三種主要真菌毒素及其毒素降解酶的研究進展

向霞 朱恩恒 韓楠玉，

（1. 云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；2. 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，昆明 650500）

真菌毒素是由來自青霉屬、曲霉屬和鐮刀菌屬的真菌在谷物的生長、收獲、儲存和加工等過程中產生的有毒次級代謝物［1-2］。據報道，已發現來自100多種真菌產生的400多種真菌毒素會對人和畜禽的健康造成不同程度的影響［3］。真菌毒素對畜禽和人類的威脅主要包括三個方面：（1）受真菌毒素污染飼料喂養的動物會出現多種問題，如生產性能變差、繁殖率降低、免疫抑制、組織器官損傷和病變等［4-5］；（2）在嚴重的情況下，動物會面臨致癌、致畸甚至死亡的風險，同時，受真菌毒素污染的飼料會降低或完全失去營養和飼用價值，導致農戶經濟的巨大損失［6］；（3）人類食用含有霉菌毒素殘留的農產品會對健康產生不良影響［3］。

全球動物生產中，飼料谷物中真菌毒素污染作為一個經濟問題一直受到各國的重視。聯合國糧食及農業組織的研究表明，全球超過25%的糧食作物受到真菌毒素污染［7-8］。我國飼料中普遍存在真菌毒素污染問題，其中以黃曲霉毒素（aflatoxins,AFs）、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素，deoxynivalenol, DON）最為嚴重［9］。針對這種情況，我國在2017年《飼料衛生標準》中新增了對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及嘔吐毒素在“泌乳期精料補充料” “犢牛、羔羊精料補充料”及其他精料補充料的限制含量［10］。然而，這三種毒素在飼料中共存率較高，并且共存具有疊加毒性［11-13］，即使每種真菌毒素的含量都未超標，疊加的毒性累積仍會對人畜產生極大危害。因此，有必要采用脫毒或解毒等方法處理飼料中的這三種真菌毒素。本文詳細闡述了黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素這三種毒素的分子構象、危害機制、降解途徑以及相關的毒素降解酶。這些內容為保護畜禽健康、確保飼料安全以及應用酶法降解真菌毒素提供了參考素材。

1 真菌毒素分子構象及危害機制

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素（aflatoxins, AFs）是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等霉菌產生的一類化學結構相似的雙呋喃香豆素衍生物［14］。已知約20種AFs衍生物，包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1等（圖1）。其中，AFB1毒性最強而被歸類為一級致癌物［15-16］。AFM1被列為二級致癌物［17］。Matumba等［18］研究發現，玉米和花生中黃曲霉毒素G1含量通常與B1黃曲霉毒素相等或更高。

圖1 AFs毒素衍生物Fig. 1 AFs toxin derivatives

AFB1是AFs中強毒成分。食用超標食物或飼料會損害肝臟，甚至導致肝癌。隨著AFB1濃度增加超過10 μmol/L時，會加速細胞氧化，引發DNA損傷、染色體異常分裂及細胞凋亡［19］。AFB1代謝成AFB1-8,9-環氧化物會與肝細胞DNA分子結合進而導致肝癌［20］。人類和哺乳動物攝入過量AFB1，肝臟部分羥基化形成致毒的四羥基化代謝物（AFM1）積累在母乳中，在哺乳過程中危害幼體［21-22］。

1.2 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）是真菌毒素中的一種有機化合物，主要由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、枯草鐮刀菌（F. culmorum）等所產的類雌激素樣真菌毒素（圖2-A）［23-24］。

圖2 ZEN（A）和DON（B）結構圖Fig. 2 ZEN (A) and DON (B) structure diagram

研究表明，ZEN會干擾細胞的早期分化過程［25］，對畜禽的生殖功能造成不良影響。其主要通過擾亂睪丸間質細胞（LCs）的合成和影響睪酮的分泌，其作用機制包括以下幾個方面：（1）干擾LCs的功能，降低睪酮水平，從而對生殖能力產生不良影響［26］；（2）激活Wnt/β-catenin信號通路：ZEN能夠通過上調WNT1和β-catenin的表達來激活Wnt/βcatenin信號通路，促進豬子宮內膜上皮細胞的增殖和發育，導致豬的子宮肥大和生殖障礙［27］。

