群落結構和與形態建成相關的CFB菌群，使滸苔形成適應漂浮生活的藻體形態，從而擁有更快的生長發育速率。這可能是黃海綠潮（yellow sea green tide, YSGT）漂浮滸苔形成的原因之一［66］。可見，深入研究滸苔共附生菌的特性和作用機制，對于黃海綠潮的遺傳溯源和暴發機制研究具有重要意義。

2.2 共附生菌對滸苔生長的影響

藻際微生物具有多樣的代謝類型，積極參與藻類的正常生長發育。研究證實，細菌可以為藻類提供無機氮、鐵、無機磷等無機營養物質，并產生維生素、細胞分裂素和生長素等植物激素［67-68］，從而促進植物生長。Grueneberg等［39］發現副球菌（Paracoccus sp.）和溶解噬纖維菌（Cellulophaga lytica）可以單獨誘導石莼屬海藻愈傷組織的細胞分裂。王瑜［56］篩選出4株菌，E68（Roseobacter sp.SYOP1）、E69隱藻海生菌（Marivita cryptomonadis）、E104芽孢桿菌（Bacillus sp.）和E110（Maribacter aestuarii），可顯著提高滸苔愈傷組織的相對生長率，在藻類的轉錄組學分析中發現，誘導組中存在許多與生長發育相關基因的富集，如硝酸鹽轉運蛋白和丙酮酸激酶等。E110組也存在特有的差異基因顯著富集，如光合膜（photosynthetic membrane）條目的KHCA5等光系統I/II反應中心亞基基因和葉綠素a/b結合蛋白基因。這些基因表達蛋白可以捕獲到光系統的激發能，增強藻類的光合能力［69］，使滸苔在綠潮暴發過程中更具競爭力。

此外，有研究發現，由于滸苔綠潮暴發后期藻體生物量增加，導致海區營養鹽匱乏［70］，共附生菌可通過生物固氮作用補充藻類生長的氮源，使滸苔在寡營養環境中仍保持生長［71］和優勢地位，導致綠潮持續時間延長［72］。這與梅香遠［73］提出的“共附生菌可能有助于漂浮滸苔在不同營養環境中的氮轉運”的猜想一致。這一發現表明，滸苔共附生菌能夠促進綠潮的大規模暴發，也進一步證實了當前水體富營養化等環境因素是滸苔綠潮暴發的重要原因。

共附生菌的促生作用在其他植物上也有報道。鄒迪［74］研究發現，附生假單胞菌可以促進銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的生長，將不易被微囊藻直接吸收的磷形態轉化為磷酸鹽等物質供銅綠微囊藻利用。壇紫菜（Pyropia haitanensis）在不同生長發育階段的微生物群落結構會發生顯著變化，與無孢子囊階段相比，孢子囊階段的培養基中檢測到豐富的厚壁菌門細菌［75］。芽孢桿菌具有產芽孢、快速繁殖、高耐受性等特點，它能產生吲哚-3-乙酸刺激植物幼苗伸長生長［76］，分泌或誘導生長激素、酶、抗菌蛋白等［77］，增強植物生長和光合作用、改善水體微生態環境［78］。假單胞菌門（Pseudomon-adota）的根瘤科（Rhizobiaceae）微生物對微藻和植物具有促進生長和益生的特性［79］。一些細菌可以產生特定的胞內磷脂或胞外糖肽等有機物質，如黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）可釋放有機酸，促進微藻生長［80］。

海藻共附生菌對藻類生長的作用表現在促進和抑制兩個方面，這種作用會因不同的環境或藻類的不同生長階段而發生改變［23］。細菌對藻類的抑制作用表現在以下3個方面：（1）分泌對藻類有抑制作用的生物堿［81］、抗生素［82］、靈菌紅素（C20H25N3O）［83］等胞外活性物質，抑制葉綠素a等光合色素的合成或一系列光合作用相關基因的表達，破壞藻細胞的抗氧化系統和細胞結構等［84］；（2）與藻類競爭營養物質，如不動桿菌（Acinetobacter sp.）具有很強的脫氮除磷能力［85］，能夠引起水體中無機營養鹽的缺乏；（3）生物菌膜的形成抑制了藻類的光合作用。有些細菌甚至具有溶藻作用，如嗜纖維菌，可以在一定程度上殺滅硅藻（diatom）和半溝藻（Raphidophyte）的藻細胞［86］。此外，芽孢桿菌、鏈霉菌（Streptomyces spp.）和假單胞菌是當前報道數量最多的溶藻細菌，具有廣譜溶藻能力［87］。目前，滸苔的溶藻細菌種類鮮有報道，因此探尋滸苔潛在溶藻細菌種類，可能是綠潮防控的新方向。