1.3 嘔吐毒素

嘔吐毒素（deoxynivalenol, DON）是一種水溶性三烯真菌毒素，主要由鐮刀菌屬（Fusarium）中的禾谷鐮刀菌（F. graminearum）和黃色鐮刀菌（F.culmorum）產生。它能夠污染玉米、大麥、小麥、大米和其他谷物農產品（圖2-B）。

DON因其會引起動物嘔吐的特性而得名。動物食用被DON污染的飼料會出現嘔吐、食欲下降等癥狀。大量研究表明，長期暴露于高濃度的DON可能導致動物免疫抑制、生長發育受損、生殖問題和器官損害等健康問題； 并且DON具有致癌、致畸和致突變作用［28］。其通過影響轉錄、翻譯和細胞凋亡等過程，引發細胞功能異常和損傷，導致畜禽嘔吐增加其死亡率，因此，世界衛生組織和聯合國糧食農業組織將嘔吐毒素列為最危險的自然污染物之一。研究表明，在豬的小腸細胞中，DON促進與炎癥和細胞凋零相關的基因表達，產生活性氧對細胞造成損傷［29-30］。

2 真菌毒素降解途徑

除了化學或物理方法去除毒素外，生物酶解法具有環保、高效降解毒素的特點，被認為是減少真菌毒素積累最有希望的方法［31］。除了文獻中介紹的能夠降解真菌毒素的酶，本文還利用計算方法對從PDB（protein data bank, https://www.rcsb.org）數據庫中下載的蛋白結構和從Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中下載的霉菌毒素小分子結構進行了分析。使用AutoDock Tools［32］和AutoDock vina［33］軟件將毒素分子與蛋白進行對接，并使用Discovery Studio Visualizer和Pymol（Schrodinger, LLC 4.60）［34］軟件進行可視化分析。然而，對于一些蛋白在PDB數據庫中沒有共結晶結構的情況，無法參照其活性口袋進行對接分析，對于這部分結構，進一步利用Proteins Plus［35］進行后續分析。

結合實驗和計算方法，可以更深入地了解到酶對真菌毒素的降解機制，并為開發具有高效降解能力的生物轉化方法提供理論指導。這種綜合的研究方法有助于挖掘和優化潛在的酶類分子，為毒素降解提供新的解決方案，并為畜禽的健康和飼料安全作貢獻。

2.1 物理和化學途徑降解真菌毒素

黃曲霉毒素結合劑Toxeat?被證明能夠改善肉雞腸道菌群，降低大腸桿菌數量，并顯著提高乳酸菌數量，同時，它還能提高腸道的吸收能力，對肉雞的功能指標、免疫反應、腸道菌群和腸道形態產生顯著良好影響［36］。研究還發現，硒是一種有效的抗氧化劑。添加有機和無機硒元素到動物飼料中已被證明可以降低AFB1的毒性，并預防黃曲霉毒素引起的氧化性肝損傷，同時還能抑制促凋亡蛋白的表達［37］。此外，姜黃素具有強大的抗氧化性，在含有AFB1的飼料中添加0.2%的姜黃素或0.3%的纖維類高蛋白能夠顯著減輕AFB1對家禽生殖、發育造成的不良影響，并對家禽的肝臟起到保護作用［38］。另外，普通的物理吸附劑MIL-101（Fe）具有較高的吸附能力，其對AFB1的飽和負載能力為30.58 mg/g。而經過優化的TMCS-MIL101（Fe）則具有更好的疏水性，相比普通MIL-101（Fe）對AFB1的吸附性提高了25%以上［39］，這些吸附劑在降低飼料中AFB1的毒性方面具有一定的應用價值。

DON及其乙酰化衍生物3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3A-DON）和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15A-DON）是鐮刀菌污染谷物產生的高毒性真菌毒素［40-42］。這些化合物的主要毒性結構是C3位羥基和C16位甲基。通過對C3位羥基進行乙酰化、異構化、糖基化以及氧化，以及對C16位羥基化，可生成不同類型的 DON 衍生物，從而減輕其毒性［43-44］。例如，C3糖基化可產生3-葡萄糖苷-DON；乙酰化可生成3-乙酰-DON，C16位羥基化可產生16-羥基DON，圖3展示了DON的代謝途徑和降解產物［45］。

圖3 DON代謝途徑及降解產物Fig. 3 DON metabolic pathway and degradation products

除了糖基化、乙酰化等降解途徑外，長鏈n-3多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸也具有降低DON對腸道細胞損傷并具有增強腸道屏障的功能。這些脂肪酸通過抑制caspase-3和caspase-8蛋白的表達來發揮其防護效果［29,46］。

2.2 生物法降解毒素

2.2.1 微生物法降解真菌毒素 傳統的物理化學策略通過使用紫外線照射、添加酸、堿、氧化劑和醛等方法來改變真菌毒素的結構，以期降解真菌毒素。然而，這些方法會對糧食的營養等方面造成不同程度的影響，并引起公眾對食品和飼料中化學殘留物含量的擔憂。與傳統方法相比，生物酶解法具有特異性，能夠產生無害的降解產物，甚至能夠在特定條件下完全降解真菌毒素，因此在降解真菌毒素的研究中廣受青睞［47］。生物酶解法是利用微生物發酵產生的酶來降解真菌毒素，具有脫毒效率高、特異性強、無二次污染等優勢。例如，遲緩芽孢桿菌作為添加劑添加在飼料中，通過發酵作用能夠高效降解真菌毒素ZEN和DON，其降解率分別為79.59%和46.93%［48］。此外，乳酸桿菌和釀酒酵母菌株組成的益生菌降解真菌毒素也顯現出了很大潛力。研究表明，乳酸桿菌和釀酒酵母在6 h內就顯著降低了真菌毒素AFB1、DON和ZEN的濃度，因此可以作為食品和飼料添加劑來去除毒素［49］。這些微生物降解真菌毒素的研究為開發高效、可行的生物降解方法提供了有益的參考。

綜上所述，生物酶解法不僅能夠有效降解毒素，而且能夠產生無害的降解產物，具有良好的應用前景。隨著對微生物降解機制的深入研究，需要進一步優化和開發生物降解方法，為食品安全和畜禽養殖提供更可靠的保障。

2.2.2 酶法降解真菌毒素

2.2.2.1 降解AFs的相關酶 用于脫除AFB1的菌株有芽孢桿菌、假單胞菌、乳酸菌、非產毒曲霉等，可采用單菌種發酵、多菌種協同發酵和菌酶協同作用脫除AFB1，枯草芽孢桿菌WTX1的胞外酶Ea可作用于AFB1的呋喃環雙鍵、香蘭素內脂環、戊烯酮環以達到降解AFB1的效果，該酶在50℃，pH 5的條件下，對AFB1的降解率高達88.4%［50］。黃曲霉毒素氧化酶（AFO）能夠作用于AFB1雙呋喃環上的烯醚鍵，是首次發現能夠完全降解AFB1的酶（圖4）［51］。

圖4 AFB1的主要代謝途徑Fig. 4 Main metabolic pathways of AFB1

為了進一步研究AFO與AFB1的相互作用，通過數據庫下載AFO的結晶結構（PDB ID: 5yfd）以及AFB1的三維結構（PubChem CID: 186907）。使用AFO的復合物結晶結構作為參考，通過分子對接方法，利用AutoDock和AutoDock Vina軟件進行了AFO和AFB1的對接，并選擇了最優模型進行進一步分析。最終的結果通過Discovery Studio Visualizer和Pymol進行可視化展示，見表1和圖5。

表1 黃曲霉毒素氧化酶與小分子對接最優模型結果Table 1 Results of optimal model of aflatoxin oxidase docking with small molecules

圖5 黃曲霉毒素氧化酶與AFB1形成的相互作用Fig. 5 Interaction formed between aflatoxin oxidase and AFB1 formation

分子對接結果顯示黃曲霉毒素氧化酶與AFB1之間存在氫鍵、π-烷基、范德華力等相互作用。AFB1和黃曲霉毒素氧化酶的D489殘基之間存在氫鍵相互作用，而氨基酸殘基Y313、N389、H448、P488、和E500與AFB1的五元環則形成π-烷基的分子間作用力。這些相互作用力的存在能夠穩定蛋白與小分子之間的結合，為進一步降解毒素提供了有益條件。以上研究結果揭示了黃曲霉毒素氧化酶與AFB1之間的相互作用機制，為深入理解AFB1的降解過程以及開發有效的生物降解法提供了重要的信息。