2.3 共附生菌對滸苔繁殖的影響

滸苔共附生菌除了影響藻體的生長和形態建成外，還影響游動孢子的定殖。滸苔的游動孢子可能能夠響應細菌的化學信號，增強滸苔孢子沉降能力。Joint等［88］發現附著基上微生物的數量與滸苔游孢子附著的數量呈正相關。Patel等［89］研究了游動孢子的定殖與微生物膜中特定細菌的相關性，結果表明，從滸苔表面和附近巖石生物膜中分離的37種細菌對滸苔游孢子的定殖具有特異性，大多數弧菌屬（Vibrio）和希瓦氏菌屬（Shewanella）細菌能夠促進滸苔游孢子的定殖，而假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）細菌則具有抑制作用。此外，李孟珂等［90］也證實了銅綠微囊藻的共附生菌鞘氨醇單胞菌（Sphingopyxis solisilvae）L-9-3對藻細胞具有顯著的增殖作用。

共附生菌對藻類繁殖具有有益作用，已有研究表明藻類附生菌可以促進孢子的定殖，但其能否促進藻體的放散還有待進一步研究。由于漂浮滸苔具有營養生殖、無性生殖、有性生殖等多樣的繁殖方式［15］，其孢子萌發形成的藻體生長快、光合能力強，而營養繁殖形成的藻體對光照強度的適應性更強［91］。在適宜環境的條件下，滸苔釋放出的大量孢子和配子一旦萌發，將導致滸苔生物量的迅速增殖［92］，這一過程可能存在眾多共附生菌參與。因此，共附生菌對滸苔迅速增殖的作用機理有待深入研究，這一研究有望為綠潮監測提供新思路。

2.4 共附生菌對滸苔抗逆能力的影響

在潮間帶，滸苔的不同生長階段不可避免地遭受水分流失、高溫和輻射等不良環境因素的影響。在此期間，滸苔的共附生菌很可能在提高藻類的抗逆性方面起到積極作用。周新倩等［93］對浙江近岸海域滸苔外生菌的Shannon-Wiener多樣性指數進行分析發現，隨著水溫的升高，滸苔外生菌和水體微生物的多樣性指數均逐漸升高，細菌群落結構多樣性不同的微生物主要為不動桿菌（acinetobacter sp.）、假單胞菌、弧菌、假交替單胞菌和舍氏小螺菌（Mucispirillum schaedleri）。楊華田等［94］在研究芽孢桿菌對高溫下壇紫菜生長和生理的影響時發現，在高溫脅迫下，藻菌共培養組的相對生長率（RGR）、抗氧化酶活性和丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平顯著高于對照組。高溫脅迫可以增強藻類的氧化應激反應，抗氧化酶和熱休克蛋白（heat shock protein, HSP）是藻類抵御逆境脅迫的重要蛋白［95］，當藻類受到高溫脅迫時，HSP會維持蛋白質的功能結構，參與變性蛋白質的復性和降解［96］。

目前，對鹽脅迫響應機制的認識主要集中在膜的離子轉運、抗滲透物質的積累、抗氧化功能的提高等方面［97］。黃桿菌（Jatrophihabitans）、微桿菌（Microbacterium）、假單胞菌和紅球菌（Rhodococcus）等能夠增強萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的耐鹽性［98］。周璇［99］初步探索了高鹽脅迫下細菌調控微藻耐鹽性的分子機制發現，在高鹽脅迫下，與單獨培養的衣藻耐鹽基因表達量相比，藻菌共培養組的光系統II 捕光復合體（LHC II）基因Plhc 表達量增加，與細菌互作后，實驗組的衣藻活細胞數、葉綠素含量和光系統II最大光化學效率提高，說明菌株的加入緩解了高鹽條件下光合作用的抑制。

在非生物脅迫下，滸苔會產生包括脯氨酸（poline）、甜菜堿（betaine）、可溶性多糖（soluble polysaccharide）、多元醇（polyalcohol）等在內的代謝產物來調節藻類細胞滲透壓［100］；同時，LEA蛋白、H+- ATPase和水通道蛋白（aquaporin）等會通過逆向轉運來抵抗逆境脅迫［96］。由于滸苔外生菌在不同環境中的特異性和多樣性，多組學分析可以揭示藻類和細菌在不同環境脅迫下的調控機制。因此，從分子角度研究共附生菌如何協助藻類應對環境脅迫具有重要意義。目前國內外關于滸苔與共附生菌共培養的研究較少，尤其是從分子生物學角度進行的研究更少。未來，在研究滸苔抗逆性的轉錄組分析時，可以重點分析脯氨酸、HSP、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化物酶（peroxidase,POD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）、抗壞血酸（ascorbic acid）、丙二醛、谷氧還蛋白（glutaredoxin）、Raf類蛋白激酶（Raf-like protein kinases, RAFs）、滲透壓調節蛋白和抗氧化系統與非生物脅迫表達相關的基因等方面。