2.2.2.2 降解ZEN的相關酶 魯氏不動桿菌（Acinetobacter lwoffii）菌株的胞外酶對ZEN的降解率高達82.31%［52］。此外，研究人員采用鹽沉淀和柱層析相結合的方法，從真菌中純化出一種具有解毒能力的堿性水解酶，純化出的酶為同源二聚體，亞單位分子量為30 kD，并含有亞單位內的二硫鍵。根據純化蛋白的內部肽序列，克隆了該酶的整個編碼區并將其命名為zhd101［53］。內酯水解酶zhd101顯示出高效降解ZEN的能力，可用于易受ZEN侵染的重要谷物，如小麥和玉米污染（圖6）［54-55］。

圖6 ZHD101水解ZEN的降解產物Fig. 6 Degraded product of ZHD101 hydrolyzing ZEN

利用蛋白數據庫PDB下載內酯水解酶zhd101的3D結構（ID: 5XMW），并從Pubchem獲取了真菌毒素ZEN（CID: 5281576）的3D結構。隨后，使用Proteins Plus對zhd101進行了活性口袋預測，并獲得了預測及計算結果，具體數據可見圖7和表2。為了進一步研究酶與小分子的相互作用，我們從計算結果中選取了與小分子結合的最優模型，并進行了后續分析。

表2 玉米赤酶烯酮降解酶與ZEN對接最優模型結果Table 2 Optimal model results for maize erythrene ketone degradation enzyme docking with ZEN

圖7 玉米赤霉烯酮降解酶活性口袋位置預測結果Fig. 7 Prediction of the position of the active pocket of zearalenone degradation enzyme

通過將蛋白與小分子結合的最優結果進行可視化，得到了圖8所示的結果。在這個模型中，毒素小分子ZEN與zhd101的H242形成了氫鍵，這一相互作用以綠色虛線在Discovery Studio Visualizer中表示，在Pymol中以黃色虛線呈現。除了氫鍵之外，ZEN降解酶和蛋白之間還存在Pi-烷基、范德華力等作用力。特別值得注意的是，氨基酸殘基L132、V158、F221和H242能夠穩定蛋白與小分子之間的相互作用。其將毒素牢固地耦合在蛋白的催化口袋中，為真菌毒素降解酶能夠有效降解毒素小分子發揮了關鍵性的作用。

圖8 內酯水解酶zhd101與ZEN形成的相互作用，參與底物結合的氨基酸顯示為棒狀Fig. 8 Interaction formed by lactone hydrolase zhd101 and ZEN, and the amino acids involved in substrate binding are shown as rods

上述研究揭示了內酯水解酶zhd101與真菌毒素ZEN之間的相互作用機制。這些相互作用力，如氫鍵、Pi-烷基和范德華力等，促使ZEN與酶發生結合，并將其穩定地固定在催化口袋中，為降解真菌毒素提供了重要的貢獻。這一發現有助于深入了解真菌毒素降解酶的工作原理，為開發更有效的毒素解毒方法提供思路。

2.2.2.3 降解DON的相關酶 從德沃斯氏菌屬（Devosia mutans）分離出的兩種蛋白酶DepA和DepB被發現可以降解DON。DepA能將DON轉化為3-酮基-DON，而DepB則進一步將3-酮基-DON轉化為3-異構化-DON（圖9）［56］。

圖9 DepA和DepB降解DON機制Fig. 9 Mechanism of DepA and DepB degrading DON

此外，來自陸地棉（Gossypium hirsutum）的特異乙醛化酶（SPG）也展現出異構化能力，其使3A-DON的C8羰基轉移到C7，并將雙鍵從C9-C10轉移到C8-C9，因此，降低了DON的毒性。研究還發現，SPG的活性中心可以對15A-DON和DON起降解作用，其作用機制與3A-DON的異構化機制相同（圖10）［57］。

在DON衍生物與SPG結合時，DON衍生物的C7羥基和C8羰基部分取代兩個水分子以配位金屬離子。隨后，E167從C7原子中提取一個質子，并將其傳遞給DON衍生物的C8原子，以形成具有活性的中間體烯二醇。烯二醇的C3通過將C8羰基轉移至C7，并將雙鍵從C9-C10轉移到C8-C9來進行自發異構化，生成異構化產物如圖11［57］。

圖11 SPG的催化機理Fig. 11 Catalytic mechanism of SPG

盡管研究人員嘗試了將DON、3A-DON或15A-DON與SPG結晶或浸泡來獲得二元配合物，但這些嘗試并沒有成功。在文中，只對SPG/3A-DON復合物進行了建模分析，而未對DON進行分析。通過蛋白數據庫和PubChem獲取的特異乙醛化酶（ID:7VQ6）和DON（CID: 40024）的3D結構被用于進一步分析，計算結果及可視化結果如表3和圖12所示。