3 滸苔重要共附生菌的應用價值

滸苔資源豐富，是一種非常經濟的海洋生物資源。隨著對滸苔共附生菌多樣性研究的深入，發揮重要作用的功能菌株逐漸成為研究熱點。從共附生菌的研究中可以實現滸苔藻體的有效降解與利用，既可以緩解海洋生態環境壓力，維持海洋漁業和旅游業正常發展，也可以作為可再生資源應用于農業、畜牧業和能源工業，具有廣闊的利用價值和應用前景。

朱镕杰［101］利用轉基因克隆技術，從滸苔共附生菌-假交替單胞菌中，獲得了國內外可用于植物抗寒基因工程的抗寒基因。據報道，假交替單胞菌還能分泌淀粉酶等多種水解酶，能有效降解滸苔的大分子多糖和細胞壁，甚至在3 d內降解率可達68.10%［102］。此研究為滸苔的高效環保降解提供了新的思路，但其內在機理和相關技術仍需進一步探究。目前，已挖掘的滸苔纖維素降解酶可作為新型藻類開發的工具酶，通過對滸苔纖維素的高效降解，可以實現對滸苔生物質能源的資源化開發利用。

海洋大型綠藻具有豐富的營養價值，是硫酸多糖的主要來源，其中石莼膠（ulvan）是綠藻中一種重要的水溶性硫酸多糖，包含鼠李糖、葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸等［103］，具有生物降解性、靶向性、抗炎、增強免疫和抗凝血等多種有益的生理活性［104］，具有較大的藥物開發潛力。顧鐵基［105］從滸苔外生菌太平洋居海膽桿菌（Echinicola pacifica）HT-3的基因組數據中發現，了PL37家族的多糖特異性裂解酶（HT-34）基因，為進一步研究PL37家族滸苔多糖裂解酶的蛋白結構、催化機制及應用奠定了基礎。陳冉［36］和耿玉慧［106］也從滸苔中篩出能分泌滸苔多糖降解酶的菌株，并獲得了一種可高效降解滸苔多糖的酶（U-3282），該酶對滸苔多糖的酶比活力可達10 000 U/mg以上，顯著高于之前報道的19.32和22.86 U/mg［107］。此外，有學者通過超濾、硫酸銨沉淀、離子交換色譜法和分子篩高壓液相色譜等方法，從滸苔中篩選出具有抗腫瘤活性的菌株Y15-8和HT15-8［108］。此研究具有廣闊的應用前景，為抗腫瘤藥物先導化合物的研究提供了重要的理論依據。

4 總結與展望

近年來，黃海綠潮等有害藻華頻繁發生，對我國乃至全球沿海城市造成了巨大的影響。綠潮的遷移與暴發，除了與藻體自身獨特的生物學特性和適宜的海域環境有關外，也和藻際微生物的參與密不可分。目前，關于有害藻華的研究報道，主要包括藻化的形成機制、影響因素、致因藻種溯源和生物學特性分析等方面。藻華的發生和海藻共附生菌密切相關，附生菌分泌的促生長物質，參與了藻類的氮代謝和營養物質的吸收與利用過程，加速了藻類的增殖。此外，藻際微生物也參與了藻類的生長和消亡等過程。因此，藻華是多種因素共同作用的結果。

滸苔共附生菌具有豐富的多樣性，它們的純培養是研究菌株功能和開發利用的前提，分離技術的建立和改進是關鍵。目前，16S rDNA和高通量測序技術被廣泛用于滸苔等大型海藻微生物群落結構和多樣性研究。隨著現代科學技術的發展，多種技術的綜合運用，將為滸苔共附生菌的分離培養和功能分析提供新思路。滸苔共附生菌主要對藻體的形態發生、繁殖和抗逆性等生長過程發揮作用。此外，滸苔共附生菌具有重要的潛在應用價值，從滸苔共附生菌-假交替單胞菌中分離出抗凍基因、多糖和纖維素水解酶，以及篩選出的具有抗腫瘤活性的菌株，均具有可觀的開發應用前景。

總之，目前對滸苔共附生菌的研究還處于探索階段。未來，為了進一步研究滸苔共附生菌群落結構的多樣性，需要不斷改進分離純化技術以獲得更多的純培養功能菌株。同時需要開發有效的內、外生菌分離技術，以便更精確地研究共附生菌與滸苔的互利共生關系。今后，不僅要研究單一共附生菌對藻類生長和形態的影響，而且還要研究混合菌株和不同細菌群落對滸苔生物學特性的影響，并剖析其中的分子機制。基于這些研究成果進一步開發出功能菌株或菌群，將其應用于經濟海藻養殖等領域，助力生態、綠色和高產的經濟海藻養殖業發展。此外，從微生物視角對藻華進行研究，不僅有利于實現對綠潮的精準預測和防控，也有利于滸苔的資源化利用。