表3 特異乙醛化酶與DON對接最優模型結果Table 3 Results of the optimal model for the docking of specific glyoxylase with DON

圖12 特異乙醛化酶SPG與DON形成的相互作用，參與底物結合的氨基酸顯示為棒狀Fig. 12 Interaction of specific glyoxylase SPG with DON formation, amino acids involved in substrate binding shown as rods

特異乙醛化酶SPG與DON之間存在包括范德華力、氫鍵和Pi-烷基多種相互作用力，底物結合口袋由多個氨基酸殘基組成，包括R41、E44、F45、V49、L143、G144、V145、E146、K159、D160和P161。其中，G144和K159與DON形成了氫鍵。具體的氨基酸殘基與小分子之間的相互作用力可以參考圖12-B。

雖然目前尚未成功獲得SPG與DON的二元配合物的結晶結構，但通過計算和分析SPG與3A-DON的復合物，可以初步了解SPG與DON之間的相互作用模式。這有助于揭示SPG對DON的識別和降解機制，為進一步研究和應用相關生物技術提供了新思路。

3 總結與展望

研究表明，真菌毒素對人類和動物的健康構成嚴重威脅，因其化學和熱穩定性以及對食品加工條件的耐受性，能夠通過生產鏈傳播至最終產品，對人類和動物的健康造成危害。研究人員發現，真菌毒素代謝產物不僅導致動物白細胞和血清免疫球蛋白水平的改變，還會引起動物器官（如腎上腺、胸腺、胃、肝臟、脾臟和結腸）的病變，在飼料農業中，全球超過25%的糧食和飼料受到真菌毒素污染，造成高達10億美元的經濟損失［58］。

物理和化學降解方法雖能降解真菌毒素，但對糧食營養和質量有不利影響，并且難以在普通的加熱和食品加工條件下有效破壞其分子結構和降低毒性［28,59］。相比之下，酶解法作為一種可行且有效的解毒方法具有環保、高效去除毒素等優勢［60］。然而，目前酶解法在真菌毒素降解領域仍面臨挑戰。盡管已取得一定進展，但降解毒素的基因研究較少，主要是因為產真菌毒素降解酶的菌株存在生物安全隱患。因此，需要進一步研究和尋找更多安全可靠的菌株和降解酶基因。另外，不同真菌毒素需要不同的降解酶，單一的菌株或降解酶通常不能同時對多種毒素起到較好的降解效果。基因工程技術可用于將多個降解酶基因融合表達，以增強降解效果。

酶解法相對于傳統的化學和物理降解法具有環保、高效去除真菌毒素的優點，并且不會破壞飼料營養成分。因此，本文著重對產毒素降解酶的菌株以及對毒素降解酶進行了分析，得到其活性口袋氨基酸殘基，真菌毒素降解酶與毒素小分子之間的相互作用類型的結果。以上理論結果可通過實驗改造，如定點突變相關氨基酸殘基進行驗證。本文所得到的結果可通過理性設計指導改造真菌毒素降解酶氨基酸位點，以期增強毒素降解酶與毒素小分子的結合，達到更高的毒素降解效率。如Hu等［57］基于結構的蛋白質工程構建的變體SPG-Y62A對DON、3A-DON和15A-DON的催化活性提高了70%以上。同時文獻調研發現，在飼料谷物中存在被不同真菌毒素污染的情況［61］。未來的研究應加強對真菌毒素降解的酶解法的應用探索。首先，需加強對降解酶基因的研究，包括尋找更多高效降解能力和生物安全性的菌株，以及深入了解降解酶的降解機制。這將有助于提高降解效率和擴大適用范圍。其次，應進一步優化酶解法的條件和工藝，確保在實際應用中高效、經濟地去除真菌毒素。這可能涉及提高降解酶的產量、改善酶的穩定性以及優化反應條件等方面的研究。

綜上所述，酶解法在真菌毒素降解中具有巨大潛力，但仍需要進一步研究和開發，以提高降解效率、降低成本，并確保其安全和可行性。這將有助于保障食品安全和動物健康，并減少與真菌毒素相關的經濟損失。本文綜述了AFB1、ZEN、DON三種毒素危害機制，并詳細介紹了三種毒素的降解方法及降解產物，期望對后續改造、提高毒素降解酶降解毒素的效率提供參考。